抗菌药物筛选的实验方法与技术教案课件

1、抗菌药物筛选的实验方法与技术教案1综合化学实验综合化学实验-化学生物学专题实验化学生物学专题实验 指指导教师导教师：马马林，蔡小玲林，蔡小玲 化化学与学与化化学学工程工程学学院院抗菌药物筛选抗菌药物筛选的实验方法与的实验方法与技术技术 抗菌药物筛选的实验方法与技术教案2 一个新的化合物或分离提取有效成分是否有抗菌作用，需一个新的化合物或分离提取有效成分是否有抗菌作用，需要药理实验来证实，首先采用体外实验方法，观察试验物要药理实验来证实，首先采用体外实验方法，观察试验物对细菌有无杀灭作用或抑制作用，体外实验的重要性在于对细菌有无杀灭作用或抑制作用，体外实验的重要性在于方法简便，用药量少，短时间内

2、能判断药物抗菌的广度和方法简便，用药量少，短时间内能判断药物抗菌的广度和强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。强度，为深入体外实验和体内药效研究提供数据。 体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。体外实验是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系药物对细菌代谢的影响、可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以统受到抑制等，因而出现细菌不生长或部分抑制，可借以判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。体外实验是判断药物对细菌有无抗菌作用，或抗菌范围。体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素

3、参与，故体外和体细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。价。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案3一、实验目的一、实验目的1，掌握培养基的制备、，掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌、菌种培高压蒸气灭菌、菌种培养、接种等微生物培养养、接种等微生物培养技术；技术；2，掌握化合物抗菌、抑，掌握化合物抗菌、抑菌活性筛选技术；菌活性筛选技术；3，掌握微孔板法、抑菌，掌握微孔板法、抑菌圈法抗菌最小浓度测试圈法抗菌最小浓度测试等基本操作技术。等基本操作技术。4，学会使用各种仪器设，学会使用各种仪器设备备

4、 。实验中使用的仪器设备：实验中使用的仪器设备：1，手提式高压蒸汽灭菌锅；，手提式高压蒸汽灭菌锅；2，超净工作台；，超净工作台；3，各种移液器；，各种移液器；4，细菌恒温培养箱；，细菌恒温培养箱；5，微生物培养摇床；，微生物培养摇床；6，酶标仪；，酶标仪；抗菌药物筛选的实验方法与技术教案4二、微生物培养基的配制、灭菌与培养二、微生物培养基的配制、灭菌与培养培养基是指利用人工方法将适培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖成积累代谢合微生物生长繁殖成积累代谢产物的各种营养物质混合配制产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。主要用于微而成的营养基质。主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及生物的分

5、离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。菌种保藏等方面。培养基一般应含有微生物生长培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等源、无机盐、生长因子和水等营养成分。营养成分。此外，为了满有微生物生长繁此外，为了满有微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的必须控制培养基的phph。培养基可分为天然培养基、合成培培养基可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。养基和半合成培养基。按培养基的物理状态，可将培养基按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和分为固体培养基、半固体培养基和液体培养

6、基。液体培养基。固体培养基是指在液体培养基中加固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂入一定量的凝固剂( (常加常加1.5%-2%1.5%-2%的的琼脂琼脂) )经融化冷凝而成。经融化冷凝而成。半固体培养这是指在液体培养基中半固体培养这是指在液体培养基中加入加入0.80.8-1-1左右的琼脂，经融左右的琼脂，经融化冷凝而成。化冷凝而成。液体培养基是指培养基中不加凝固液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。剂琼脂，培养基呈液体状态。 抗菌药物筛选的实验方法与技术教案5（一）基本原理（一）基本原理 正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验正确掌握培养基的配制方法是从事微生物

7、学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。多，它们的配方及配制方法虽各有差异。 但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等基本养基的灭菌，斜面与平板的制作以及接菌等基本环节大致相同。环节大致相同。 抗菌药物筛选的实验方法与技术教案6（二）实验过程（二）实验过程1 1，

