第五章_三帖皂甙类制剂的分析

1、第三节第三节 三帖皂苷类成分分析三帖皂苷类成分分析本节要求本节要求1.了解皂苷的理化性质2.熟悉含皂苷类制剂供试液的提取纯化制备方法3.掌握含皂苷类制剂的定量测定原理和方法4.掌握含皂苷类制剂的定性鉴别的原理和方法一、概述一、概述 二、结构特征及理化性质二、结构特征及理化性质 三、皂苷三、皂苷类成分的定性鉴别成分的定性鉴别 四、皂苷四、皂苷类成分的定量分析成分的定量分析 五、应用实例五、应用实例内 容苷类（苷类（glycosidesglycosides） 稀酸或酶水解后产生糖和非糖两部分的化合物。一般为活性成分，如强心苷、皂苷等。 无色、无臭晶体。溶于水、乙醇，难溶于亲脂性有机溶剂；苷元则相反

2、。 人参皂苷 HOR2OR1OOR3皂苷皂苷 概述概述* *定义：皂苷大多数是指螺甾烷及其生源相似的甾族定义：皂苷大多数是指螺甾烷及其生源相似的甾族 化合物的低聚糖苷或三萜类化合物的低聚糖化合物的低聚糖苷或三萜类化合物的低聚糖 苷。苷。 具有发泡、溶血等特性。具有发泡、溶血等特性。 组成组成 皂苷元：甾体皂苷元（皂苷元：甾体皂苷元（2727个个C C，合成激素的原料）合成激素的原料） 三萜皂苷元（三萜皂苷元（3030个个C C，生理活性成分）生理活性成分） 糖：多分子糖或糖醛酸糖：多分子糖或糖醛酸皂苷的分类皂苷的分类按苷元分为两大类：按苷元分为两大类： 甾体皂苷：甾体皂苷： 27 27个组成的

3、甾体衍生物。个组成的甾体衍生物。 三萜皂苷：三萜皂苷： 30 30个个C C组成的三萜衍生物，大组成的三萜衍生物，大多数三萜化合物均可看作有多数三萜化合物均可看作有6 6个异戊二烯单位个异戊二烯单位连接而成。游离的三萜类化合物通常多不溶于连接而成。游离的三萜类化合物通常多不溶于水，与糖结合后成苷，则可溶于水，振摇后可水，与糖结合后成苷，则可溶于水，振摇后可生成胶体溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫。生成胶体溶液，并有持久性似肥皂溶液的泡沫。五环三萜皂苷五环三萜皂苷 -香树脂醇型（齐墩果烷型）香树脂醇型（齐墩果烷型） - -香树脂醇型（熊果烷型）香树脂醇型（熊果烷型） 羽扇豆醇型羽扇豆醇型四环三萜

4、皂苷四环三萜皂苷 达马烷型达马烷型 羊毛脂甾烷型羊毛脂甾烷型其他分类其他分类 单皂苷：中性皂苷、酯皂苷、酸性单皂苷：中性皂苷、酯皂苷、酸性皂苷皂苷 双皂苷双皂苷（2 2）* *三萜皂苷（酸性皂苷）三萜皂苷（酸性皂苷）含三帖类成分的常用中药人参西洋参三七黄芪柴胡甘草桔梗远志酸枣仁45891013141718192021222324252627282930H达马烷20(S)原人参三醇HHHHOHOHOHOH三萜类化合物是中药中一类主要有效成分，具有多方面的生理活性。如人参皂苷可促进RNA蛋白质的生物合成调节机体代谢，增强免疫功能；柴胡皂苷有抑制中枢神经系统和明显的抗炎症作用，并能减低血浆中胆固醇和

5、甘油三酯的水平；七叶皂苷有明显的抗渗出、抗炎、抗瘀血的作用；甘草皂苷有促进肾上腺皮质激素样作用，并能防治肝硬化、抗动脉粥样硬化、抗溃疡等作用；还有一些苷皂类化合物有抗肿瘤活性。二、 物理性质性状 多数为无色或乳白色无定形粉末，少数为晶体； 多数有苦、辛辣味，对粘膜有刺激性； 有吸湿性。*溶解性 (掌握） 皂苷元：不溶于水，而溶于石油醚、C6H6 、Et2O、CHCl3；酸性皂苷元可溶于碱水 皂苷:易溶于水，热甲醇、乙醇。 在含水丁醇/戊醇中溶解度较大。 不溶于Et2O、CHCl3等。 皂苷类化合物的溶解性一般规律 溶解性 极性溶剂 中等极性溶剂 低极性溶剂 化合物类型 水 甲醇/乙醇 正丁醇

