人脐带间充质干细胞通过IL-6 STAT3信号通路促进肝癌HepG-2细胞的增殖

1、www.CRTER.org郑盛，等. 人脐带间充质干细胞通过IL-6/STAT3信号通路促进肝癌HepG-2细胞的增殖人脐带间充质干细胞通过IL-6/STAT3信号通路促进肝癌HepG-2细胞的增殖郑 盛1，杨 涓1，陈文钦2，刘 晶2，张 帆1，王玉波1(1云南省第三人民医院消化内科，云南省昆明市 650011；2昆明市东方医院产科，云南省昆明市 650000)引用本文：郑盛，杨涓，陈文钦，刘晶，张帆，王玉波. 人脐带间充质干细胞通过IL-6/STAT3信号通路促进肝癌HepG-2细胞的增殖J.中国组织工程研究，2016，20(50):7460-7468.DOI: 10.3969/j.iss

2、n.2095-4344.2016.50.002 ORCID: 0000-0003-1802-4249(郑盛)文章快速阅读：人脐带间充质干细胞通过IL-6/STAT3信号通路促进HepG-2细胞增殖郑盛，男，1982年生，云南省曲靖市人，汉族，2013年昆明医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事急慢性肝病的基础和临床研究。通讯作者：杨涓，硕士，主治医师，云南省第三人民医院消化内科，云南省昆明市 650011中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)50-07460-09稿件接受：2016-10-09HpG-2细胞分为对照组、白细胞介素6组、条件培养基组、条件培

3、养基+白细胞介素6抗体组、条件培养基+AG490组、AG490组RT-PCR法检测PCNA、CyclinD1、Survivin、STAT3基因的转录水平Transwell迁移实验细胞计数法和CCK-8法检测细胞增殖情况Western Blot检测STAT3磷酸化水平划痕实验 文题释义：JAK/STAT信号通路：是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其他信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由3个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。目前已发现STAT家族的6个成员，即STAT1

4、-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”。白细胞介素6受体：识别白细胞介素6的受体。高亲和力受体由配体结合链链(CD126)和信号转导链gp130(CD130)组成(均为型细胞因子受体家族成员)，表达广泛。链可从膜表面脱落或由于RNA的不同剪接而形成sIL-6R，能与白细胞介素6结合为复合物，通过与膜型gp130结合而增强白细胞介素6的生物学作用。摘要背景：人脐带间充质

5、干细胞能分泌多种细胞因子，参与调控肿瘤的增殖、转移及血管生成等生物学行为，其中白细胞介素6可能是最重要的炎性因子之一。目的：探讨人脐带间充质干细胞通过IL-6/STAT3信号通路对肝癌HepG-2细胞增殖和迁移的作用。方法：采用ELISA法检测人脐带间充质干细胞和肝癌HepG-2细胞中白细胞介素6的表达量。Western blot法检测肝癌HepG-2细胞内STAT3以及p-STAT3蛋白质的表达水平。RT-PCR法检测PCNA、CyclinD1、Survivin、STAT3基因的转录水平。细胞计数法和CCK-8法检测肝癌HepG-2细胞的增殖能力。划痕实验和Transwell实验检测肝癌He

6、pG-2细胞的迁移能力。结果与结论：人脐带间充质干细胞白细胞介素6表达量明显高于肝癌HepG-2细胞(P < 0.05)；人脐带间充质干细胞的条件培养基和白细胞介素6均能激活STAT3，白细胞介素6中和抗体则明显削弱了人脐带间充质干细胞条件培养基的激活作用；用白细胞介素6中和抗体或AG490抑制STAT3的活性后，肝癌HepG-2细胞的增殖相关基因PCNA、CyclinD1、Survivin的mRNA表达水平明显下调，其增殖和迁移能力明显下降；结果表明，人脐带间充质干细胞能分泌白细胞介素6激活STAT3信号通路促进肝癌HepG-2细胞的体外增殖和迁移。7461 P.O.Box 1200,

