GATK使用方法详解(原始数据的处理)

1、GATK使用方法详解（原始数据的处理）· 1. 对原始下机fastq文件进行过滤和比对（mapping）· 2. 对sam文件进行进行重新排序（reorder）· 3. 将sam文件转换成bam文件（bam是二进制文件，运算速度快）· 4. 对bam文件进行sort排序处理· 5. 对bam文件进行加头（head）处理· 6. Merge· 7. Duplicates Marking· 8. 要对上一步得到的结果生成索引文件· 9.Local realignment around indels·

2、 10.Base quality score recalibration· 11. 分析和评估BQSR结果· ?12.Reduce bam file1. 对原始下机fastq文件进行过滤和比对（mapping）对于Illumina下机数据推荐使用bwa进行mapping。Bwa比对步骤大致如下：（1）对参考基因组构建索引：例子：bwa index -a bwtsw hg19.fa。最后生成文件：hg19.fa.amb、hg19.fa.ann、hg19.fa.bwt、hg19.fa.pac和hg19.fa.sa。构建索引时需要注意的问题：bwa构建索引有两种算法，两种算法都是

3、基于BWT的，这两种算法通过参数-a is 和-a bwtsw进行选择。其中-a bwtsw对于短的参考序列是不工作的，必须要大于等于10Mb；-a is是默认参数，这个参数不适用于大的参考序列，必须要小于等于2G。（2）寻找输入reads文件的SA坐标。对于pair end数据，每个reads文件单独做运算，single end数据就不用说了，只有一个文件。例子：pair end：bwa aln hg19.fa read1.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read1.fq.gz.saibwa aln hg19.fa read2.fq.gz -l 30 -k 2 -

4、t 4 -I > read2.fq.gz.saisingle end：bwa aln hg19.fa read.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read.fq.gz.sai主要参数说明：-o int：允许出现的最大gap数。-e int：每个gap允许的最大长度。-d int：不允许在3端出现大于多少bp的deletion。-i int：不允许在reads两端出现大于多少bp的indel。-l int：Read前多少个碱基作为seed，如果设置的seed大于read长度，将无法继续，最好设置在25-35，与-k 2 配合使用。-k int：在seed中的最大编

5、辑距离，使用默认2，与-l配合使用。-t int：要使用的线程数。-R int：此参数只应用于pair end中，当没有出现大于此值的最佳比对结果时，将会降低标准再次进行比对。增加这个值可以提高配对比对的准确率，但是同时会消耗更长的时间，默认是32。-I int：表示输入的文件格式为Illumina 1.3+数据格式。-B int：设置标记序列。从5端开始多少个碱基作为标记序列，当-B为正值时，在比对之前会将每个read的标记序列剪切，并将此标记序列表示在BC SAM 标签里，对于pair end数据，两端的标记序列会被连接。-b ：指定输入格式为bam格式。bwa aln hg19.fa r

6、ead.bam > read.fq.gz.sai（3）生成sam格式的比对文件。如果一条read比对到多个位置，会随机选择一种。例子：single end：bwa samse hg19.fa read.fq.gz.sai read.fq.gz > read.fq.gz.sam参数：-n int：如果reads比对次数超过多少次，就不在XA标签显示。-r str：定义头文件。RGtID:footSM:bar，如果在此步骤不进行头文件定义，在后续GATK分析中还是需要重新增加头文件。pair end：bwa sampe -a 500 read1.fq.gz.sai read2.fq.g

7、z.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam参数：-a int：最大插入片段大小。-o int：pair end两reads中其中之一所允许配对的最大次数，超过该次数，将被视为single end。降低这个参数，可以加快运算速度，对于少于30bp的read，建议降低-o值。-r str：定义头文件。同single end。-n int：每对reads输出到结果中的最多比对数。对于最后得到的sam文件，将比对上的结果提取出来（awk即可处理），即可直接用于GATK的分析。注意：由于GATK在下游的snpcalling时，是按染色体进行callsnp的。因

