第九章DNA序列分析

1、第九章 DNA序列分析Sequencing and Analysing of DNA DNA的序列分析有两种基本方法，Maxam-Gilbert化学降解法和Sanger氏酶学法。 因为测序每个反应读取的序列是有限的，做长片段DNA或基因组测序时，需要选用一定的策略。 测序的策略有primer walking，随机测序，定向测序等。现在全自动测序仍然沿用Sanger氏酶学法，但是在标记上作了改进。 DNA测序结果通过生物信息学分析，获取需要的信息。一、Maxam-Gilbert化学降解法 特点：特点：特定化学试剂修饰不同碱基，并在相应碱基出切断DNA片段再进行序列分析。 原理：原理：将一个 DN

2、A 片段的 5 端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而 5 端被标记的 DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的 DNA 的碱基序列。 MaxamMaxam- -GilbertGilbert 化学降解法测序的常用化学化学降解法测序的常用化学试剂试剂 碱基体系 化学修饰 试剂 化学反应 断裂部位 G A + G C + T C A C dimethyl sulphate（硫酸二甲酯） Piperidine formate（哌啶甲酸）, pH2.0 hydrazine（肼，联氨

3、NH2.NH2） hydrazine + NaCl（1.5M） 90C, NaOH（1.2M） 甲基化 脱嘌呤 打开嘧啶环 打开胞嘧啶环 断裂反应 G G 和 A C 和 T C A 和 C 作为标记用的放射性同位素主要有-32（-32ATP，-32GTP. -32TTP ，或-32CTP），或 -33 NTP Maxam-Gilbert化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的DNA片段可以直接测序； 化学降解测序法特别适用于测定含有如 5-甲基腺嘌呤A或者G，C含量较高的DNA片段，以及短链的寡核苷酸片段的序列。 自建立以来没有大的改进，操作繁

4、琐，化学试剂的毒性大； 放射性同位素标记效率偏低，需要较长的放射自显影曝光时间，人工读取费时费力； 目前仅用于分析特殊DNA链的核苷酸序列及DNA和蛋白质互作中的DNA一级结构。二、Sanger双脱氧链终止法 原理：原理：双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的 3位置的-OH 缺失。当它与其他正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在 DNA 多聚酶的作用下，虽然它也能够象正常核苷酸一样参与 DNA 合成，以其 5位置的磷酸基，与上位脱氧核苷酸的 3位置的-OH 结合，但是，由于它自身 3位置-OH 的缺失，至使下位核苷酸的 5-磷酸基无法与之结合。 基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于1977年

5、建立了以双脱氧链终止法为基础来测定DNA序列的方法。 以待测单链或双链DNA为模板，使用能与DNA模板结合的一段寡核苷酸为引物，在DNA多聚酶的催化作用下合成新的DNA链。 反应体系中加入了一种放射性同位素32P或35S标记的双脱氧核苷酸（*-ddATP或*-ddCTP或*-ddGTP或*-ddTTP）后，在DNA合成过程中，标记的*-ddNTP （例如*-ddATP）将与相应的dNTP（例如dATP）竞争掺入到新合成的DNA互补链中。 如果是dNTP掺入其中，DNA互补链则将继续延伸下去；如果是*ddNTP掺入其中，DNA互补链的合成则到此终止。而双脱氧核苷酸的掺入是随机的，故各个新生DNA

6、片段的长度互不相同。 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将混合产物中不同长度DNA片段分离开，再通过放射自显影曝光，根据片段尾部的双脱氧核苷酸读出该DNA的碱基排列顺序。 三、DNA测序的基本策略 1、DNA 片段序列分析的策略片段序列分析的策略 Primer walking 随机测序（random approach），或称作鸟枪法（shotgun strategy） 定向测序 引物步移（引物步移（Primer walking） 原理：原理：从目的片段的一端开始，利用载体上的序列为依据，设计第一次反应的反应引物进行测序，然后，依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，递进测序，直至完成。 该法需要多次设

7、计和合成引物，比较繁琐；对于重复序列较多的目的DNA，由于引物的非特异性结合概率高，所以该方法不适合于测定含有多重复序列的DNA片段。 随机测序（随机测序（random approachrandom approach），），鸟枪法鸟枪法（shotgun strategyshotgun strategy） 原理：原理：将待测 DNA 克隆于噬菌体载体（M13）上，然后通过一定手段将待测 DNA 片断化（DNA 片断化的手段通常有超声波处理和酶切），得到两端彼此重叠的部位不同的若干小片段，再测出每一片段的序列，将各片段的序列依次排列，即能得出总的序列。 定向测序定向测序 基本策略：基本策略：沿着目

8、的 DNA 的同一个方向逐渐向前推进，直至目的 DNA 的另一端。可采用嵌套缺失法或引物步移法。 嵌套缺失法是利用缺失随机突变原理： 先将目的DNA克隆到载体上； 再用限制性内切酶在邻近其一端处切断载体，使之变成3端凹进5端突出的线状DNA； 再用外切酶（exonuclease ）或者DNase 加Mn+离子，沿此末端逐步消化目的DNA，于是只要控制消化时间，即可得到一组依次相差若干碱基，其一端固定于载体另一端游离的目的 DNA 片断； 再经末端修饰，重新连接，即可得到一群一端相同但长度不等的目的DNA克隆。 之后，用同一引物从缺失端开始测序，最后，排列和比较所有子片断的序列，即能得到目的 D