7、Shenyang 110004 kf23385083关键词：干细胞；脐带脐血干细胞；脐带间充质干细胞；HepG-2细胞；肝癌；白细胞介素6；STAT3；增殖；迁移；云南省自然科学基金主题词：脐带；间质干细胞；肝肿瘤；白细胞介素6；STAT3转录因子；组织工程基金资助：云南省自然科学基金(2012FD095)；云南省教育厅科研基金重点项目(2014Z125，2015Z146)；云南省临床重点专科建设项目(云卫医发201518号)Human umbilical cord mesenchymal stem cells promote the proliferation of HepG-2 cells

8、 through interleukin-6/STAT3 signaling pathwayZheng Sheng1, Yang Juan1, Chen Wen-qin2, Liu Jing2, Zhang Fan1, Wang Yu-bo1 (1Department of Digestive Diseases, Third Peoples Hospital of Yunnan Province, Kunming 650011, Yunnan Province, China; 2Department of Obstetrics, Dong Fang Hospital of Kunming, K

9、unming 650000, Yunnan Province, China)AbstractBACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCs) can secrete a variety of factors involved in the regulation of tumor proliferation, metastasis and angiogenesis. Probably, interleukin-6 (IL-6) is one of the most important inflammatory f

10、actors.OBJECTIVE: To explore the effect of hUC-MSCs on the proliferation and migration of HepG-2 hepatocyte carcinoma cells via the IL-6/STAT3 signaling pathway.METHODS: IL-6 expression levels in hUC-MSCs and HepG-2 cells were determined by ELISA. STAT3 and p-STAT3 expression levels were determined

11、by western blot assay. Transcription levels of PCNA, CyclinD1 and STAT3 genes were measured by RT-PCR. HepG-2 cell proliferation was analyzed by flow cytometry and cell counting kit-8 assays. The migration capacity of HepG-2 cells was evaluated through a scratch test and Transwell assays.RESULTS AND

12、 CONCLUSION: The IL-6 level in the hUC-MSCs was significantly higher than that in the HepG-2 cells (P < 0.05). Both the hUC-MSC conditioned culture medium and IL-6 could be used for STAT3 activation. The addition of an IL-6 neutralizing antibody significantly weakened the activation of STAT3 in H

13、epG-2 cells by the hUC-MSCs-conditioned culture medium. In the presence of the IL-6 neutralizing antibody or the STAT3 inhibitor, AG490, the mRNA expression levels of HepG-2 proliferation-related genes (PCNA, CyclinD1 and Survivin) were significantly reduced. The proliferation and migration capacity

14、 of HepG-2 cells were also significantly decreased by this treatment. Taken together, hUC-MSCs can secrete IL-6 to activate the STAT3 signaling pathway, thereby promoting the proliferation and migration of HepG-2 cells.Subject headings: Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cells; Liver Neoplasms; Interl

15、eukin-6; STAT3 Transcription Factor; Tissue EngineeringZheng Sheng, Master, Attending physician, Department of Digestive Diseases, Third Peoples Hospital of Yunnan Province, Kunming 650011, Yunnan Province, ChinaCorresponding author: Yang Juan, Master, Attending physician, Department of Digestive Di

16、seases, Third Peoples Hospital of Yunnan Province, Kunming 650011, Yunnan Province, ChinaFunding: the Natural Science Foundation of Yunnan Province, No. 2012FD095; the Scientific Research Fund of Yunnan Provincial Educational Department, No. 2014Z125, 2015Z146; the Clinical Department Construction o

17、f Yunnan Province, No. 201518Cite this article: Zheng S, Yang J, Chen WQ, Liu J, Zhang F, Wang YB. Human umbilical cord mesenchymal stem cells promote the proliferation of HepG-2 cells through interleukin-6/STAT3 signaling pathway. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(50):7460-7468.7467ISSN 2095

18、-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction间充质干细胞是非造血干细胞的一种，其具有多向分化潜能和免疫调节功能，在特定条件下可以被诱导分化为肝样细胞、心肌细胞等多种类型的组织细胞，可作为良好的组织工程种子细胞1。此外，近年来研究证实间充质干细胞在体内具有一定的肿瘤趋化性，结合其低免疫原性的特点为肿瘤的临床治疗提供了一条新的思路2-5。与骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞等成体间充质干细胞相比，人脐带间充质干细胞除了具备一般间充质干细胞的生物学特性，还具有更强的免疫抑制能力和更高的转染效率6-8，成为了近年来在干细胞抗肿瘤研究中的“明星细胞”