8、此，在准备原始sam文件时，可以先按染色体将文件分开，这样会提高运行速度。但是当数据量不足时，可能会影响后续的VQSR分析，这是需要注意的。2. 对sam文件进行进行重新排序（reorder）由BWA生成的sam文件时按字典式排序法进行的排序（lexicographically）进行排序的（chr10，chr11chr19，chr1，chr20chr22，chr2，chr3chrM，chrX，chrY），但是GATK在进行callsnp的时候是按照染色体组型（karyotypic）进行的（chrM，chr1，chr2chr22，chrX，chrY），因此要对原始sam文件进行reorder。可

9、以使用picard-tools中的ReorderSam完成。eg.java -jar picard-tools-1.96/ReorderSam.jarI=hg19.samO=hg19.reorder_00.samREFERENCE=hg19.fa注意：1) 这一步的头文件可以人工加上，同时要确保头文件中有的序号在下面序列中也有对应的。虽然在GATK网站上的说明chrM可以在最前也可以在最后，但是当把chrM放在最后时可能会出错。2) 在进行排序之前，要先构建参考序列的索引。e.g. samtools faidx hg19.fa。最后生成的索引文件：hg19.fa.fai。3) 如果在上一步想把

10、大文件切分成小文件的时候，头文件可以自己手工加上，之后运行这一步就好了。3. 将sam文件转换成bam文件（bam是二进制文件，运算速度快）这一步可使用samtools view完成。e.g. samtools view -bS hg19.reorder_00.sam -o hg19.sam_01.bam4. 对bam文件进行sort排序处理这一步是将sam文件中同一染色体对应的条目按照坐标顺序从小到大进行排序。可以使用picard-tools中SortSam完成。e.g.java -jar picard-tools-1.96/SortSam.jarINPUT=hg19.sam_01.bamO

11、UTPUT=hg19.sam.sort_02.bamSORT_ORDER=coordinate5. 对bam文件进行加头（head）处理GATK2.0以上版本将不再支持无头文件的变异检测。加头这一步可以在BWA比对的时候进行，通过-r参数的选择可以完成。如果在BWA比对期间没有选择-r参数，可以增加这一步骤。可使用picard-tools中AddOrReplaceReadGroups完成。e.g.java -jar picard-tools-1.96/AddOrReplaceReadGroups.jarI=hg19.sam.sort_02.bamO=hg19.reorder.sort.addh

12、ead_03.bamID=hg19IDLB=hg19IDPL=illuminePU=hg19PUSM=hg19ID str：输入reads集ID号；LB：read集文库名；PL：测序平台（illunima或solid）；PU：测序平台下级单位名称（run的名称）；SM：样本名称。注意：这一步尽量不要手动加头，本人尝试过多次手工加头，虽然看起来与软件加的头是一样的，但是程序却无法运行。6. Merge如果一个样本分为多个lane进行测序，那么在进行下一步之前可以将每个lane的bam文件合并。e.g.java -jar picard-tools-1.70/MergeSamFiles.jarINP

13、UT=lane1.bamINPUT=lane2.bamINPUT=lane3.bamINPUT=lane4.bamINPUT=lane8.bamOUTPUT=sample.bam7. Duplicates Marking在制备文库的过程中，由于PCR扩增过程中会存在一些偏差，也就是说有的序列会被过量扩增。这样，在比对的时候，这些过量扩增出来的完全相同的序列就会比对到基因组的相同位置。而这些过量扩增的reads并不是基因组自身固有序列，不能作为变异检测的证据，因此，要尽量去除这些由PCR扩增所形成的duplicates，这一步可以使用picard-tools来完成。去重复的过程是给这些序列设置一

