基因工程重点

1、绪论一、基因的概念：基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能单位。二、基因工程的概念：基因工程是在分子水平上，提取（合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，在和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们大的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并能稳定地遗传给下一代。三、基因工程诞生理论三大发现和技术的三大发明1、理论上的三大发现（1）20世纪40年代发现了生物的遗传物质是DNA（2）20世纪50年代提出了DNA双螺旋结构（3）20世纪60年代确定了遗传信息的

2、传递方式-中心法则，提出了遗传信息流，即DNARNA蛋白质，从而在分子水平上揭示了遗传现象。2、技术上的三大发明（1）限制性核酸内切酶的发现（2）DNA连接酶的发现，1967年，发现了DNA连接酶，1970年，发现了T4噬菌体DNA连接酶。（3）基因工程载体的研究与应用，载体是特定的、具有自我复制能力的DNA分子上。在完成以上三大理论发现和三大技术发明后，基因工程诞生的条件已经成熟。1973年Cohen和Boyer的基因重组实验，分别用EcoR切割质粒pSC101 和pSC102,然后加入DNA连接酶进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上检查重组情况，同时设计一些合理的对照实

3、验。这标志着基因工程正式诞生了。四、基因工程的基本过程基因工程的基本过程（主要内容）：带有目的基因的DNA片段的分离或人工合成。限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体切开。在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子。重组DNA分子导入受体细胞（也称宿主细胞或寄主细胞）带有重组DNA分子的细胞培养，获得大量的细胞繁殖群体。筛选和鉴定转化细胞，获得外源基因高效稳定表达的细胞。重组体中目的基因的功能表达第二章 基因工程工具酶一、基因工程工具酶定义：切割DNA分子、进行DNA片段修饰和DNA片段连接等操作所需要的酶的统称。包括限制性内切酶、连接酶、聚合酶、核酸酶、碱性磷酸酶、逆

4、转录酶、修饰酶等。二、限制性核酸内切酶1、自然界中限制性核酸内切酶主要起到限制和修饰两大作用。限制作用：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。修饰作用：细菌自身的DNA特异序列的碱基被限制性核酸内切酶特异性甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。2、基因工程中，受体菌株的表型为缺少限制作用的菌株：r-m+型和 r-m-型。3、限制性核酸内切酶定义：识别双链DNA分子中的特定序列，并切割双链DNA分子内特殊核苷酸顺序的酶统称为限制性内切酶，简称限制酶。4、限制性核酸内切酶类型：主要包括三种类型，分别称为型、型、型限制性内切酶，其中基因工程中所使用的限制性内切酶主要是型的。

5、5、型限制性内切酶命名：寄主菌属名的第1个字母种名的前两个字母菌株或质粒代号空白发现序列（罗马数字）。如：EcoR表示在Escerichia coli(大肠杆菌)中抗药性R质粒上发现的第一个限制性内切酶。6、II型限制性核酸内切酶的基本特性：（一）II型限制性内切酶的识别序列：识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构。（二）II型限制性内切酶的切割方式：大部分酶的切割位点在识别序列内部，少数在两侧。根据产生末端形状两种切割方式：A、粘性末端(sticky end):限制酶在两条DNA链上的切割点不一致，切断的DNA片断的末端上含有一条多个核苷酸的单

6、链，称为粘性末端。B、平头末端(blunt end):切割点位于识别位点的中间，切断的DNA片断具有平齐的末端。（三）II型限制性内切酶不具备甲基化功能7、同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，称为完全同裂酶，有些不同，称为不完全同裂酶。8、同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。三、连接酶（Ligase)1、定义：将两段乃至数段DNA 片断拼接起来的酶称为DNA连接酶。催化实质: 催化DNA链上裂口两侧相邻核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成磷酸二酯键，使两个断裂的DNA片断连接起来。2、连接条件：（1）必须是两条双链DNA上的切口。（2）DN

