S20135417-肖春林-小麦外源染色体片段鉴定方法比较

1、小麦外源染色体片段鉴定方法比较肖春林 S20135417作物摘要：对5种鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的生化和分子标记方法，包括酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)、荧光原位杂交(FISH)、RAPD、特异性PCR标记、和RELP，进行比较研究。结果表明，5种方法中除了RAPD标记难以鉴定1BL/1RS易位染色体，其他方法都能对1BL/1RS易位染色体进行有效的鉴定。RFLP和FISH方法比较费时费力且花费昂贵，特异性PCR标记又在一定程度上受模板DNA浓度的影响。因此认为，酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)方法是一种简单、快速、经济有效的方法，最易于在小麦育种选择中应用。关键词

2、：小麦；1BL/1RS易位染色体；特异性PCR标记；A-PAGE；FISH； RFLP；RAPDAbstract：For five kinds of appraisal 1BL/1RS translocation chromosomes in wheat background of biochemical and molecular marker method, including acid polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE), fluorescence in situ hybridization (FISH), RAPD, specific

3、 PCR markers, and RELP, A comparative study.The results showed that RAPD markers are difficult to identify 5 ways, in addition to 1BL/1RS translocation chromosomes, other methods can effectively of the 1BL/1RS translocation chromosomes of identification.RFLP and FISH method is time-consuming and exp

4、ensive, specific PCR markers and to a certain extent, affected by the concentration of template DNA.Therefore believe that acid polyacrylamide gel electrophoresis (A-PAGE) method is A simple, rapid, economic and effective method, the most easy to application in wheat breeding selection.Key words: Wh

5、eat;1BL/1RS translocation chromosomes ;Specific PCR markers;A - PAGE;The FISH; RFLP;RAPD在全世界范围内，1BL/1RS小麦一黑麦易位系作为优异基因资源在小麦改良中广泛利用。这主要是由于1BL/1RS易位染色体的1RS片段上不但具有抗条锈病(Yr9)、叶锈病 (Lr26)、秆锈病(St31)和白粉病(Pm8)等抗病基因,还携带有提高小麦产量和增强小麦对环境适应性的基因。在四川省1998-1999年省区试的24个优良新品系中20个新品系含有1BL/1RS易位染色体,可见1BL/1RS易位染色体对四川的小麦改良仍

6、具有重要的作用。许多方法可用于鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体，包括形态学标记、抗性反应、生化标记，细胞学鉴定，基因组原位杂交、PCR标记等。广大小麦育种者最关心的是选用一种快速、经济、简单易行的方法来对杂种后代群体进行有效鉴定。Javornik等对几种鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的细胞学和生化标记方法进行比较研究，认为N-带技术是最费时费力的一种方法,而生化标记则是比较简单快速的方法。90年代以后,伴随着分子标记技术的发展与成熟,又出现了一些鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的分子标记方法，如荧光原位杂交(FISH)和特异性PCR标记等。本研究的目的是对酸性聚丙烯酰胺凝胶

7、电泳(A-PAGE)、荧光原位杂交(FISH)、RAPD、特异性PCR标记、和RFLP等5种鉴定小麦背景1BL/1RS易位染色体方法进行比较研究，以便为育种者选用1BL/1RS易位染色体的鉴定方法提供理论依据。一、材料与方法1.1 实验材料实验材料主要包括秦岭黑麦、多小穗小麦10-A、普通穗型小麦品系88-1643、Aurora、川育12、中国春、以及来源于三交组合10-A/88-1643/川育12后代的一些稳定株系。1.2 方法1.2.1 酸性聚丙烯酰氨凝胶电泳（A-PAGE）使用ISTA于1986年颁布的APAGE(pH3.2)标准程序，电泳分析醇溶蛋白位点GLd1B3。Sozinovc1