14、个flag以标志它们，方便GATK的识别。还可以设置 REMOVE_DUPLICATES=true 来丢弃duplicated序列。对于是否选择标记或者删除，对结果应该没有什么影响，GATK官方流程里面给出的例子是仅做标记不删除。这里定义的重复序列是这样的：如果两条reads具有相同的长度而且比对到了基因组的同一位置，那么就认为这样的reads是由PCR扩增而来，就会被GATK标记。e.g.java -jar picard-tools-1.96/MarkDuplicates.jarREMOVE_DUPLICATES= falseMAX_FILE_HANDLES_FOR_READ_ENDS_MA

15、P=8000INPUT=hg19.reorder.sort.addhead_03.bamOUTPUT=hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam METRICS_FILE=hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.metrics注意： dedup这一步只要在library层面上进行就可以了，例如一个sample如果建了多个库的话，对每个库进行dedup即可，不需要把所有库合成一个sample再进行dedup操作。其实并不能准确的定义被mask的reads到底是不是duplicates，重复序列的程度与测序深度和文库类型都有关系。最主

16、要目的就是尽量减小文库构建时引入文库的PCR bias。8. 要对上一步得到的结果生成索引文件可以用samtools完成，生成的索引后缀是bai。e.g.samtools index hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam9.Local realignment around indels这一步的目的就是将比对到indel附近的reads进行局部重新比对，将比对的错误率降到最低。一般来说，绝大部分需要进行重新比对的基因组区域，都是因为插入/缺失的存在，因为在indel附近的比对会出现大量的碱基错配，这些碱基的错配很容易被误认为SNP。还有，在比对过程中，比对

17、算法对于每一条read的处理都是独立的，不可能同时把多条reads与参考基因组比对来排错。因此，即使有一些reads能够正确的比对到indel，但那些恰恰比对到indel开始或者结束位置的read也会有很高的比对错误率，这都是需要重新比对的。Local realignment就是将由indel导致错配的区域进行重新比对，将indel附近的比对错误率降到最低。主要分为两步：第一步，通过运行RealignerTargetCreator来确定要进行重新比对的区域。e.g.java -jar GenomeAnalysisTK.jar-R hg19.fa-T RealignerTargetCreator

18、-I hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam-o hg19.dedup.realn_06.intervals-known Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf-known 1000G_phase1.indels.hg19.vcf参数说明：-R： 参考基因组；-T： 选择的GATK工具；-I： 输入上一步所得bam文件；-o： 输出的需要重新比对的基因组区域结果；-maxInterval： 允许进行重新比对的基因组区域的最大值，不能太大，太大耗费会很长时间，默认值500；-known： 已知的可靠的ind

19、el位点，指定已知的可靠的indel位点，重比对将主要围绕这些位点进行，对于人类基因组数据而言，可以直接指定GATK resource bundle里面的indel文件（必须是vcf文件）。对于known sites的选择很重要，GATK中每一个用到known sites的工具对于known sites的使用都是不一样的，但是所有的都有一个共同目的，那就是分辨真实的变异位点和不可信的变异位点。如果不提供这些known sites的话，这些统计工具就会产生偏差，最后会严重影响结果的可信度。在这些需要知道known sites的工具里面，只有UnifiedGenotyper和HaplotypeCa

20、ller对known sites没有太严格的要求。如果你所研究的对象是人类基因组的话，那就简单多了，因为GATK网站上对如何使用人类基因组的known sites做出了详细的说明，具体的选择方法如下表，这些文件都可以在GATK resource bundle中下载。TooldbSNP 129dbSNP >132Mills indels1KG indelsHapMapOmniRealignerTargetCreatorXXIndelRealignerXXBaseRecalibratorXXX(UnifiedGenotyper/ HaplotypeCaller)XVariantRecalib