6、丙酮/乙醚 氯仿等 皂苷元 皂苷 含有皂苷类成分的中药制剂在进行成分分析时，供试液制备常依据其溶解性特点选择提取溶剂及方法供试液制备常用方法及溶剂选择（掌握）方方法法 类类型型 常常用用溶溶剂剂 固固体体制制剂剂 液液体体制制剂剂 备备注注 皂皂 苷苷 水水、 稀稀甲甲 （乙乙） 醇醇、甲甲（乙乙）醇醇、乙乙酸酸乙乙酯酯、正正丁丁醇醇等等 回回流流提提取取法法 超超声声提提取取法法 温温浸浸法法 可可用用水水饱饱和和正正丁丁醇醇萃萃取取 酒酒剂剂、 酊酊剂剂等等含含醇醇制制剂剂需需除除去去大大部部分分醇醇后后再再用用有有机机溶溶剂剂萃萃取取 皂皂 苷苷元元 乙乙醚醚、 氯氯仿仿等等亲亲脂脂性性

7、有有机机溶溶剂剂 先先提提取取总总皂皂苷苷， 总总皂皂苷苷加加酸酸水水解解， 亲亲脂脂性性有有机机溶溶剂剂萃萃取取样样品品先先行行水水解解， 再再用用亲亲脂脂性性有有机机溶溶剂剂提提取取 若若皂皂苷苷元元对对酸酸不不稳稳定定， 需需注注意意 皂苷元的提取皂苷元的提取 一般步骤 酸水解酸水解- -有机溶剂提取法有机溶剂提取法 中药甲醇冷浸水解液有机溶剂提取浸膏有机溶剂提取液回收溶剂甾体皂甙元甲醇液回收甲醇加酸,加热,过滤 物理性质物理性质* *发泡性 皂苷能降低水溶液的表面张力，振摇后产生持久性泡沫。皂苷能降低水溶液的表面张力，振摇后产生持久性泡沫。 * * 1g中药粉末10ml水,煮沸10mi

8、n,过滤滤液振摇持久性泡沫2支试管0.1M HCl 5ml, 3d中药水提液, 振摇1min0.1M NaOH 5ml, 3d中药水提液, 振摇1min甾体皂甙: 碱液管的泡沫比酸液管持久时间长几倍三萜皂甙: 两管形成泡沫持久相同物理性质物理性质*溶血性 皂苷有使红细胞破裂的作用，用溶血指数表示。 溶血指数：对同一动物来源的红细胞稀悬浮液， 在同一条件下造成完全溶血的最低浓度。 如薯蓣皂苷1:400000（毒性大） 溶血作用与分子结构的关系： 皂苷元决定有无溶血作用；糖决定溶血作用的强弱。 单糖链皂苷较显著；酸性皂苷中等；中性三萜皂苷最弱。 皂苷消化道不吸收，口服无毒，胆甾醇能解皂毒。 物理性

9、质物理性质熔点 皂苷无明显熔点皂苷无明显熔点( (dec.)dec.)； 苷元熔点随羟基数目增加而升高苷元熔点随羟基数目增加而升高( (单单- -OH208,OH240)OH240)； 甾体皂苷鉴定时不能单靠熔点（混熔点不降）。甾体皂苷鉴定时不能单靠熔点（混熔点不降）。旋光度 甾体皂苷及苷元均为左旋，且与双键有关。甾体皂苷及苷元均为左旋，且与双键有关。 未饱和的苷元或乙酰化物均较相应的饱和物为负（左旋）。未饱和的苷元或乙酰化物均较相应的饱和物为负（左旋）。 化学性质化学性质金属盐类的反应： 皂苷水溶液与铅盐、钡盐、铜盐等产生沉淀 酸性皂苷：与硫酸铵、硫酸铝或其他中性盐类生产沉淀 中性皂苷：与碱