19、。人脐带间充质干细胞可以参与调控肿瘤细胞的多种生物学行为，包括增殖、侵袭、转移及血管生成等9。研究也证实了这些调控过程是通过分泌白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等多种细胞因子实现的10。事实上，临床研究发现不同类型的恶性肿瘤患者，其血清白细胞介素6及肿瘤组织中白细胞介素6相关蛋白均呈高表达11。白细胞介素6的细胞信号转导是通过其特异性受体(IL-6R)、受体(gp130)实现的。gp130是所有白细胞介素6家族成员的共同受体，被激活后能产生多种细胞内信号级联反应，其中最具代表性的是JAK2/STAT3(蛋白质酪氨酸激酶/信号传导子与激活子3)信号通路12。JAK2/STAT

20、3信号通路是经典的肿瘤细胞生物学行为调控通路之一，广泛参与调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移等13。JAK2/STAT3信号通路被激活后可以促进肿瘤的形成和发展，此外，还有研究表明STAT3活化后可以提高恶性肿瘤细胞对化疗药物的抵抗和耐受性14-16。有研究表明，STAT3的活化水平与原发性肝癌患者的预后直接相关，p-STAT3水平与原发性肝癌患者的预后呈明显的负相关17。目前，人脐带间充质干细胞与原发性肝癌的相关研究报道较少，人脐带间充质干细胞分泌的白细胞介素6能否通过JAK2/STAT3信号通路影响肝癌细胞的生物学行为及可能的作用机制尚不清楚。因此，实验旨在阐明人脐带间充质干细胞对肝癌细胞体外

21、增殖和迁移的影响及白细胞介素6依赖的JAK2/STAT3信号通路在其中的作用。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 细胞水平观察实验。1.2 时间及地点 实验于2015年9至12月在云南省昆明市莫立克生物医学科技中心完成。1.3 材料1.3.1 标本及细胞来源 5份脐带标本由昆明市东方医院产科提供，产妇及胎儿身体未见异常。产妇及家属对实验均知情同意，并经医院伦理委员会批准。人肝癌HepG-2细胞由昆明市莫立克生物科技有限公司提供。1.3.2 主要试剂和仪器 胎牛血清、-MEM完全培养基、EDTA、-甘油磷酸钠(美国Santa Cruz公司)；胰酶消化液、蛋白

22、酶抑制剂、dNTP、DEPC、Trizol、Marker(上海宝生物科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)；Tris碱(美国Mbchem公司)；甘氨酸(美国Fluka公司)；十二烷基磺酸钠、四甲基二乙胺、牛血清白蛋白(美国Sigma公司)；丙烯酰胺、N，N-亚甲双丙酰胺(美国Fluka公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；预染蛋白Marker(美国Fermentas公司)；Taq酶(上海经科化学科技有限公司)；重组人白细胞介素6(Peprotech公司)；AG490(Selleckchem公司)；0.1%结晶紫染色液(索莱宝科技有限公司)；兔抗人STAT3

23、抗体、兔抗人p-STAT3抗体(Cell Signaling Teachnology公司)；兔抗人GAPDH抗体(Abcam公司)；CCK-8试剂盒、白细胞介素6 ELISA试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔二抗(Gibco公司)；倒置显微镜、共聚焦荧光显微镜(Olympus公司)；核酸蛋白测定仪、化学发光凝胶成像仪(GE公司)。1.4 实验方法1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定 使用含体积分数为10%胎牛血清的-MEM完全培养基对人脐带间充质干细胞进行全贴壁培养，待细胞融合度达到80%以上进行传代。倒置相差显微镜观察培养细胞的形态及贴壁能力。细胞传至