21、ratorXXXXVariantEvalX但是如果你要研究的不是人类基因组的话，那就有点麻烦了，/gatk/guide/article?id=1243，这个网站上是做非人类基因组时，大家分享的经验，可以参考一下。这个known sites如果实在没有的话，也是可以自己构建的：首先，先使用没有经过矫正的数据进行一轮SNP calling；然后，挑选最可信的SNP位点进行BQSR分析；最后，在使用这些经过BQSR的数据进行一次真正的SNP calling。这几步可能要重复好多次才能得到可靠的结果。第二步，通过运行IndelRealigner在

22、这些区域内进行重新比对。e.g.java -jar GenomeAnalysisTK.jar-R hg19.fa-T IndelRealigner-targetIntervals hg19.dedup.realn_06.intervals-I hg19.reorder.sort.addhead.dedup_04.bam-o hg19.dedup.realn_07.bam-known Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf-known 1000G_phase1.indels.hg19.vcf运行结束后，生成的hg19.dedup.realn_0

23、7.bam即为最后重比对后的文件。注意：1. 第一步和第二步中使用的输入文件（bam文件）、参考基因组和已知indel文件必须是相同的文件。2. 当在相同的基因组区域发现多个indel存在时，这个工具会从其中选择一个最有可能存在比对错误的indel进行重新比对，剩余的其他indel不予考虑。3. 对于454下机数据，本工具不支持。此外，这一步还会忽略bwa比对中质量值为0的read以及在CIGAR信息中存在连续indel的reads。10.Base quality score recalibration这一步是对bam文件里reads的碱基质量值进行重新校正，使最后输出的bam文件中reads

24、中碱基的质量值能够更加接近真实的与参考基因组之间错配的概率。这一步适用于多种数据类型，包括illunima、solid、454、CG等数据格式。在GATK2.0以上版本中还可以对indel的质量值进行校正，这一步对indel calling非常有帮助举例说明，在reads碱基质量值被校正之前，我们要保留质量值在Q25以上的碱基，但是实际上质量值在Q25的这些碱基的错误率在1%，也就是说质量值只有Q20，这样就会对后续的变异检测的可信度造成影响。还有，在边合成边测序的测序过程中，在reads末端碱基的错误率往往要比起始部位更高。另外，AC的质量值往往要低于TG。BQSR的就是要对这些质量值进行校

25、正。BQSR主要有三步：第一步：利用工具BaseRecalibrator，根据一些known sites，生成一个校正质量值所需要的数据文件，GATK网站以“.grp”为后缀命名。e.g.java -jar GenomeAnalysisTK.jar-T BaseRecalibrator-R hg19.fa-I ChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam-knownSites dbsnp_137.hg19.vcf-knownSites Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf-knownSites 1000G_phase1

26、.indels.hg19.vcf-o ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp第二步：利用第一步生成的ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp来生成校正后的数据文件，也是以“.grp”命名，这一步主要是为了与校正之前的数据进行比较，最后生成碱基质量值校正前后的比较图，如果不想生成最后BQSR比较图，这一步可以省略。e.g.java -jar GenomeAnalysisTK.jar-T BaseRecalibrator-R hg19.fa-I ChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam-BQSR ChrALL.100.sam.reca

27、l.08-1.grp-o GATK/hg19.recal.08-2.grp-knownSites dbsnp_137.hg19.vcf-knownSites Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg19.vcf-knownSites 1000G_phase1.indels.hg19.vcf第三步：利用工具PrintReads将经过质量值校正的数据输出到新的bam文件中，用于后续的变异检测。e.g.java -jar GenomeAnalysisTK.jar-T PrintReads-R hg19.fa-I ChrALL.100.sam.dedup.realn.07.bam-BQSR ChrALL.100.sam.recal.08-1.grp-o ChrALL.100.sam.recal.08-3.grp.bam主要参数说明：-bqsrBAQGOP：BQSR BAQ gap open 罚值，默认值是40，如果是对全基因组数据进行BQSR分析，设置为30会更好。-lqt： 在计算过程中，该算法所能考虑的reads两端的最小质量值。如果质量值小于该值，计算过程中将不予考虑，默认值是2。