8、al将GLidlB3这组醇溶蛋白位点定为小麦背景中1R的标记位点。利用该标记位点来判断是否含1BL/1RS易位染色体。1.2.2 荧光原位杂交(FISH) 利用直接原位杂交法，以中国春总DNA作为封阻DNA，将已标记好的黑麦基因组DNA作探针与根尖有丝分裂细胞染色体进行原位杂交。荧光显微镜下进行观察，拍照。 1.2.3 特异性PCR检测 选用3对小麦背景中1RS的特异PCR标记和1对黑麦1RS基因组特异性SSR引物，对供试材料进行分析。反应总体积25L，其中含1U TaqDNA聚合酶(MBI)、1×buffer、1.5mMMgCl2、200MdNTPs、65rig引物和20-200n

9、g模板DNA。扩增程序为94预变性2min，接着40个循环。每循环 为94 1min、60 lmin、72 2min。最后72延伸10min。NOR、RIS和J0713对引物由上海生工生物技术有限公司合成，黑麦1RS的SSR引物SCM9由四川农业大学小麦研究所扬足君博士提供。扩增产物在2.0或3的琼脂糖凝胶中电泳，EB染色检测。1.2.4 RFLP分析取生长旺盛的幼苗叶片提取植株的总DNA含量。DNA的提取、酶解、跑电泳、Southern转移、探针标记、杂交以及洗膜都采用魏育明等的方法。共选用13个已定位于第1同源群上的探针，均为单拷贝，进行Southern分析。1.2.5 RAPD分析选用O

10、peron公司10碱基引物A、D、E、G、C，五组共100条，按照Welsh和MeClelland的方法进行RAPD分析，扩展产物用琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测。二、结果与分析 2.1 三种鉴定方法的有效性 2.1.1 APAGE分析 采用APAGE方法，对秦岭黑麦、Aurora、10-A、雅安矮10号、88-1643、川育12、异源2号和95-75分析发现。Aurora、10-A、88-1643、异源2号和95-7 5具有1BL/1RS易位染色体，而雅安矮10号和川育12则不含1BL/1RS易位染色体。在这些材料中，Aurora是1个含1BL/1RS易位染色体的前苏联著名面包小麦品种。这说明

11、APAGE方法能对小麦背景中1BL/1RS易位染色体进行有效鉴定。利用APAGE方法，对三交组合10-A/88-1643/川育12后代的一些稳定株系进行 分析发现,95-69等株系也具有1BL/1RS易位染色体。 2.1.2 荧光原位杂交(FISH) 利用普通小麦中国春的总DNA作封阻DNA(封阻DNA：探针DNA=1：50)，以荧光红标记的黑麦基因组DNA作探针，与95-69根尖有丝分裂细胞染色体进行原位杂交。结果表明，在根尖细胞有丝分裂的问期和中期，均能清晰地观察到标记的探针与95-69染色体的杂交信号，说明95-69中含有黑麦染色体片段。同时在有丝分裂的中期细胞中，还可清晰地观察到黑麦的

12、核仁组成染色体的短臂(1RS)易位到95-69中，而在其它染色体上未检测到黑麦的染色体片段存在。这些结果说明，荧光原位杂交能对95-69的1BL/1RS易位染色体进行有效鉴定。 2.1.3 特异性PCR标记检测 分别以20、60、100、150和200ng的中国春和异源2号总DNA为模板，对NOR、RIS、J07I和SCM-9进行引物特异性实验。结果发现，4对引物中除1对黑麦1RS的R引物SCM-9对模板DNA不敏感外，均能得到1RS的特异性DNA扩增片段，而中国春未出现扩增产物。在其它3对引物中，当模板DNA为150和200ng时，在中国春中也能扩增出与异源2号相同分子量的DNA片段。只是存

13、在强弱差异。表明选3对引物对模板DNA较为敏感，模扳DNA浓度太高时，会出现假阳性反应。因此，用这3对引物来鉴定小麦背景中的1RS染色体片段时，DNA的准确定量是关键。 2.1.4 RFLP分析选用13个位于第1同源群染色体上的RFLP探针，对中国春、黑麦、88-1643、川育12、10-A等5个材料的基因组DNA的4种限制性内切酶的限制性酶解片段进行Southern分析。结果表明，所有小麦第1部分同源群染色体短臂上的11个RFLP探针都可以检测到黑麦1RS的特异限制性片段的存在，它取代了缺失的10-A、88-1643中1BS特异限制性片段。并且，在中国春、川育12号中1BS特异限制性片段并没