24、第5代，采用流式细胞仪检测人脐带间充质干细胞的细胞表型标志CD19、CD29、CD90及CD105。1.4.2 人脐带间充质干细胞条件培养基的制备 第5代人脐带间充质干细胞进行重悬并将细胞浓度调整为5×108 L-1，取3 mL细胞悬液接种于T25培养瓶内，待细胞完全贴壁后更换培养基为无血清-MEM，37 培养24 h后收集培养基，3 000 r/min离心20 min，0.22 m过滤，-80 冻存备用。1.4.3 ELISA检测白细胞介素6水平 采用人脐带间充质干细胞条件培养基的制备方法收集肝癌HepG-2细胞及人脐带间充质干细胞的培养液上清，按照白细胞介素6 ELISA检测试剂

25、盒操作说明书检测HepG-2细胞和人脐带间充质干细胞的白细胞介素6表达量。1.4.4 总RNA提取及RT-PCR HepG-2细胞以1×105/孔标准接种于6孔板内，按培养条件随机分为6组：对照组：加入完全培养基培养；白细胞介素6组：加入含20 g/L重组人白细胞介素6的完全培养基培养；条件培养基组：加入含40%人脐带间充质干细胞条件培养基的完全培养基培养；条件培养基+白细胞介素6抗体组：加入含20 mg/L白细胞介素6中和抗体和40%人脐带间充质干细胞条件培养基的完全培养基培养；条件培养基+ AG490组：加入含50 mol/L AG490和40%人脐带间充质干细胞条件培养基的完全

26、培养基培养；AG490组：加入含50 mol/L AG490的完全培养基培养。各组细胞于 37 环境中放置24 h后，提取细胞总RNA，反转录为cDNA后进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测目的基因条带。总RNA的提取、反转录、PCR反应均按试剂盒说明操作。内参为-actin，目的基因包括：PCNA、CyclinD1、Survivin和STAT3，引物序列及产物大小见表1。表1 引物序列和产物长度 Table 1 Sequence of primers and product length基因引物序列产物长度-actinForward：5-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-34

27、43 bpReverse：5-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3PCNAForward：5-CGG TTA GAA GGG GTT A-3360 bpReverse：5-GAC GGT CTC GGT GTG T-3CyclinD1Forward：5-GTG CTG CGA AGT GGA AAC C-3174 bpReverse：5- ATC CAG GTG GCG ACG ATC T-3SurvivinForward：5-AGG ACC ACC GCA TCT CTA CAT-3118 bpReverse：5- AAG TCT GGC TCG TTC TCA GTG-3

28、STAT3Forward：5-CCT GAA GCT GAC CCA GGT AG-3133 bpReverse：5-TTC CAA ACT GCA TCA ATG AAT C-31.4.5 Western blot检测STAT3磷酸化水平 HepG-2细胞接种于培养瓶内，融合度达到80%时按上述方法分为6组，更换相应培养基培养30 min，PBS洗涤2次，用RIPA裂解液裂解细胞获得总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白含量。采用SDS-PAGE进行电泳(每孔30-50 g)，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭，加入一抗4 孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，化学发光显色后X射线胶片曝光，扫描条带进行灰

29、度分析。内参为GAPDH，目的蛋白包括STAT3和p-STAT3。1.4.6 细胞计数法和CCK-8法检测各组细胞增殖情况 按1×104/孔将HepG-2细胞接种于6孔板，按上述方法分为6组，每孔加入2 mL相应培养基，每组设置4个复孔，分别于相应时间点对各组细胞进行计数。按每孔1 000个将HepG-2细胞接种于96孔板，按上述方法分为6组，每孔加入200 L相应培养基，每组设置4个复孔，分别于第6天和第9天各取1块板，每孔加入10 L CCK-8试剂后于37 孵育2 h，酶标仪测定450 nm波长处吸光度值。1.4.7 Transwell迁移实验 取HepG-2细胞接种于6孔板内

30、，待细胞融合度达80%时按上述方法随机分为6组，更换相应培养基培养48 h，常规消化细胞，以无血清-MEM重悬细胞，调整细胞浓度为1×109 L-1。上室每孔加入100 L细胞悬液，下室均加入600 L含体积分数为10%胎牛血清的-MEM完全培养基，37 培养12 h。1%结晶紫染色液浸染上室下壁细胞，显微镜下随机选取5个高倍镜视野进行细胞计数。1.4.8 划痕实验 取HepG-2细胞接种于6孔板内，待细胞融合达80%左右时，按上述方法随机分为6组，用 200 L枪头在每孔细胞中央划一横线，更换相应培养基培养，置于37 、体积分数为5% CO2培养箱中培养，24 h后于倒置相差显微镜