7、A 3 端有游离的-OH，5端有游离的磷酸基团。（3）需要能源，动物或噬菌体细胞中连接酶需要ATP，大肠杆菌等细菌中连接酶需要NAD+。3、种类： T4 噬菌体DNA连接酶（T4 DNA连接酶）：需要ATP，能连接粘性末端DNA和一条链带切口的双链DNA分子，也能连接平末端。（2）大肠杆菌连接酶：需要NAD+，只能连接粘性末端DNA和一条链带切口的双链DNA/*-/*-分子，不能连接平末端。 T4 噬菌体RNA连接酶：T4 噬菌体基因63编码的产物，需要ATP，催化单链DNA或RNA的5磷酸与相邻的3羟基共价连接。四、DNA聚合酶1、定义：DNA聚合酶（ DNA polymerase）能在引物

8、和模板的存在下，把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。2、分类：DNA聚合酶分类（根据模板）：依赖DNA的聚合酶和依赖RNA的DNA聚合酶3、基因工程中常用的DNA聚合酶：1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶 5）修饰过的T7 DNA聚合酶（测序酶） 6）逆转录酶7）Taq DNA聚合酶4、大肠杆菌DNA聚合酶I：基本性质：53的DNA聚合酶活性；53的核酸外切酶活性，切割双链DNA或DNA:RNA；35的核酸外切酶活性，切割单链或双链DNA分子。基本用途：缺口前移，探针的标记

9、 探针：能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的一段核酸分子。探针的标记：让寡聚核酸分子带有标记物（如同位素标记物和非同位素标记物）。5、Klenow酶：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。基本性质：53的DNA聚合酶活性；35的核酸外切酶活性基本用途：补平由核酸内切酶产生的5粘性末端；DNA片段的同位素末端标记；cDNA第二链的合成；双脱氧末端终止法测定DNA序列。基本性质：53的DNA聚合酶活性和35的核酸外切酶活性；在无dNTP时，可以从任何3-OH端外切；在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在四种dNTP均存在时，聚合活

10、性占主导地位。基本用途：（A）切平由核酸内切酶产生的3粘性末端；（B）DNA片段的同位素末端标记。7、反转录酶： 基本性质：依赖于RNA的DNA聚合酶；RNA酶H活性，能从5或3方向双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链。基本用途：以mRNA为模板合成cDNA。8、Taq DNA聚合酶：基本性质：分离自极度嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus中，最适反应温度75， 对95高温具良好稳定性，需Mg2+。基本用途：主要用于DNA的体外扩增（聚合酶链式反应，即PCR）。5、末端脱氧核苷酰转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase ，TdT）：简

11、称末端转移酶基本性质：不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。基本用途：给载体和外源DNA分别加上同聚体尾巴，以便两者在体外连接；进行DNA的3-OH末端标记。6、核酸酶：定义：一类能降解核酸的水解酶。分类：只作用于RNA的叫做核糖核酸酶；只作用于DNA的叫做脱氧核糖核酸酶；既作用于RNA又可作用于DNA的叫做核酸酶。核糖核酸酶A：特点：低盐（0-100mmol/L NaCl）时，切割单链和双链RNA、DNA:RNA杂交体中的RNA；高盐（300mmol/L NaCl）时，特异性切割单链RNA。基本用途：用于除去DNA样品中的RNA分子或出去杂交双链中的RNA。核糖核酸酶H：特点：特异性

12、作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链；基本用途：与大肠杆菌DNA聚合酶和DNA连接酶一起参与cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。脱氧核糖核酸酶I ：特点：具内切酶活性，作用于单链或双链DNA，但无核苷酸序列特异性。当酶浓度很低时，双链DNA分子上将形成切口，但不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有不同影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关；Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置。基本用途：1)与大肠杆菌DNA聚合酶切口移位，制备DNA探针； 2) 制备RNA样品时除去DNA分子；3) 基因突变时产生切口。S1核酸酶：基本特性：降解单链DNA的速度比降

13、解双链DNA快75000倍。Zn2+必需；最适pH范围为4.0 - 4.3；需要NaCl 10 - 300 mM；降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍。7、碱性磷酸酶：基本用途：（1）5末端标记前的处理。（2）去除DNA片断的5 磷酸基团，防止自身连接。第三章 基因工程载体1、基因工程载体（载体）的定义：基因工程中能携带外源基因进入受体细胞的运载工具称为基因工程载体（vector）功能：运送外源基因高效转入受体细胞；为外源基因提供复制能力或整合能力；为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。应具备的条件：具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性；具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；具有较高