14、有发生缺失，因此就没有出现黑麦特异限制性片段。位于小麦第1部分同源群染色体长臂的2个探针在各种限制性内切酶/探针组合中，4个小麦材料都没有发生特异限制性片段的缺失，也没有出现黑麦特异限制性片段。利用RFLP标记对三交组合后代进行Southern分析，发现异源2号、95-69、95-75等株系都具有1BL/1RS易位染色体。这些结果表明，RFLP标记能有效鉴定小麦背景中的1BL/1RS易位染色体。2.1.5 RAPD分析选用Operon公司10碱基引物A、D、E、G、C等共五组100条，对黑麦、88-1643、川育12号、10-A的总DNA为模版，使用华美生物工程公司、上海生工生物工程公司生产的

15、Tap DNA聚合酶进行RAPD扩增。结果表明，在所选择的所有RAPD引物中，没找到黑麦1RS的特异DNA扩增片段。这说明，很难用RAPD来标记小麦背景中的1BL/1RS易位染色体。2.2 几种鉴定小麦背景中的1BL/1RS易位染色体的方法比较 在本研究中共采用特异性PCR标记；A-PAGE；FISH；RFLP；RAPD等5种方法来鉴定小麦背景中的1BL/1RS易位染色体,除了RAPD标记外，其他4种方法均能鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体。从实验操作难易程度、实验花费和耗时方面来看，RFLP和FISH标记技术不但实验操作复杂，需要一定的实验技术，而且花费昂贵、周期较长；其它3种方法操作

16、简单且周期较短。从检测时期来看,APAGE和FISH能在播种前完成,真正做到外源染色质检测与育种间有效结合；其他的三种方法只能在苗期才能完成。APAGE与特异性PCR标记相比,在特异性PCR标记检测中部分引物对模扳DNA的量有一定要求。如果模扳DNA过量则易出现假阳性反应。由此可见,这几种鉴定1BL/1RS易位染色体的方法中,对多数育种者来说,APAGE是一种最经济有效的检测方法,最易于在育种选择中应用。 三、讨论Javornik等对鉴定小麦背景中1BL/1RS易位染色体的N-带技术和其他3种蛋白质电泳方法间进行比较研究，认为蛋白质电泳技术是最为简便有效的方法。在本研究中，通过对4中分子技术和

17、1种蛋白质电泳技术(APAGE)进行对比分析发现，APAGE是1种最经济有效的检测方法，最易于在育种选择中应用。虽然1BL/1RS易位染色体具有抗条锈病(Yr9)、叶锈病(Lr26)、秆锈病(Sr31)和白粉病(Prn8)等抗病基因，还携带有提高小麦产量和增强小麦对环境适应性的基因；但是1BL/1RS易位染色体对小麦面包烘烤品质具有不良效应。因此，育种者的育种目标不同，对该染色体的选择就不同。如果以优质为主要育种目标，育种者就期望在选择的优良株系中不含1BL/1RS易位染色体。相反，如果以高产、抗病为主要育种目标。那么1BL/1RS易位染色体就是育种者所要选择的对象。利用APAGE方法，育种者

18、一方面能在播种前采用半粒法进行选择，缩小播种量，以达到标记选择与育种相结合；另一方面利用该方法还能从F2代开始对分离群体进行早化选择，大大缩短育种年限、提高育种效率。 参考文献：1 Rabinovich S V Importance of wheat-rye translocations for breedingmodern cultivar of Triticum aestivum L.J.Euphytica.1998,100:323-304.2 兰秀锦，魏育明，刘登才等.四川小麦优良新品系醇溶蛋白分析J.四川农 业大学学报,2000,18(1):21-24.3 魏育明,郑有良,周荣华等.应

19、用荧光原位杂交和RELP标记检测多小穗小麦新品种10-A中的黑麦染色质J.植物学报,1999,41(2):722-725.4 Porceddu E,Ceoloni C,Lafiandra D,Tanzarella O,Scarascia A,Mugnozza G T.Genetic resources and plant breeding:problems and prospects. In:Miller T E, Koebner R M D eds. Proc. 7th Inter Wheat Genet Symp,Bath, UK: Bath Press, 1988.7-21.5 郑有良,

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