10、式醋酸铅或氢氧化钡等碱性盐类产生沉淀可进行含皂苷类成分制剂的提取和粗分离化学性质化学性质显色反应：无水条件下显色反应：无水条件下（）（）醋酐浓硫酸反应醋酐浓硫酸反应：Liebermann-BurchardLiebermann-Burchard反应反应 试剂：醋酐浓硫酸（20：1） 样品醋酐1ml沿壁加入浓硫酸（20ml)两液层中间出现色环。 甾体皂苷：色环为蓝色或蓝绿色。阳性。 三萜皂苷：色环为红、粉红或紫色。阳性。u 主要用于化学鉴别化学性质化学性质（2 2）三氯醋酸反应：三氯醋酸反应：Rosen-HeimerRosen-Heimer反应反应 试剂：试剂：2525三氯醋酸氯仿溶液三氯醋酸氯仿

11、溶液 样品液滤纸上样品液滤纸上滴三氯醋酸试剂滴三氯醋酸试剂观察观察 6060观察斑点：观察斑点：红色红色紫色斑点紫色斑点 甾体皂苷阳性甾体皂苷阳性 100100观察斑点：观察斑点：红色红色紫色斑点紫色斑点 三萜皂苷阳性三萜皂苷阳性u用于化学及色谱鉴别的显色剂化学性质化学性质（）（）五氯化锑反应五氯化锑反应：KahlenbergKahlenberg反应反应 试剂：试剂：2020五氯化锑氯仿溶液五氯化锑氯仿溶液 样品氯仿液五氯化锑氯仿液样品氯仿液五氯化锑氯仿液氯仿液氯仿液 呈紫蓝色。呈紫蓝色。 u用于化学及色谱鉴别的显色剂黄芪甲苷黄芪甲苷光谱特征光谱特征甘草酸/甘草皂苷/甘草甜素远志皂苷三、皂苷类

12、的定性鉴别：三、皂苷类的定性鉴别：皂苷类的定性鉴别较常用的有皂苷类的定性鉴别较常用的有 泡沫反应鉴别泡沫反应鉴别 化学显色反应鉴别化学显色反应鉴别 薄层色谱鉴别：薄层色谱鉴别：中药制剂鉴别应用准确率较高中药制剂鉴别应用准确率较高中药材成分鉴别中药材成分鉴别泡沫反应鉴别泡沫反应鉴别： 中药粉末中药粉末g g水水1010mlml滤液滤液强烈振摇强烈振摇 泡沫泡沫1515minmin以上不退以上不退 阳性。阳性。 滤液滤液 0.10.1mol/L HCl 5mlmol/L HCl 5ml强烈振摇强烈振摇 0.10.1mol/L NaOH 5mlmol/L NaOH 5ml强烈振摇强烈振摇 若两管泡沫

13、高度相同，则含三萜皂苷；若两管泡沫高度相同，则含三萜皂苷； 若若碱管碱管较酸管泡沫高数倍，则含较酸管泡沫高数倍，则含甾体皂苷甾体皂苷。 （当中药制剂中皂苷含量较高时，可参考此法鉴别。（当中药制剂中皂苷含量较高时，可参考此法鉴别。 但需注意排除干扰、空白对照。但需注意排除干扰、空白对照。） 化学显色反应鉴别：化学显色反应鉴别： 例例 复方丹参片处方：丹参浸膏、三七、冰片。复方丹参片处方：丹参浸膏、三七、冰片。 其中三七皂苷的鉴别可用显色法 样品片水洗涤去糖衣研细无水乙醇10ml振荡提取滤过滤液ml蒸干五氯化锑氯仿 饱和液显紫蓝色 注：此类显色反应在中药制剂分析中，因组分多，干扰大，应用较少。薄层

14、色谱鉴别 因皂苷类成分大多无明显的紫外吸收，故经薄层分后，用适当的显色剂显色，是皂苷各组分定性鉴别最常用的方法。 阳性对照：可用被检测的皂苷类成分对照品或对照药材。 薄层板：常用硅胶或氧化铝 展开剂：其配比可根据需要加以调整。薄层色谱鉴别薄层色谱鉴别皂苷：极性较大，一般用分配层析效果好展开剂极性要较大-亲水性强适合的展开剂： CHCl3-CH3OH-H2O(10以下放置，13:7:2下层), 水饱和C4H9OH， CHCl3-CH3OH(7:3),C4H9OH-EtOAC-H2O(4:1:5), EtOAC-吡啶-H2O(3:1:3), CHCl3-C2H5OH(7:3)等。 薄层色谱鉴别薄层