14、的外源DNA的载装能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点（MCS）；具有合适的筛选标记。2、质粒载体基因工程中的质粒载体，主要是以细菌质粒的各种元件为基础组建而成：复制必需区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点）。质粒的一般生物学特性：分子特性：三种不同的构型：闭合环状DNA（closed circle DNA, ccDNA ）,通常呈超螺旋构型（supercoil），即SC构型。开环DNA（open circle DNA,ocDNA）即为OC构型。线性DNA（liner DNA, lDNA）,即L构型。自主复制性：质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，质粒DNA

15、上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系，根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型，严紧型复制控制的质粒（1 - 3 拷贝）和松弛型复制控制的质粒（10 - 200 拷贝）。不相容性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一个宿主细胞系中稳定的共存的现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群（不亲合群）。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中

16、只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。可转移性：质粒的转移性是指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。根据质粒是否携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，可将质粒分为接合型(conjugative)和非接合型（nonconjugeative）。接合型质粒:能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F质粒等。非接合型质粒:不能在天然条件下独立地发生接合作用，如ColE1。质粒的迁移作用:如果在宿主细胞中存在一种相容的非接合型质粒，那么它也通常会被转移。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移，叫做质粒的迁移作用。携带特殊的遗传标记

17、：物质抗性：如抗生素、重金属离子、有机物等；物质合成：如细菌毒素、有机碱。理想质粒载体的必备条件：具有较小的分子量和较高的拷贝数；具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（）；具有两种以上的选择性标记基因；缺失mob基因；插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。常用的质粒载体类型（各类型定义）：克隆质粒载体：是指专用于基因或DNA片断无性繁殖的质粒载体。表达质粒载体：是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。多功能质粒载体：这类载体具有多种功能，它可以根据需要进行基因克隆、转录、测序、表达等方面的基因操作。穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）是指一

18、类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可以在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。通常在原核细胞和真核细胞中穿梭。 （1）克隆质粒载体pBR322（会分析质粒图谱）pBR322特征：分子量较小具有两种选择标记：Ampr和Tetr多克隆位点（mutiple cloning sites, MCS) 松弛型复制拷贝数 50 - 100 / cell。质粒载体pBR322的应用：将外源DNA片断在BamH、Sal或Pst位点插入（插入其中一个抗生素抗性基因之中），筛选：Tetr/Amps 或Tets/Ampr（2）质粒载体pUC18/19（会分析质粒图谱）特征：pBR322的复制起始位点；

19、Ampr；选择颜色标记 lacZ；装有多克隆位点（MCS）；拷贝数 2000 3000 / cell。3、噬菌体载体- DNA载体的构建：1、缩短长度；2、删除重复的酶切位点；3、加装选择标记。噬菌体载体：特点-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；-DNA载体的装载能力为20 kb左右，远远大于质粒的装载量；重组-DNA分子的筛选较为方便；重组-DNA分子的提取较为简便； -DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。4、柯斯质粒：是一种带有黏性末端位点的质粒，又称黏粒质粒。构建：是一种以l噬菌体为基础为克隆大片段而设计并和质粒共同构建的杂合载体，具有噬菌体的

20、COS位点和质粒的复制子，具有噬菌体和质粒的双重特征。柯斯质粒载体的特征：（1）具有l噬菌体的特点：具有COS位点，体外包装成噬菌体颗粒环化，高效感染宿主。（2）具有质粒载体的特点:在寄主内复制和具抗生素抗性基因。（3）克隆能力强：40-50KB5、人工染色体（定义）：将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。第四章 核酸操作的基本技术1、核酸提取技术制取核酸样品的基本要求：保持核酸的完整性，即保持天然状态。A 防止核酸酶对核酸的降解；B 防止化学因素和物理因素引起核酸变性或破坏。提取核酸的三个步骤：（1）细胞破碎；（2）除去与核酸结合的蛋白质

21、及多糖脂等杂质；（3）除去其他杂质核酸。 (一)基因组DNA提取：（1）CTAB十六烷基三乙基溴化铵法提取原理：CTAB溶解细胞膜、与核酸形成复合物，高盐溶液（0.7mol/LNaCl）中可溶，降低溶液盐浓度，低盐溶液（0.3mol/LNaCl）从溶液中沉淀，离心，CTAB与核酸复合物沉淀(与蛋白等物质分离，高盐溶液，复合物溶解，加入乙醇，核酸沉淀(CTAB溶于乙醇)，从而将核酸和CTAB分离，核酸得到纯化（2）SDS法十二烷基磺酸钠法提取原理：SDS（十二烷基磺酸钠）在较高温度（55-65）条件下裂解细胞、染色体离析、蛋白质变性、释放出核酸，提高盐浓度、降低温度，蛋白质、多糖沉淀，离心，得上