8、液体及固体培养基的配制过，液体及固体培养基的配制过程程 一般培养基的组成一般培养基的组成 牛肉膏牛肉膏 0.5g0.5g蛋白胨蛋白胨 1g1g nacl 0.5g nacl 0.5g 琼脂琼脂 1.5-2g1.5-2g水水 100ml100mlph 7.2 ph 7.2 液体培养基不加琼脂即可。液体培养基不加琼脂即可。(1)(1)称量及溶化称量及溶化 分别称取蛋白胨、分别称取蛋白胨、naclnacl、牛肉膏置于另一小烧杯中，进、牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化。杯中，加热融化。(2)(2)调调ph ph 待溶液冷至室温时，

9、用待溶液冷至室温时，用0.1mol/l naoh0.1mol/l naoh溶液调溶液调phph至至7.27.2。(3)(3)定容定容 将溶液倒入量筒中，补充将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。水量至所需体积。(4)(4)固体培养基加入所需量的琼脂，固体培养基加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。加热融化，补充失水。(5)(5)分装、加塞、包扎。分装、加塞、包扎。(6)(6)高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌100 pa100 pa灭菌灭菌20 min20 min抗菌药物筛选的实验方法与技术教案72 2，培养基的分装，培养基的分装液体培养基装入试管培养液体培养基装入试管培养基的量视试管大小及需要基的量视

10、试管大小及需要而定，若所用试管大小为而定，若所用试管大小为1515150 mm150 mm时，液体培养时，液体培养基可分装至试管高度基可分装至试管高度1/41/4左右为宜（约左右为宜（约5ml5ml）；）；分装团体培养基时，在琼分装团体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分脂完全融化后，应趁热分装于试管中分装量为管高装于试管中分装量为管高1/5(1/5(约约4-5ml)4-5ml)。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案83 3，棉塞的制作及试管、锥形瓶，棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎的包扎 （1 1）试管棉塞的制作）试管棉塞的制作 制棉塞时，应选用大小、制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一快，

11、铺厚薄适中的普通棉花一快，铺展于左手拇指和食指如成的圆展于左手拇指和食指如成的圆孔上，用右手食指将棉花从中孔上，用右手食指将棉花从中央压入团孔中制成棉塞，然后央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。直接压入试管或锥形瓶口。 将装好培养基并塞好棉塞或盖将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成好管帽的试管捆成捆，外面捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌培养基名称及配制日期。灭菌待用。待用。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案94 4，培养基的灭菌培养基的灭菌 高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及

12、外科手术器械等方面最常用的生产、以及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法。一种灭菌方法。 （1 1）打开灭菌锅盖，加适量水；）打开灭菌锅盖，加适量水；（2 2）将待灭菌物品放入灭菌桶内。（）将待灭菌物品放入灭菌桶内。（3 3）将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，加盖，将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，加盖，上下螺栓口对齐，均匀旋紧螺栓，使锅密上下螺栓口对齐，均匀旋紧螺栓，使锅密闭。闭。（4 4）打开放汽阀，加热，自锅内开始产）打开放汽阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后再关紧放汽阀，待压力逐渐上升生蒸汽后再关紧放汽阀，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温

13、度，并开始计时和温度，并开始计时20 min20 min后停止加热。后停止加热。（5 5）待压力降至接近）待压力降至接近0 0时，慢慢打开放汽时，慢慢打开放汽阀阀( (排汽口排汽口) )，开盖，立即取出灭菌物品。，开盖，立即取出灭菌物品。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案105 5，斜面和平板的制作，斜面和平板的制作 将巳灭菌装有琼脂培养基将巳灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后，使成适当斜度，凝固后即成斜面即成斜面( (图图1-3)1-3)斜面长斜面长度不超过试管长度度不超过试管长度1/21/2为为宜。宜。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案11平板