31、下观察细胞迁移情况并拍照。1.5 主要观察指标 人脐带间充质干细胞和HepG-2细胞中白细胞介素6的表达量；HepG-2细胞内STAT3以及p-STAT3蛋白表达水平；HepG-2细胞内PCNA、CyclinD1、Survivin、STAT3基因转录水平；HepG-2细胞的增殖和迁移能力。1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行统计分析，计量资料应用±s表示，两样本均数比较采用t 检验或Mann-Whitney U检验，显著性检验采用单因素方差分析，组间比较方差齐时采用LSD方法，方差不齐时比较釆用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Resul

32、ts 2.1 人脐带间充质干细胞的生物学特性 脐带组织原代培养3 d后，可见少许细胞贴壁生长，细胞多呈短梭形；培养7-10 d后，细胞聚集融合成单层，细胞形态大多为长梭形或多角形；传代至第3、4代，细胞形态均一，胞质透光性良好，细胞形态类似成纤维细胞，呈漩涡状生长(图1)。流式细胞仪检测第5代细胞高表达CD29、CD90、CD105(> 95%)，极低表达CD19(0.1%)，符合间充质干细胞鉴定标准。2.2 白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响 ELISA结果提示人脐带间充质干细胞条件培养基中白细胞介素6水平为(1 856

33、.2±96.6) ng/L，HepG-2细胞白细胞介素6表达水平仅为(180.8±35.5) ng/L，两组相比较，差异有显著性意义(P < 0.05，图2)。20 g/L重人白细胞介素6及40%人脐带间充质干细胞条件培养基分别作用于HepG-2细胞30 min后，p-STAT3表达明显升高。白细胞介素6中和抗体加入条件培养基后STAT3的活性被抑制，同时p-STAT3的表达明显下降。JAK2特异性抑制剂AG490显著抑制了HepG-2细胞STAT3的活化并降低了条件培养基对STAT3的激活作用，组间比较差异有显著性意义(P < 0.05)。各组细胞STAT3蛋

34、白表达差异无显著性意义(P > 0.05，图3)。2.3 白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞增殖相关基因表达的影响 RT-PCR检测结果显示：条件培养基组增殖相关基因PCNA、CyclinD1、Survivin表达水平均明显增高，白细胞介素6中和抗体可明显减弱条件培养基的促增殖基因表达作用，与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)。AG490加入条件培养基后，HepG-2细胞的PCNA、CyclinD1、Survivin mRNA表达明显下调，与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)。重组白细胞介素6对各增殖相关基因均具有显著的上

35、调作用，差异均有显著性意义(P < 0.05)。STAT3基因的转录水平在各处理因素作用24 h后，未见明显变化(图4)。2.4 白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞增殖的影响 细胞计数实验及CCK-8实验结果显示外源性白细胞介素6及人脐带间充质干细胞条件培养基均能促进HepG-2细胞增殖，与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)。AG490可明显延缓了HepG-2细胞的增殖，加入条件培养基后HepG-2细胞增殖与其他组比较差异仍有显著性意义(P < 0.05，图5)。2.5 白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞迁移的

36、影响 20 g/L重组白细胞介素6和40%人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞分别预处理24 h，细胞迁移能力明显增强，与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)；白细胞介素6中和抗体加入条件培养基后，HepG-2细胞迁移能力下降，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)；条件培养基+ AG490组穿过聚碳酸酯膜的细胞数量明显少于对照组及条件培养基组，组间比较差异显著性意义(P < 0.05，图6，图7)。划痕实验结果显示，白细胞介素6及人脐带间充质干细胞条件培养基均能提高HepG-2细胞的损伤愈合能力，而条件培养基中的白细胞介素6被中和后，细胞的愈

