DNA粗提取和鉴定实验

1、DNA粗提取和鉴定实验DNA的粗提取与鉴定实验一、实验原理DNA主要存在于细胞核DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的 浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度 为0. 14 mol / L时,DNA的溶解度最低。利用这 一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一 步提取出含杂质较少的DNAoDNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此, 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验材料和用具 鸡血细胞液体积分数为95%的冷酒 精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸储水; 质量浓度为0. 1 g

2、/ml的柠檬酸纳溶液；质量的 浓度分别为2mol/L和0. 015mol/L的氯化纳溶 液（新教材不要求0、015的浓度了，都是用的 2mol/L）；二苯胺试剂；铁架台；镣子；水浴锅;玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml, 一个）；烧 杯；（1000ml, 一个，50ml、100 ml、500ml 各 二个）；试管（20ml,二个）；漏斗；试管夹；纱布。三、课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为0. lg/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100mL置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡 血（约180ml）,同时用玻璃棒搅拌，使血液与 柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的 血液置于冰箱内，精置一天,使血

3、细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转 每分）的离心机离心2min,血细胞沉淀于离心 管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清 液，就可以得到鸡血细胞液。四、方法步骤提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL,注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸储水20 mL,同时用玻璃棒充分搅拌5 min,使血细胞加速破裂。然后，用放有2层纱布的漏斗将血细胞液过滤至 lOOOmLo取其滤液。11 .快递摸样叫过滋溶解细胞核内的DNA 将氯化钠的物质的量浓度为2 mol/L的溶液 40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌lmin,使其混合均匀，这时DNA

4、在溶液中呈析出含DNA的粘稠物 沿烧杯内壁缓缓加入蒸储水，同时用玻璃棒不停 地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观 察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馈水，溶液中 出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时 停止加入蒸镭水(这时溶液中氯化钠的物质的量 浓度相当于0.14 mol / L)经验值：需加约570mL蒸储水，且分多次加入。将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实 验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸% 水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利 于DNA分子的附着和缠绕。滤取含DNA的粘稠物 用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至500mL的烧杯中，含DNA的粘稠物被留在纱

5、布上，滤液丢弃。将DNA的粘稠物再溶解取1个50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为2 mol / L的溶液20mLo用钝头镣子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻 璃棒不停地搅拌，约3分钟，使粘稠物尽可能多 地溶解于溶液中。过滤含有DNA的氯化钠溶液 取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入等体积的、冷却的、 体积分数为95%的酒精溶液（使用冷却的酒 精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌, 溶液中会出现含杂质较少的白色丝状物。用玻璃 棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这

6、 种丝状物的主要成分就是DNAoDNA的鉴定取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0. 015 mol/L的溶液5 mL,将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物 溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯 胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min,待试管冷却后，观察并且比较两支试管中 溶液颜色的变化。五、讨论两次使用蒸播水第一次：细胞吸水胀破第二次：使DNA黏稠物析出第一步 第三步三次过滤第一次第二次第三次DNA存在于滤液里DNA被留在纱布上DNA存在于滤液里第一步第四步第六步过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有 关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使 用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使 用的纱布为1-2层两次析出第一次：用0. 14 mol/L的NaCI溶液含杂质多 第三步第二次：用冷却的95 %的酒精 第七步 六次搅拌：第一、二、三、五、七、八步 其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯 底部，这样才能保证得到完整的DNA 为什么反复地溶解与析出DNA,能够去除杂质？ 答：用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高盐 中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能 除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复 溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度不同图5-1 DN八在N©