14、的制作平板的制作 抗菌药物筛选的实验方法与技术教案126 6，斜面培养基接种，斜面培养基接种 斜面培养基接种法斜面培养基接种法一般不用作分离培一般不用作分离培养，仅使细菌繁殖养，仅使细菌繁殖为菌种传代或观察为菌种传代或观察其某些生化特性之其某些生化特性之用。用。 (1)(1)接种灭菌接种灭菌 (2)(2)开开启棉塞启棉塞 (3)(3)管口灭管口灭菌菌 (4)(4)挑起菌苔挑起菌苔 (5)(5)接种接种 (6)(6)塞好棉塞好棉塞。塞。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案137 7，液液体体培培养养基基接接种种法法抗菌药物筛选的实验方法与技术教案14三、微量稀释法体外抗菌实验三、微量稀释法体外抗菌实

15、验 连续稀释法（试管稀释法）通常用于测定微生物连续稀释法（试管稀释法）通常用于测定微生物的最小抑菌浓度（的最小抑菌浓度（micmic），即将微生物的浓度按），即将微生物的浓度按几何级数或数学级数进行递减稀释，然后将不同几何级数或数学级数进行递减稀释，然后将不同浓度的微生物混入含试验菌的液体培养基或固体浓度的微生物混入含试验菌的液体培养基或固体培养基中，经培养后，能抑制试验菌生长的最低培养基中，经培养后，能抑制试验菌生长的最低浓度，即为该微生物的最小抑菌浓度。浓度，即为该微生物的最小抑菌浓度。 微量稀释法微量稀释法 此种方法常用于测定细菌对药物敏此种方法常用于测定细菌对药物敏感性或新药对细菌的抗

16、菌活性试验。一般应用感性或新药对细菌的抗菌活性试验。一般应用9696孔微量稀释板，孔底呈孔微量稀释板，孔底呈u u型，每孔容量为型，每孔容量为0.20-0.20-0.30ml0.30ml。本法操作较便，用培养基量少，可作大。本法操作较便，用培养基量少，可作大批量药敏试验。批量药敏试验。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案15( (一）实验过程一）实验过程（1 1）实验菌的准备。）实验菌的准备。选取大肠杆菌选取大肠杆菌(escherichia c o l i ) 、 金 黄 色 葡 萄 球 菌、 金 黄 色 葡 萄 球 菌( (staphylicoccus aureus) )、白、白色葡萄球菌色葡萄

17、球菌( (staphylococcus albus) )、蜡状芽孢杆菌菌种、蜡状芽孢杆菌菌种在营养琼脂斜面培养基上传在营养琼脂斜面培养基上传代培养一次后，再将其接种代培养一次后，再将其接种至营养肉汤培养基中至营养肉汤培养基中3737培培养养6-12 h6-12 h，冰箱备用。，冰箱备用。（2 2）抗菌化合物的初步筛）抗菌化合物的初步筛选，按下表取选，按下表取9696孔培养板孔培养板一块，进行编号，将一块，进行编号，将4444种种化合物（由有机化学研究化合物（由有机化学研究所其他教师和研究生提供）所其他教师和研究生提供）用用dmsodmso或蒸馏水配制成或蒸馏水配制成5050 mol/mlmol

18、/ml，（也可用无菌，（也可用无菌过滤器过滤后）放置在灭过滤器过滤后）放置在灭菌的小离心管中。菌的小离心管中。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案16筛选实验过程筛选实验过程（3 3）在超净工作台内，酒精灯下）在超净工作台内，酒精灯下，将液体培养的细菌菌种用培养液，将液体培养的细菌菌种用培养液进行稀释，稀释度为进行稀释，稀释度为1 1：10001000或或1:5001:500。用无菌的移液器（吸咀经。用无菌的移液器（吸咀经过灭菌处理）将稀释的液体菌种过灭菌处理）将稀释的液体菌种198198 l l加入到除了加入到除了a1,b1a1,b1以外的孔内以外的孔内，2 2 l l各种化合物溶液（各种化合物