22、清液，反复抽提去除蛋白质，乙醇沉淀核酸，核酸得到纯化。(二)质粒提取方法：碱裂解法、煮沸法、 SDS法等碱裂解法提取原理：是基于DNA的变性和复性差异而分离的。碱性条件使DNA变性，再将pH值调到中性，则质粒DNA能够正确复性并溶解于水中，而染色体DNA不能复性，缠结成网状物质，通过离心除去。(三)RNA提取：常采用TRIZOL法，TRIZOL法提取总RNA的原理：TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层

23、，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 2、核酸的检测与保存：检测DNA/RNA的相对完整性方法：琼脂糖凝胶电泳DNA/RNA的质量鉴定方法：DNA/RNA的纯度：测紫外吸收值，OD值吸收峰： DNA/RNA 紫外光260nm 蛋白质 紫外光280nm比值： OD260/280 = 1.8-2.0 较纯 OD260/280 < 1.8-2.0 杂质多DNA浓度(µg/ml)=OD260值×50g/mL×稀释倍数 RNA浓度(µg/ml)=OD260值×40g/m

24、L×稀释倍数 单链DNA 1 OD = 40 g/ml双链DNA 1 OD = 50 g/ml 3、凝胶电泳技术电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳。凝胶电泳分离核酸分子的原理：在碱性环境下，核酸分子带负电荷，在外加电场的作用下，分子在凝胶滤孔中从负极向正极泳动，其中主要由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同大小核酸分子的目的。分类：常用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳；琼脂糖：一种从红色海藻产物琼脂中提取的线性多糖聚合物。加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂亚甲基双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵的催化下形成。琼脂糖凝胶电泳特点：操作简

25、单；分辨范围：100bp-60kb；有效范围：200bp-50kb；分辨率：100bp左右。聚丙烯酰胺凝胶电泳特点：常用于微卫星、测序分析；分辨范围：5-500bp；分辨率：1bp。单体有神经毒性。电泳指示剂：常用溴酚蓝或二甲苯腈。电泳指示剂作用：(1) 预知电泳的速率及方向；(2) 使样品呈现颜色，便于加样。DNA染色剂：常用(1)荧光染色剂，溴化已锭（ EB, Ethidium bromid）；染色后紫外光下发白光； (2)硝酸银（常用于聚丙烯酰胺凝胶的染色）：常用0.1%；(3)Goldview染料：吸收紫外光，放出绿光（双链DNA）或橙红色光（单链DNA）。凝胶电泳过程：制胶：称取一定

26、量的琼脂糖用电泳缓冲液融解后倒入制胶槽配制；放胶：胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至没过胶23mm,点样：把DNA样品加入上样缓冲液混匀上样电泳：接通电源，调好电压看结果：紫外光观察。4、核酸杂交技术核酸杂交定义：互补的核苷酸序列通过Waltson -Crick碱基配对形成稳定的杂合双链DNA分子、DNA-RNA分子的过程称为杂交 。主要类型及特点：Southern杂交，探针：DNA，被检测对象：DNA；Northern杂交，探针：DNA，被检测对象：RNA；Western杂交, 探针：抗体，被检测对象：抗原；菌落原位杂交，探针：DNA，被检测对象：DNA。杂交三要素：1、探针（DNA、RNA或抗

27、体）；2、被检测的对象（DNA、RNA或蛋白质）3、杂交膜:硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman 541滤纸等。探针定义：探针是指经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。探针分类：按核酸分子的不同可分为DNA探针和RNA探针；根据标记物的不同：可分放射性标记探针和非放射性标记探针。标记方法：放射性同位素32P、35S标记核酸探针：A、切口平移法B、随机引物合成法。放射性同位素标记方法优点：灵敏度高；特异性高；方法成熟简便。放射性同位素标记方法缺点：半衰期短，需要经常标记探针；费用高；放射自显影的时间长；放射性同位素对人体有害、实验室和环境容易被污染放射性废物处理困难。非