9、NA的全部序列。 用嵌套缺失体进行DNA测序时，各相邻缺失体之间的大小差异必须小于一次测序读取的核苷酸数目，这样才能保证各次测定的序列可以找到部分重叠的序列，从而才能完成序列的拼接 2、测序的基本方案、测序的基本方案 制备双脱氧链终止测序的模板制备双脱氧链终止测序的模板 用于双脱氧链终止测序的模板可以是单链DNA ，双链DNA ， PCR产物，BAC或Cosmid 。 单链 DNA 通常为 M13 噬菌体 DNA（M13mpDNA）， 用于测序的 PCR 产物 DNA 量一般为200-800ng。 在进行测序之前，无论选用何种测序策略，用于测序的模板 DNA 均有必要用溴化乙锭琼脂糖凝胶电泳法

10、确定其纯度和浓度，这是保证测序成功的基本点。 确定测序的引物确定测序的引物 DNA 测序的另一关键在于引物的选择和设计。作为测序引物的寡核苷酸的基本条件主要有以下几点。 引物长度 18-22 碱基； 尽量避免三个以上相同碱基的重复，尤其是 G 或 C； Tm 值约为 55-60（至少要高于 45）； 发夹结构尽量少； 引物自身之间不形成二聚体结构； 用灭菌后的去离子水溶解合成的寡核苷酸引物，配制成 5-10pmol/l 浓度，冷冻保存。 引物浓度可以参考算式计算: pmol/l=100 x A260/（1.54nA + 0.75nC + 1.17nG +0.92nT） A260： 260nm

11、波长时的吸收值。nA：腺嘌呤 A 的数目；nC：胞嘧啶 C 的数目；nG：鸟嘌呤 G 的数目；nT：胸腺嘧啶 T 的数目。 为保证引物纯度，至少应该经过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者纯化度更高的 HPLC 纯化。 3 3、DNA DNA 自动测序和序列的计算机分析自动测序和序列的计算机分析 原理原理 ：基于Sanger双脱氧链终止法的原理，只不过不用同位素标记ddNTP，而是用四种不同的荧光染料分别标记ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基。延伸中的 DNA 互补链分别终止于不同荧光标记的ddATP、ddTTP、ddCT

12、P、ddGTP。 上图为测序仪 ABI Prism 310 Genetic analyzer 实际测得的一段 DNA 序列结果。红色代表 T ；绿色代表 A ；蓝色代表 C ；黑色代表 G 。 377型遗传分析仪型遗传分析仪 3730型遗传分析仪型遗传分析仪 377377型型DNADNA全自动测序仪采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，结合全自动测序仪采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，结合美国应用生物系统美国应用生物系统(ABI)(ABI)公司专利的四色荧光标记，激光检测，公司专利的四色荧光标记，激光检测，一个泳道检测的方法，一个测序反应保证一个泳道检测的方法，一个测序反应保证500bp500bp的准确序列。的准确序

13、列。 37303730型型DNADNA全自动测序仪采用毛细管电泳，速度更快，效全自动测序仪采用毛细管电泳，速度更快，效果更好，通量更大，一个测序反应保证果更好，通量更大，一个测序反应保证800bp800bp的准确序列，是当的准确序列，是当前基因测序的主打。前基因测序的主打。优点：优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点：无

14、法保留原始记录缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上四个反应产物点在一条道上, 相互间会相互间会发生干扰发生干扰, 导致读序时分辨率下降。导致读序时分辨率下降。+光扩增量计算机激光仪(氩离子)窗口DNA序列分析自动化包括两序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指个方面的内容，一是指“分分析反应析反应”的自动化，另一方的自动化，另一方面则是指面则是指“读片过程读片过程”的自的自动化。动化。一、在线分析的核心网站一、在线分析的核心网站http:/http:/bip.weizmann.ac.ilh

15、ttp:/bip.weizmann.ac.il/tools/#primary/tools/#primaryhttp:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ebi.ac.uk/embl/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/http:/www.ddbj.nig.ac.jp/二、本地分析的重要软件二、本地分析的重要软件Vector NTI Suite 6.0Vector NTI Suite 6.0及以上的版本：综合分析、载体分析。及以上的版本：综合分析、载体分析。DNA StarDNA S

16、tar：综合分析：综合分析Primer Premier 5.0Primer Premier 5.0：引物设计：引物设计Oligo 7Oligo 7：寡核苷酸分析，引物计算：寡核苷酸分析，引物计算GCGGCG：蛋白质、核酸序列：蛋白质、核酸序列四、核苷酸序列的生物信息分析四、核苷酸序列的生物信息分析 序列分析序列分析 基因序列的信息分析：例如，两种序列的比较；基因编码领域，启动子或增强子序列的预测；蛋白质序列的氨基酸顺序的预测； 新基因的发现：通过分析 EST（Expressed Sequence Tag）序列，结合 DNA Chip 技术寻找新基因。 基因多型性分析：分析基因多型性特别是SNP