19、溶液（dmsodmso配置配置），），a1,b1,c1,d1a1,b1,c1,d1加加200 200 l l培养液培养液，震荡混合后，震荡混合后3737培养培养12h-18h, 12h-18h, 用酶标仪用酶标仪630nm630nm侧吸光度。侧吸光度。dmsodmso的的最终浓度保持在最终浓度保持在1%1%。每个样品设两。每个样品设两个平行孔。个平行孔。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案1796孔细胞培养板加样安排孔细胞培养板加样安排1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212a a培养液培养液200200 l l样品样品1 12 23 34 45 56 67

20、78 89 910101111b b培养液培养液200200 l l样品样品1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111c c培养液培养液200200 l l样品样品12121313141415151616171718181919202021212222d d培养液培养液200200 l l样品样品12121313141415151616171718181919202021212222e e菌对照菌对照(2(2 l dmso)l dmso)样品样品23232424252526262727282829293030313132323333f f菌对照菌对照(2(2 l d

21、mso)l dmso)样品样品23232424252526262727282829293030313132323333g g菌对照菌对照(2(2 l dmso)l dmso)样品样品34343535363637373838393940404141424243434444h h菌对照菌对照(2(2 l dmso)l dmso)样品样品34343535363637373838393940404141424243434444样品浓度样品浓度0.02mmol/ml 0.02mmol/ml 样品分子量样品分子量/100.mg /100.mg 用用dmsodmso配成配成0.5ml0.5ml即可，每即可，

22、每次实验用次实验用2 2 l l，9696孔板的孔体积孔板的孔体积200200 l l，样品的最终浓度为，样品的最终浓度为200200 mol/lmol/l，大，大于该浓度则无价值。于该浓度则无价值。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案18试验用样品试验用样品环丙沙星环丙沙星 2 2 ,4,4 ,3-,3-三羟基二苯甲酮三羟基二苯甲酮 2,4,42,4,4 - -三羟基二苯甲酮三羟基二苯甲酮 2,4,22,4,2 - -三羟基二苯甲酮三羟基二苯甲酮 2,3,4,22,3,4,2 - -四羟基二苯甲酮四羟基二苯甲酮 2,3,4,32,3,4,3 - -四羟基二苯甲酮四羟基二苯甲酮 2,3,4,42,

23、3,4,4 - -四羟基二苯甲酮四羟基二苯甲酮 2,4,22,4,2 ,4,4 - -四羟基二苯甲酮四羟基二苯甲酮 2,3,4,22,3,4,2 ,4,4 - -五羟基二苯甲酮五羟基二苯甲酮 丹皮酚丹皮酚 丹皮酚丹皮酚- -镍（镍（iiii）配合物）配合物 丹皮酚丹皮酚- -氧钒（氧钒（v v）配合物）配合物 丹皮酚丹皮酚- -铜（铜（iiii）配合物）配合物 丹皮酚丹皮酚- -钴（钴（iiii）配合物）配合物 丹皮酚丹皮酚- -锰（锰（iiii）配合物）配合物 丹皮酚丹皮酚- -锌（锌（iiii）配合物）配合物 苯甲基苯甲基-n-n-苯基亚胺苯基亚胺 3-3-羟基苯甲基羟基苯甲基-n-n-苯

24、基亚胺苯基亚胺 4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺 2-2-羟基苯甲基羟基苯甲基-n-3,5-n-3,5-二苯基亚胺二苯基亚胺 3,4-3,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-n-苯基亚胺苯基亚胺 4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-n-3,4-n-3,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺 23. 4-23. 4-羟基羟基-3-3-甲氧基甲氧基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺24. 24. 苯甲基苯甲基-n-4-n-4-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺 3,4-3,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基亚