28、放射性标记-化学标记法：包括生物素、地高辛、荧光素、辣根过氧化物酶标记等第五章 PCR技术PCR（polymerase chain reaction）定义:聚合酶链式反应PCR又称体外扩增技术，指在DNA变性温度下，DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增的技术。聚合酶链式反应PCR扩增原理：加热或其他理化因素作用可以使DNA双螺旋氢键断裂，空间结构破坏，DNA双链解开成两条单链的DNA，这称

29、为DNA的变性（Denature）。解除变性条件之后，变性的核酸重新通过碱基配对缔合成为双螺旋结构的过程称为复性（Renature）,若变性条件为加热，则复性的冷却过程称为退火（Annealing）。PCR反应过程：变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增。PCR每个反应三步: 1、变性，膜板DNA置于95，双链DNA的双链解开变成单链DNA；2、退火，将反应体系的温度降到55左

30、右，使得一对引物能分别与变性后的两条膜板链相配对；3、延伸，将反应体系温度调整到TagDNA聚合酶作用的最适温度72，以目的基因为膜板，合成新的DNA链。十二字反应过程：高温变性、低温退火、中温延伸。PCR反应体系：体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定性)、 dNTP、反应缓冲液（Mg2+、 BSA、Tween20、DTT 、 Tris.HCl ） 。PCR反应条件：变性温度和时间：变性温度要求变性彻底，但要考虑聚合酶的半衰期：92.5 （2小时）94 （40min）97 （5min），常采用94，变性比较彻底，酶的半衰期也较长。引物退火温度与时间：引物（primer），是一小段单链D

31、NA或RNA，作为DNA复制的起始点，引物退火温度和所需时间主要取决于引物的长度、浓度和碱基组成；退火温度与解链温度Tm的关系：低五度；退火温度一般在55-72；引物G+C含量高、长度较长并与模板完全匹配时，应提高退火温度；时间一般为30秒到60秒。延伸温度与时间：与聚合酶有关，Taq酶72最佳，也有用68 如La Taq酶。扩增时间多采用1min。循环数：25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增增加及平台效应。平台效应指 PCR循环后期，合成的产物达0.3-1pmol时，由于产物的堆积，使原来以指数增加的速率变成平坦曲线，扩增产物不再随循环次数明显上升。PCR技术的特点：高度的灵敏性

32、；特异性；操作简便易行。PCR种类反向PCR(Inverse PCR)：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。反转录PCR（Reverse transcription PCR, RT-PCR）：将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。兼并引物PCR技术：简并引物的出现是由于遗传密码具有简

33、并性，根据氨基酸的保守序列反推到DNA 水平设计引物。由于大多数氨基酸的遗传密码不止一种，所以引物的部分碱基不能确定。可以根据各种不同的遗传密码规律设定DNA和氨基酸之间的相互转换，这样设计出来的引物是将可能编码一个给定氨基酸序列的核苷酸组合，是多种序列的混合物，序列的大部分是相同的，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。第六章 DNA文库的构建和目的基因的筛选1、基因文库定义：又称DNA文库，是指某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。文库组成：由外源DN

34、A片段、载体和宿主组成。2、基因组DNA文库：是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。构建基本程序：高纯度基因组DNA的提取;高纯度基因组DNA的部分酶切;载体DNA的制备，包括扩增、酶切、去磷酸化；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；重组克隆的挑选和保存。3基因组DNA文库的质量标准一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：重组克隆的总数适宜，既要覆盖整个基因组，又不能太多，以减轻筛选工作的压力。载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔

35、克隆。克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序。重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系，可用下式表示：N = ln ( 1 P ) / ln ( 1 f )其中： P = 任一基因存在于基因文库中的概率 f = 克隆片段的平均大小 / 生物基因组的大小 4、cDNA文库：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。构建基本程序：细胞总RNA的提取和mRNA的分离；第一条cDNA合成；第二条c

36、DNA合成；双链cDNA与质粒或噬菌体等载体连接并导入宿主中繁殖。5、基因组DNA文库与cDNA文库的比较：cDNA克隆只反映mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，而基因组文库包括基因的间隔序列。 cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；而基因组文库不反应基因的转录和表达状态。 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能，而基因组文库能够得到。6、目的基因的获得：未知核酸序列基因