37、合能力明显下降，与Transwell实验结果一致。使用AG490抑制HepG-2细胞JAK2/STAT3信号通路后，无论人脐带间充质干细胞条件培养基是否存在，细胞的愈合能力均严重受损(图8)。3 讨论 Discussion人脐带间充质干细胞具备所有干细胞的生物学特性，经过适当的诱导，可向内外胚层的血管内皮细胞、神经细胞和心肌细胞分化，也可以向脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等中胚层细胞分化。近年来发现，肿瘤微环境可通过促进肿瘤内部及周围微血管的新生，诱导细胞周围基质成分增加，促进炎症递质和细胞因子的释放等直接或间接影响肿瘤细胞的增殖和迁移，甚至包括肿瘤细胞的上皮-间质转化。如何安全有效利用间充质干细

38、胞，减少或避免间充质干细胞的致瘤可能，成为目前的研究热点。白细胞介素6是白细胞介素家族中的一类，在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起着重要的作用。近年来多项研究发现，白细胞介素6参与了多种恶性肿瘤的发生、发展与转移18-20。实验结果发现，人脐带间充质干细胞可以分泌大量的白细胞介素6，与HepG-2细胞相比差异有显著性意义。近年来对原发性肝癌的研究发现，在肝癌发生、发展过程中，白细胞介素6参与肝癌演进的各个阶段，在肝癌发生的细胞增殖、凋亡、侵袭和转移过程中扮演了关键作用。实验进一步通过细胞计数、CCK-8法、Transwell迁移实验及细胞划痕实验发现

39、，人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞的增殖和迁移有极大的促进作用；在白细胞介素6中和抗体加入人脐带间充质干细胞条件培养基后，这种促进作用可明显减弱。实验结果表明人脐带间充质干细胞可以通过旁分泌大量白细胞介素6途径促进肝癌HepG-2细胞的增殖和迁移。JAK2/STAT3信号通路是多种恶性肿瘤发生、发展的关键信号转导通路，也是白细胞介素6发挥生物学作用的关键途径。STAT3活化后可显著上调Cyclin D1、Survivin、Cdc2、Bcl-2、HIF1、Hsp90、VEGF等与肿瘤细胞增殖、抗凋亡、缺氧反应、转移、血管生成相关基因的表达21-22。作者发现，白细胞介素6和人脐带间

40、充质干细胞条件培养基均可以促进HepG-2细胞STAT3蛋白质磷酸化从而诱导STAT3活化。在人脐带间充质干细胞条件培养基中加入白细胞介素6中和抗体后，STAT3的磷酸化水平明显降低。上述结果表明人脐带间充质干细胞可通过分泌白细胞介素6激活HepG-2细胞的JAK2/STAT3信号通路；而条件培养基+白细胞介素6抗体组的p-STAT3水平仍高于对照组则说明人脐带间充质干细胞条件培养基中可能存在着其他能激活STAT3的细胞因子。AG490作为国际上通用的JAK2/ STAT3信号通路阻滞剂，能够选择性地抑制JAK2从而显著抑制多种恶性肿瘤细胞STAT3的磷酸化23-24。为了阐明JAK2/STA

41、T3信号通路与人脐带间充质干细胞和HepG-2细胞相互作用的关系，实验采用AG490作为STAT3活化的抑制剂，结果显示，无论人脐带间充质干细胞是否存在，AG490均能够明显抑制HepG-2细胞STAT3的磷酸化。大量研究结果表明，JAK2/STAT3信号通路在各种恶性肿瘤的发生、发展过程中起到了重要作用，尤其是在原发性肝癌进展的各个阶段发挥着主要作用25-26。STAT3在人类多种肿瘤组织及细胞系中异常高表达，异常活化的STAT3通过调控其下游基因参与肿瘤的侵袭转移，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。朱丽华等27研究表明STAT3抑制剂Stattic通过抑制肝癌细胞Bel-7402的p-ST

42、AT3激活，一方面诱导凋亡增加肿瘤细胞的放射敏感性；另一方面降低了金属基质蛋白酶的上升，从而降低了肿瘤细胞迁移和侵袭能力。王亚群等28研究表明STAT3阻断剂Decoy ODN阻断肝癌细胞STAT3后可以增强肝癌细胞H22对阿霉素的敏感性，提高化疗效果，降低化疗毒副作用，改善机体免疫功能。张毅等29用RNAi沉默BEL-7402肝癌细胞STAT3基因联合mTOR抑制剂rapamycin可促进BEL-7402肝癌细胞的凋亡，二者具有明显的协同作用。张巨波等30研究表明STAT3磷酸化水平在恶性潜能高的人肝细胞肝癌细胞株中显著高于恶性潜能低的人肝细胞肝癌细胞株；STAT3抑制剂WP1066能显著抑