17、（Single Nucleotide Polymorphism），发现并定位功能性基因，作为人类群体，进化，或者疾病关联靶标。 高级结构的预测：根据测序所得到的核酸一级结构的信息，可以预测核酸和蛋白质的二级结构及其三级结构，从而预测其功能。 基因数据库：NCBI，EMBL，DDBJ四、未来的测序技术 1、质谱法质谱法(mass spectrometry)新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅助激光吸收技术使利新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅助激光吸收技术使利用质谱法分析大片段用质谱法分析大片段DNA 成为可能。其中四极离子捕获效果成为可能。其中四极离子捕获效果更好。更好。Fourier转型质

18、谱或飞行时间质谱可进行极转型质谱或飞行时间质谱可进行极 为敏感的为敏感的DNA测序。测序。 2、杂交测序法杂交测序法(seguencing by hybridization,SBH) 杂交测序法是一种创新性的杂交测序法是一种创新性的DNA测序技术，主要是采用一系列测序技术，主要是采用一系列n-mer长的所有可能的寡核苷酸与未知长的所有可能的寡核苷酸与未知DNA靶序列进行杂交，靶序列进行杂交，记录下最适的杂交记录下最适的杂交 片段，然后组装便可获得未知片段的碱基片段，然后组装便可获得未知片段的碱基序列。序列。 3 3、单分子测序法单分子测序法(single-molecule seguencing

19、) 单分子测序法是美国单分子测序法是美国Los Alames国家实验室国家实验室(LANL )发展的一种通过检测标记在单个分子上的发展的一种通过检测标记在单个分子上的荧光进行荧光进行DNA快速测序的方法。快速测序的方法。 模板模板DNA分子首先通过酶法修饰或合成，使不同分子首先通过酶法修饰或合成，使不同的荧光素标记不同的碱基，然后，用两个激光束的荧光素标记不同的碱基，然后，用两个激光束(或或称激光镊子称激光镊子lasertweezer)夹住标记的夹住标记的DN A分分 子，子，将其置于液流系统，从被固定的核苷酸上游端开始将其置于液流系统，从被固定的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸

20、，用外切酶逐一切下被标记的核苷酸， 通过单分子荧通过单分子荧光探测器检测液流中切下的标记核苷酸，再根据检光探测器检测液流中切下的标记核苷酸，再根据检测到的信号顺序确定测到的信号顺序确定DNA顺顺 序。序。 4、原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法(atomic probe microscopy) 80年代发展的原子探针显微镜技术如扫描遂道显微镜年代发展的原子探针显微镜技术如扫描遂道显微镜(scanning tunneling micro scopes,STM)和原子力显微镜和原子力显微镜(atomic force microscopes,ATM)使直接检测使直接检测DNA分子结构分子结构成

21、为成为 可能。可能。STM是由是由IBM Zurich研究所的科学家发明的用来研究所的科学家发明的用来直接观察单分子、单原子结构的技术，最近有人将其应用于直接观察单分子、单原子结构的技术，最近有人将其应用于阅读阅读DNA序列。序列。 5、超薄水平凝胶电泳技术超薄水平凝胶电泳技术(Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis,HUGE) 1990年，年，Swerdlow H首次采用首次采用HUGE技术进行技术进行DNA测序研测序研究。该技术是在单一超薄凝胶平板上放入多道平行样品，在究。该技术是在单一超薄凝胶平板上放入多道平行样品，在超高压电场作用下，通过超高

22、压电场作用下，通过HUGE检测系统进行测序。检测系统进行测序。6、焦磷酸测序、焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术技术 焦磷酸测序（焦磷酸测序（PyrosequencingPyrosequencing）技术是新一代）技术是新一代DNADNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNADNA片段也片段也无须荧光标记，操作极为简便。无须荧光标记，操作极为简便。 PyrosequencingPyrosequencing技术是由技术是由4 4种酶催化的同一反应体种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测

23、序反应中，只加入一种只加入一种dNTP,dNTP,若该若该dNTPdNTP与模板配对，聚合酶就与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（酸基团（PPiPPi）。）。 PPiPPi可最终转化为可见光信号，并由可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTMPyrogramTM转转化为一个峰值。然后加入下一种化为一个峰值。然后加入下一种dNTP,dNTP,继续继续DNADNA链的链的合成。合成。 焦磷酸测序反应过程：焦磷酸测序反应过程：第第1 1步：步：1 1个特异性的测序引物和单链个特异性的测序引物和单链DNADNA模板结合，然后加入模板结合，然后加入酶混合物（包括酶混合物（包括DNA PolymeraseDNA Polymerase、ATP SulfurylaseATP Sulfurylase、LuciferaseLuciferase和和ApyraseApyrase腺苷三磷酸双磷酸酶）和底物混合物腺苷三磷酸双磷酸酶）和底物混合物（包括（包括APSAPS腺苷腺苷5-5-磷酰硫酸和磷酰硫酸和LuciferinLuciferin）。）。 第第2 2步：向反应体系中加入步：向