15、色谱鉴别皂苷元：皂苷元：极性较小，亲脂性强，吸附、分配薄层均可。用硅胶为吸附剂，则要求展开剂的亲脂性强。适合于皂苷元常用展开剂有：环已烷-EtOAC(1:1), C6H6-EtOAC(1:1), CHCl3-EtOAC(1:1), CHCl3-EtOEt(1:1), C6H6-EtOH(17:3)。 常用的显色剂常用的显色剂2525磷钼酸乙醇液磷钼酸乙醇液：喷后：喷后140,140,5 51010min,min,皂苷元紫蓝色。皂苷元紫蓝色。 5 5 磷钼酸乙醇液：喷后磷钼酸乙醇液：喷后105,105,5 51010minmin，皂苷元紫蓝色皂苷元紫蓝色、三氯化锑的浓盐酸或氯仿液、三氯化锑的浓盐

16、酸或氯仿液: : 喷后喷后90,90,1010minmin，各皂苷元各皂苷元呈不同颜色。呈不同颜色。、硫酸、硫酸- -甲醇液甲醇液(1:1):(1:1): 喷后，显红褐、紫、黄或黑色。喷后，显红褐、紫、黄或黑色。 与加热温度有关。缺点是腐蚀性强与加热温度有关。缺点是腐蚀性强, ,其他物质也显色。其他物质也显色。、氯磺酸、氯磺酸- -乙酸乙酸(1:(1:) )溶液溶液: : 喷后喷后130,130,minmin，各皂苷元呈各皂苷元呈不同颜色。如天蓝、粉红等不同颜色。如天蓝、粉红等, ,且在紫外光下也呈不同萤光，较灵且在紫外光下也呈不同萤光，较灵敏（可检出敏（可检出ugug）, ,可用于鉴别和定量

17、。可用于鉴别和定量。、碘蒸汽、碘蒸汽: :灵敏度约为灵敏度约为ugug，优点碘易挥发，显色后挥去碘，优点碘易挥发，显色后挥去碘，斑点可作定量分析。常用于确定斑点的位置。缺点专属性不强斑点可作定量分析。常用于确定斑点的位置。缺点专属性不强. .。常用的显色剂常用的显色剂10硫酸乙醇溶液：最常用的显色剂配制方法：取10ml硫酸,用乙醇稀释至100ml 特点：与加热温度有关；腐蚀性强；其他成分也可显色薄层色谱薄层色谱1.1. 薄层板的制备薄层板的制备：吸附剂的选择吸附剂的选择 2. 2. 供试液制备供试液制备（掌握）:溶解性/对照物溶液的制备3.3. 展开剂的选择展开剂的选择 ：与被测物结构的极性大

18、小、溶：与被测物结构的极性大小、溶 解度以及吸附剂的活度密切相关解度以及吸附剂的活度密切相关4. 4. 点样点样5. 5. 展开展开6. 6. 晾干、显色晾干、显色7. 7. 斑点的检视、薄层鉴别的判断、或定量斑点的检视、薄层鉴别的判断、或定量8. 8. 薄层板的记录薄层板的记录四、 皂苷类的定量分析 总皂苷测定：醇提 水饱和正丁醇萃取或大孔树脂吸附洗脱 测定-常用重量法、比色法 皂苷元测定：总皂苷酸解 苷元 测定比色法、薄层色谱法、高效液相色谱法 单体皂苷测定：薄层色谱法、高效液相色谱法但在中药制剂中如无特殊原因，应尽量避免将药品水解后测定水解产物，因为如此测定已不能客观反应药品自身的质量，