43、制MHCC-97H的增殖和侵袭，在裸鼠人肝细胞肝癌模型中，WP1066能有效抑制肿瘤生长，表明WP1066能抑制STAT3磷酸化水平而有效抑制人肝癌细胞增殖和侵袭。Li等31研究发现，采用STAT3抑制剂LLL12干预可以显著下调肝癌细胞成纤维细胞生长因子1、血管内皮细胞生长因子、基质金属蛋白酶9等多种促瘤因子的表达，从而减少肿瘤相关血管的生成。Yang等32利用LLL12进行了体外实验研究，结果显示STAT3活性被抑制后直接诱导体外HepG-2细胞贴壁和迁移能力减弱，并增加了HepG-2细胞的凋亡。作者研究结果显示，PCNA、CyclinD1、Survivin等促进HepG-2细胞增殖和迁移

44、的相关基因，在加入白细胞介素6中和抗体后表达明显下调，一定程度抵御了人脐带间充质干细胞条件培养基的促瘤作用。这也间接证实人脐带间充质干细胞可通过分泌白细胞介素6提高HepG-2细胞增殖相关基因的表达。使用AG490抑制HepG-2细胞(条件培养基+AG490组) STAT3的激活，PCNA、CyclinD1、Survivin等基因的表达明显下调，表明人脐带间充质干细胞分泌的白细胞介素6是通过JAK2/STAT3信号通路发挥作用的。研究也表明，在人脐带间充质干细胞条件培养基中的白细胞介素6和STAT3活性被抑制后，PCNA、CyclinD1、Survivin等增殖相关基因仍较对照组或AG490组

45、高表达，提示可能还存在着其他能促进增殖基因表达的信号通路或细胞因子。进一步的研究证实，HepG-2细胞的增殖和迁移能力与STAT3的活化水平密切相关，白细胞介素6和条件培养基激活STAT3后可促进HepG-2细胞的增殖和迁移；白细胞介素6被阻滞或STAT3的活性受到抑制后，HepG-2细胞的增殖和迁移能力则明显下降。因此，白细胞介素6介导的JAK2/STAT3信号通路在促进HepG-2细胞增殖和迁移的过程中发挥着重要的作用。综上所述，人脐带间充质干细胞能通过分泌白细胞介素6促进HepG-2细胞的增殖和迁移，白细胞介素6通过较为复杂的信号转导调控网络发挥相应的作用，其中JAK2/STAT3信号通

46、路发挥了重要作用。作者通过相关研究证实人脐带间充质干细胞可通过分泌大量白细胞介素6，进而激活HepG-2细胞的JAK2/STAT3信号通路发挥促进HepG-2细胞增殖和迁移的作用。因此，在临床应用人脐带间充质干细胞对相关疾病进行治疗时，人脐带间充质干细胞可能会促进恶性肿瘤的增殖和生长。为降低人脐带间充质干细胞临床应用的风险，必须对阻断相关信号通路进行更进一步的研究。致谢：感谢云南省第三人民医院消化内科、临床营养科以及昆明市东方医院产科全体工作人员的大力支持和无私帮助。作者贡献：实验设计为郑盛、杨涓，实验实施为郑盛、杨涓、陈文钦、刘晶、张帆、王玉波，实验评估为郑盛、杨涓，资料收集为郑盛、杨涓、陈

47、文钦、刘晶、张帆、王玉波。利益冲突：所有作者共同认可文章无相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。脐带组织来源于产科丢弃的胎盘，产妇已签署知情同意书用于科学研究，该实验已获得云南省昆明市东方医院医学伦理委员会批准。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定

48、保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。 D C B A图1 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞形态(×10)Figure 1 Morphology observation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (×10)图注：图中A为原代培养6 d；B为原代培养14 d；C为第1代培养2 d；D为第5代培养3 d。ab806040200 2 0001 8001 6001 4001 2001 0008006004002000a白细胞介素6水平(ng/L)a细胞数bca