25、胺二甲氧基苯基亚胺4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-n-4-n-4-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺3,5-3,5-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-3,4-n-3,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺2,5-2,5-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-4-n-4-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺 2,4-2,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-4-n-4-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺 2,4-2,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-n-3-n-3-羟基苯基亚胺羟基苯基亚胺3,5-3,5-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-2,4-n-2,4-二甲氧基苯基

26、亚胺二甲氧基苯基亚胺 4-4-羟基羟基-3-3-甲氧基甲氧基-n-3,4-n-3,4-二甲氧基苯基亚胺二甲氧基苯基亚胺 4-4-羟基苯甲基羟基苯甲基-n-4-n-4-甲基苯基亚胺甲基苯基亚胺 4-4-羟基羟基-3-3-甲氧基苯甲基甲氧基苯甲基-n-4-n-4-甲基苯基亚胺甲基苯基亚胺 3,5-3,5-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-4-n-4-甲基苯基亚胺甲基苯基亚胺 2,4-2,4-二羟基苯甲基二羟基苯甲基-n-4-n-4-甲基苯基亚胺甲基苯基亚胺 4-4-磺酸基磺酸基-3-3 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯4-4-磺酸基磺酸基-2-2 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯4-4

27、-硝基硝基-3-3 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯4-4-硝基硝基-2-2 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯4-4-硝基硝基-2-2 ,5,5 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯4-4-溴溴-3-3 ,4,4 - -二羟基偶氮苯二羟基偶氮苯 对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸甲酯 抗菌药物筛选的实验方法与技术教案19筛选数据分析筛选数据分析 测试的样品中，测试的样品中，1 1号样为号样为市场上临床使用的环丙沙市场上临床使用的环丙沙星，浓度为星，浓度为0.005mmol/l0.005mmol/l。 其 他 样 品 浓 度 为。 其 他 样 品 浓 度 为0.02mmol/l0.02mmo

28、l/l。 实验中，以培养基为空实验中，以培养基为空白白0%0%，以带菌培养液为对，以带菌培养液为对照照100%100%。如果酶标仪如果酶标仪630nm630nm测试的结果中，测试的结果中，空白为空白为-0.2-0.2，空内液体呈透明清，空内液体呈透明清澈，对照孔的值为澈，对照孔的值为+0.1-0+0.1-0.2 2。如果测试样品的值也同样达到如果测试样品的值也同样达到- -0.20.2，表明样品在，表明样品在200200 mol/lmol/l具有具有较好的抗菌活性。较好的抗菌活性。如果测试样品的值在对照孔和空如果测试样品的值在对照孔和空白之间，表明样品在高浓度有抗白之间，表明样品在高浓度有抗菌

29、作用，请选取菌作用，请选取1111个抗菌效果较个抗菌效果较好的样品做下面的最小抑菌浓度好的样品做下面的最小抑菌浓度实验。实验。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案20筛选数据分析筛选数据分析 测试的样品中，测试的样品中，1 1号样为号样为市场上临床使用的环丙沙市场上临床使用的环丙沙星，浓度为星，浓度为0.005mmol/l0.005mmol/l。 其 他 样 品 浓 度 为。 其 他 样 品 浓 度 为0.02mmol/l0.02mmol/l。 实验中，以培养基为空实验中，以培养基为空白白0%0%，以带菌培养液为对，以带菌培养液为对照照100%100%。如果酶标仪如果酶标仪630nm630nm测试

30、的结果中，测试的结果中，空白为空白为-0.2-0.2，空内液体呈透明清，空内液体呈透明清澈，对照孔的值为澈，对照孔的值为+0.1-0+0.1-0.2 2。如果测试样品的值也同样达到如果测试样品的值也同样达到- -0.20.2，表明样品在，表明样品在200200 mol/lmol/l具有具有较好的抗菌活性。较好的抗菌活性。如果测试样品的值在对照孔和空如果测试样品的值在对照孔和空白之间，表明样品在高浓度有抗白之间，表明样品在高浓度有抗菌作用，请选取菌作用，请选取1111个抗菌效果较个抗菌效果较好的样品做下面的最小抑菌浓度好的样品做下面的最小抑菌浓度实验。实验。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案21（