19、更无法进行稳定性考察总皂苷测定重量法：根据皂苷类成分的溶解性进行提取、分离及纯化后得到总皂苷，恒重、称量，并计算样品中总皂苷含量。 一般少用，主要用于含皂苷的原料药质量控制。 如甘草浸膏中甘草酸含量测定比色法一般指供试品连续一般指供试品连续两次干燥或炽灼后两次干燥或炽灼后的重量差异在的重量差异在0.3mg以下的重以下的重量量总皂苷测定总皂苷测定比色法：利用皂苷能与某些试剂反应后产生颜色，然后于可见光区进行比色测定。显色后能在紫外光区产生吸收，用UV测定专属性差，但反应灵敏、方法简便、易行常用的显色试剂测定总皂苷、总皂苷元的含量时，可用单体皂苷或皂苷元作对照常用的皂苷显色剂常用的皂苷显色剂浓硫酸

20、浓硫酸 测定甾体皂苷的通用试剂。测定甾体皂苷的通用试剂。 甾体皂苷常显黄色甾体皂苷常显黄色(80(809090反应反应30306060minmin）。）。高氯酸高氯酸 测定具测定具5 5的苷元的苷元, ,因因5 5不饱和结构与高氯酸在室不饱和结构与高氯酸在室 温下即可生成黄色。如：薯蓣皂苷元，温下即可生成黄色。如：薯蓣皂苷元，1010、410410nmnm、3030 内稳定内稳定,25,25200200ugug符合比尔定律符合比尔定律. .浓硫酸醋酐、硫酸醋酐冰醋酸、硫酸冰醋酸试剂：浓硫酸醋酐、硫酸醋酐冰醋酸、硫酸冰醋酸试剂： 主用于检测甾体皂苷。如：人参总皂苷主用于检测甾体皂苷。如：人参总皂

21、苷,60,60、2525min,min, 520nm 520nm测定测定. . 甘草次酸在甘草次酸在529529nmnm测定测定. .芳香醛芳香醛- -硫酸或芳香醛硫酸或芳香醛- -高氯酸高氯酸 主用干检测三萜皂苷，甾体主用干检测三萜皂苷，甾体 皂苷也可用。需注意控制反应条件皂苷也可用。需注意控制反应条件. .其他试剂：其他试剂：如亚甲蓝与甘草酸结合物，如亚甲蓝与甘草酸结合物，640640nmnm比色。比色。 2,6- 2,6-二丁基对甲酚与甘草酸呈色二丁基对甲酚与甘草酸呈色,575,575nmnm比色。比色。 复方丹参片中三七皂苷的含量测定大孔树脂分离比色法复方丹参片复方丹参片05版药典：版

22、药典：HPLC法测定丹参酮法测定丹参酮IIA，丹，丹参酚酸参酚酸B大孔树脂：大孔树脂：大孔树脂规格的选择：1.大孔树脂性质与吸附物质的性质遵循相似性相吸的原则。极性较大的化合物一般适合在中等极性以上性质的大孔树脂上分离，极性小的化合物适合在非极性的大孔树脂上分离。l 比如用大孔树脂分离银杏黄酮 S-8极性： 吸附量 126.7mg/g AD-8弱极性： 吸附量102.8mg/g H-107非极性： 吸附量 47.7mg/g银杏黄酮具有多酚结构和糖苷链，具有一定吸附和亲水性，有利于弱极性和极性大孔树脂吸附大孔树脂规格的选择：2.被吸附物质分子的大小和树脂孔径的关系。大孔树脂的吸附量大小受树脂极性

23、和骨架结构影响外，还受到树脂空间结构的影响。树脂吸附过程中，树脂内部孔径是被吸附物质扩散的路径，在比表面积一定的情况下，适当增加树脂孔径，亦会增大被吸附物质的扩散速度，有利于达到吸附和解析平衡l比如不同规格的大孔树脂对大豆皂苷的分离 聚苯乙烯型大孔吸附树脂ZTC-1（孔径13-30nm）和X-5（孔径29-30nm）吸附量大，ZTC-1：吸附量大、解析容易、吸附速度快X-5：解析率较高，但吸附容量偏低影响大孔树脂分离纯化效果的因素1.被吸附物质溶液的ph值：由于PH值影响有效成分的解离度，从而影响到有效成分被大孔树脂吸附的难易程度。一般情况下，酸性物质易在适当酸性溶液中被吸附，碱性物质在适当碱性溶液中易被吸附，中性物质可在接近中性条件下被吸附。2.被吸附物的上样浓度：一般被吸附物浓度增加吸附量也随之增加，但被吸附物浓度增加有一定的限度，不能超过大孔树脂的吸附容量。影响大孔树脂