49、babcHepG-2细胞 人脐带间充质干细胞条件培养基+白细胞介素6抗体组AG490组条件培养基+AG490组条件培养基组白细胞介素6组对照组图7 穿过Transwell小室的细胞数统计Figure 7 The number of migratory cells in Transwell migration test图注：与对照组比较，aP < 0.05(n=5)；与条件培养基组比较，bP < 0.05(n=5)；与AG490组比较，cP < 0.05(n=5)。图2 ELISA检测HepG-2细胞和人脐带间充质干细胞中白细胞介素6的表达量Figure 2 The expre

50、ssion levels of interleukin-6 in HepG-2 and human umbilical cord mesenchymal stem cells detected by ELISA图注：人脐带间充质干细胞上清液白细胞介素6水平与HepG-2细胞组比较，aP < 0.05(n=4)。对照组白细胞介素6组条件培养基组条件培养基+白细胞介素6抗体组条件培养基+AG490组AG490组蛋白表达条件培养基+AG490组条件培养基+白细胞介素6抗体组AG490组条件培养基组白细胞介素6组对照组aacSTAT3a对照组 白细胞介素6组条件培养基组条件培养基+白细胞介素6抗

51、体组条件培养基+AG490组AG490组abababcbababaabbcbcbbcbcbSurvivinbcaaCyclinD1PCNA Survivin CyclinD1 STAT3 STAT31.00.20abGAPDHap-STAT3STAT3 p-STAT3mRNA表达abaab0.20aac图3 白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响Figure 3 Effects of interleukin-6 and hUC-MSC conditioned culture medium on t

52、he expression of STAT3 and p-STAT3 proteins in HepG-2 cells图注：与对照组比较，aP < 0.05(n=3)；与条件培养基组比较，bP < 0.05(n=3)；与AG490组比较，cP < 0.05(n=3)。条件培养基组AG490组白细胞介素6组条件培养基+AG490组条件培养基+白细胞介素6抗体组对照组-actinPCNA图4 白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞增殖相关基因表达的影响Figure 4 Effects of interleukin-6 and hUC-MSC conditio

53、ned culture medium on the expression of proliferation-related genes in HepG-2 cells图注：与对照组比较，aP < 0.05(n=3)；与条件培养基组比较，bP < 0.05(n=3)；与AG490组比较，cP < 0.05(n=3)。1501005001.51.00.50a细胞数(×104)aabbcaabbabbcbabaaabaa图5 白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞增殖的影响Figure 5 Effects of interleukin-6 and h

54、UC-MSC conditioned culture medium on the proliferation of HepG-2 cells图注：与对照组比较，aP < 0.05(n=3)；与条件培养基组比较，bP < 0.05(n=3)；与AG490组比较，cP < 0.05(n=3)。ababab6 d 9 dA450 nm6 d 9 d对照组白细胞介素6组条件培养基组条件培养基+白细胞介素6抗体组条件培养基+AG490组AG490组bcbbbcabEFDCBA图6 Transwell迁移实验检测白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞迁移的影响(标尺

55、=50 m)Figure 6 Interleukin-6 and hUC-MSC conditioned culture medium affect HepG-2 cell migration in Transwell migration test (scale bars= 50 m)图注：图中A为对照组；B为白细胞介素6组；C为条件培养基组；D为条件培养基+白细胞介素6抗体组；E为条件培养基+AG490组；F为AG490组。各组HepG-2细胞培养24 h后，用完全培养基重悬，接种于Transwell板上室，培养12 h后进行细胞固定、染色和计数。E图8 细胞划痕实验检测白细胞介素6和人脐带间充质干细胞条件培养基对HepG-2细胞迁移的影响(标尺=200 m)Figure 8 Effect of interleukin-6 and hUC-MSC conditioned culture medium on the migration of HepG-2 cells in the scratch test (scale bars=200 m)图注：图中A为对照组；B为白细胞介素6组；C为条件培养基组；D为条件培养基+白细胞介素6抗体组；E为条件培养基+AG490组；F为AG490组。DCBAF4 参考文献 Re