31、4 4）最小抑菌浓度或）最小抑菌浓度或ec50ec50的测试的测试 操作步骤与试管稀释法相似，一般常用操作步骤与试管稀释法相似，一般常用mhmh培养基，培养基，根据上面筛选试验选取出来的样品，在微孔板孔根据上面筛选试验选取出来的样品，在微孔板孔内用微量移液器直接在微孔板孔内作二倍稀释，内用微量移液器直接在微孔板孔内作二倍稀释，然后接种稀释菌液，其中留一列孔作为药液对照，然后接种稀释菌液，其中留一列孔作为药液对照，另一孔仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕另一孔仅加培养基和菌液作为菌对照，试验完毕后，用微量搅拌器震荡混匀后，置后，用微量搅拌器震荡混匀后，置3737温孵温孵12-12-18h18h

32、，用酶标仪，用酶标仪630nm630nm侧吸光度。侧吸光度。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案22样品稀释后的浓度表样品稀释后的浓度表a 培养液培养液200 l样品样品1，200 m234567891011b 培养液培养液200 l样品样品1，100 mc 培养液培养液200 l样品样品1，50 md 培养液培养液200 l样品样品1，25 me 菌对照菌对照(2 l dmso)样品样品1，12.5 mf 菌对照菌对照(2 l dmso)样品样品1，6.25 mg 菌对照菌对照(2 l dmso)样品样品1，3.13 mh 菌对照菌对照(2 l dmso)样品样品1，1.56 m抗菌药物筛选的实

33、验方法与技术教案23（二）数据处理与分析（二）数据处理与分析抗菌药物的最小抗菌浓度测抗菌药物的最小抗菌浓度测试结果可能出现两种形式：试结果可能出现两种形式：1 1，在某一个稀释的样品浓，在某一个稀释的样品浓度，结果表现出细菌没有生度，结果表现出细菌没有生长，菌液较清（可与空白培长，菌液较清（可与空白培养基比），而下一个稀释的养基比），而下一个稀释的样品浓度，菌液中细菌生长样品浓度，菌液中细菌生长比较旺盛（可与含菌对照比比较旺盛（可与含菌对照比），那么，这个稀释的样品），那么，这个稀释的样品浓度就为该样品抗菌的最小浓度就为该样品抗菌的最小浓度。这种化合物的抗菌作浓度。这种化合物的抗菌作用可以称为

34、杀菌作用。用可以称为杀菌作用。如右表中红色值中的样品浓如右表中红色值中的样品浓度就是最小抗菌浓度。度就是最小抗菌浓度。培养液值培养液值-0.2013-0.2013样品样品1 1值值-0.2094-0.2094样品样品2 2值值-0.2066-0.2066培养液值培养液值-0.2027-0.2027样品样品1 1值值-0.2102-0.2102样品样品2 2值值-0.2103-0.2103培养液值培养液值-0.2005-0.2005样品样品1 1值值-0.2068-0.2068样品样品2 2值值-0.2112-0.2112培养液值培养液值-0.2106-0.2106样品样品1 1值值-0.205

35、4-0.2054样品样品2 2值值-0.2022-0.2022菌对照值菌对照值 0.21820.2182样品样品1 1值值-0.2028-0.2028样品样品2 2值值 0.20870.2087菌对照值菌对照值 0.20680.2068样品样品1 1值值-0.2008-0.2008样品样品2 2值值 0.21120.2112菌对照值菌对照值 0.21460.2146样品样品1 1值值 0.20230.2023样品样品2 2值值 0.20880.2088菌对照值菌对照值 0.20330.2033样品样品1 1值值 0.20360.2036样品样品2 2值值 0.20330.2033抗菌药物筛选的