37、的获得方法：基因文库中筛选；PCR法已知核酸序列基因的获得方法：化学合成法； PCR法第七章 DNA体外重组与基因转移1、DNA分子体外重组技术：外源DNA片段同载体分子在体外连接的方法，即DNA分子体外重组技术。需要的工具酶主要是核酸限制性内切酶和DNA连接酶。2、根据所用内切酶酶切后是否形成黏性末端，目的基因与载体的连接可分为:黏性末端DNA片段的连接；非互补的黏性末端或平端DNA 片段的连接。黏性末端DNA片段的连接，根据酶切时使用一种或两种不同限制性内切酶消化外源DNA和载体，黏性末端DNA片段的连接方法分为插入式（单酶切）和取代式（双酶切）两种。插入式（单酶切）即单一内切酶酶切后体外

38、连接。缺点：载体易自身环化；不能定向插入；大片段的DNA重组率低；容易多个外源片段或载体连接；增加筛选工作的难度。取代式（双酶切）可实现定向克隆，因此又称为定向克隆技术，是两种不同内切酶分别酶切目的基因和载体后体外连接。非互补的黏性末端或平端DNA 片段的连接：非互补的黏性末端DNA片段，利用单链特异性的S1核酸酶/Klenow大片段聚合酶除去黏性末端成为平末端DNA片段。平端DNA片段高效连接方法：1、同聚物加尾法；2、人工接头连接法；连接反应的效率称为重组率，提高重组率的方法包括：合理正确地配比外源DNA片段与载体的分子比：5 :1 10 : 1 ；载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团 ；

39、加装同聚尾末端；根据不同的反应类型控制合理的反应温度和时间，可以大幅度提高转化子数量。3、受体细胞：又称宿主细胞或基因表达系统，指能够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。受体细胞应具备的条件：限制性内切酶缺陷型；核酸外切酶和内切酶活性缺陷 （recB-，recC-，hsdR-） ；具有较高的转化效率；具有与载体选择标记互补的表型；感染寄生缺陷型。4、转化：原核细胞的转化就是以质粒为载体的重组DNA分子进入受体细胞的过程。转化包括制备感受态细胞和转化处理。Ca2+诱导的细菌细胞的转化原理：Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成

40、液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。5、转染：以噬菌体DNA为载体构建的重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞的过程即为转染过程。包括感受态细胞的培养、吸附、转染裂解。6、高压电穿孔转化：将待转化的质粒或DNA重组连接液和受体细胞加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，受体细胞的细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。影响因素：脉冲的电场强度、电脉冲频率、受体细胞的类型 。第八章 重组子的筛选与鉴定1、转化子：转化子：就是导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其它受体细胞。根据

41、转化子中的外源DNA类型，又包括:重组子、非重组子、目的重组子与非目的重组子等。2、重组体筛选和鉴定方法：筛选方法的选择与设计可依据载体、受体和外源基因三者的不同遗传与分子生物学特性来进行。3各种筛选方法原理和步骤（掌握3种以上）：菌落噬菌斑原位杂交法，菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。菌落原位杂交法的基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板，用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜，用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜，80烘干固定影印薄膜，薄膜置于

42、含有探针的杂交溶液中保温，用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜，用X光胶片覆盖薄膜感光，根据感光结果，对照原菌落平板，找出克隆子。抗药性筛选法，抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子，如利用pBR322载体，将外源DNA片段插在抗四环素BamH I位点，抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板；再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上，在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子。营养缺陷型筛选法，基本原理：营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞（宿主细胞）

43、本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。显色筛选法，基本原理：显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选。限制性酶切图谱法，所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。通过测定酶活性筛选，若目的基因所编码的蛋白有特定的活性，则可以通过测定有无酶活性鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。免疫化学检测法，包括放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、Western印迹分析法等，均根据抗体抗原原理检测转化子中目的基因是否转录翻译成目的蛋白。核酸序列分析法，包括核酸序列分析、PCR法、Northern印迹分析等方法，核酸序列分析法直接测定核酸序列，DNA分子中A、T、C、G的排列顺序，与目的基因的序列比较，PCR法以转化子裂解液或从转化子中提取载体作为模板进行PCR，所得片段与目的基因比对，Northern印迹分析检测转化子中