36、实验方法与技术教案242 2，实验中，不同稀释的样，实验中，不同稀释的样品浓度的测试结果没有上面品浓度的测试结果没有上面的现象，而是出现规律性的的现象，而是出现规律性的上升。即，这种样品测出的上升。即，这种样品测出的数据是随着样品浓度的下降数据是随着样品浓度的下降而上升，可以根据其数据画而上升，可以根据其数据画出一条细菌的生长曲线，如出一条细菌的生长曲线，如果对照样的值定为果对照样的值定为100%100%，可，可以从曲线上求出抑制以从曲线上求出抑制50%50%时时样品的浓度，所以，我们称样品的浓度，所以，我们称这种这种 抗菌为抑菌作用，表抗菌为抑菌作用，表明该化合物不能杀死细菌，明该化合物不能

37、杀死细菌，但可以抑制其生长。但可以抑制其生长。培养液值培养液值-0.2013-0.2013样品样品1 1值值-0.2194-0.2194样品样品2 2值值-0.2166-0.2166培养液值培养液值-0.2027-0.2027样品样品1 1值值-0.2082-0.2082样品样品2 2值值-0.1893-0.1893培养液值培养液值-0.2005-0.2005样品样品1 1值值-0.1694-0.1694样品样品2 2值值-0.1002-0.1002培养液值培养液值-0.2106-0.2106样品样品1 1值值-0.1268-0.1268样品样品2 2值值 0.00220.0022菌对照值菌对

38、照值 0.21820.2182样品样品1 1值值-0.0428-0.0428样品样品2 2值值 0.05870.0587菌对照值菌对照值 0.20680.2068样品样品1 1值值-0.0023-0.0023样品样品2 2值值 0.16120.1612菌对照值菌对照值 0.21460.2146样品样品1 1值值 0.68040.6804样品样品2 2值值 0.20880.2088菌对照值菌对照值 0.20330.2033样品样品1 1值值 0.13890.1389样品样品2 2值值 0.21330.2133抗菌药物筛选的实验方法与技术教案25四、琼脂扩散法四、琼脂扩散法 此种方法包括纸片法，杯

39、碟法挖洞法等，它们的共同此种方法包括纸片法，杯碟法挖洞法等，它们的共同点均在平皿琼脂内加入适量测试细菌，按上述方法放置点均在平皿琼脂内加入适量测试细菌，按上述方法放置适量药液在菌层上，药物在琼脂四周扩散，经孵育后，适量药液在菌层上，药物在琼脂四周扩散，经孵育后，细菌生长受抑制，出现抑菌圈，测定抑菌圈直径，能了细菌生长受抑制，出现抑菌圈，测定抑菌圈直径，能了解细菌对药物的敏感程度。解细菌对药物的敏感程度。 琼脂扩散法可定性或初步判断该化合物的抗菌能力，一琼脂扩散法可定性或初步判断该化合物的抗菌能力，一般是将化合物稀释后，加如含试验菌的混菌平板中，由般是将化合物稀释后，加如含试验菌的混菌平板中，由于化合物在琼脂培养基中的扩散作用，使化合物周围的于化合物在琼脂培养基中的扩散作用，使化合物周围的试验菌不能生长，从而产生抑菌圈或抑菌带。根据抑菌试验菌不能生长，从而产生抑菌圈或抑菌带。根据抑菌圈或抑菌带的大小来评价化合物抗菌作用的强弱。圈或抑菌带的大小来评价化合物抗菌作用的强弱。抗菌药物筛选的实验方法与技术教案26图图: :标准曲线法标准曲线法 图图 ：链霉素标准曲线：链霉素标准曲线 双碟、钢管与抑菌圈位置图双碟、钢管与抑菌圈位置图s s：标准品：标准品t t：供试品：供试品 抑菌圈直径抑菌圈直径(mm)(mm)抗菌药物筛选的实验方法与技术教案27（一）滤纸片法实验过程（一）滤纸片法