血吸虫病免疫诊断技术规范{

1、血吸虫病免疫诊断技术血吸虫病免疫诊断技术标准标准三、间接红细胞凝集试验三、间接红细胞凝集试验( IHA)( IHA)操作规程操作规程 1 1 根本原理根本原理 抗原吸附于经适当处理的红细胞外表，使红细胞致敏。致抗原吸附于经适当处理的红细胞外表，使红细胞致敏。致敏红细胞与病人血清中特导性抗体抗敏红细胞与病人血清中特导性抗体抗SEASEA特异性抗体相特异性抗体相遇时，在适宜的条件下电解质、温度、遇时，在适宜的条件下电解质、温度、pHpH，抗原与特导，抗原与特导性的抗体相结合，使红细胞出现肉眼可见的凝集反响。为正性的抗体相结合，使红细胞出现肉眼可见的凝集反响。为正向间接凝集。向间接凝集。2 冻干致敏

2、红细胞的制备工艺u 血吸虫虫卵抗原制备u 红细胞醛化u 红细胞鞣化u 红细胞致敏u 致敏红细胞的冰冻枯燥 u 致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用23天。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，先用甲醛或戊二醛，再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60加热，可长期保存而不溶血。并可反复冻融不破碎，在4可保存36个月，在20可保存一年以上。3 实验操作准备1) 穿戴好工作服、口罩和手套等，做好根本实验准备工作。2 实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期符合产品说 明；器材符合相关质量要求。3) 检查完毕后，按照实验常规要

3、求摆布好实验试剂和器材。4 实验试剂和器材准备实验试剂盒：1. 冻干致敏红细胞红瓶 2. 致敏红细胞稀释液蒸馏水、红瓶 3. 标本稀释液生理盐水、兰瓶 4. 阳性对照品冻干品、红色 5. 阴性对照品冻干品、兰色 6. 使用说明书 l 器材：l 1. 移液器100l一支、1000l1ml 一支、配套吸头、吸头盒及移液器架等l 2. “V型反响板一块、白纸一张、记号笔l 3. 旋转震荡器一台l 4. 温箱一台l 5. 实验记录纸、记录笔、废弃物杯l 5) 实验准备要求：l 待检血清或血浆要新鲜，不能有溶血或混有红细胞。l 应选择“V型，底角为90度的反响板。不要选择“U型及不同底角的“V型反响板。

4、l “V型反响板要清洁、不潮湿，反响孔完好光洁。l 试剂盒在有效期内4 实验操作步骤1) 样本编号，从左到右按1n号排列。2 取一块96孔“V型反响板横向平放纵向使用。 血凝反响板编号：1横 向行从左到右编号：1、2、3、阴、阳； 2 纵向列从上 到下编号：1:5、1:10、1:20、1:40。3 稀释对照品：阴性对照、阳性对照品各加100l蒸馏水稀释溶解，加盖混 匀后放回原处备用。4 配置致敏红细胞悬液：启开安瓶，以每支冻干致敏红细胞加1ml致敏红细 胞稀释液蒸馏水、红瓶稀释混匀备用。5) 启开标本稀释液生理盐水、兰瓶安瓶。6 调节移液器为100l。血凝反响板的第1行横向第1孔各加标本稀释液

5、 100l。7 调节移液器为25l。血凝反响板的纵向列第24孔各加标本稀释液 25l。加液完毕，检查每孔是否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。 8 于第一排第1孔加1号待测血清25l，加完血清盖上盖子放回原处， 充分混匀吸打4次，混匀吸打在第一档进行，移液吸头不能触碰反响孔 底壁 ,使血清成15稀释。加血清时要核对一下样本编号防止加错 位。9 在第1孔吸出25l于第2孔纵向，同上混匀使血清成1:10稀释。后吸出 25l于第3孔纵向，同上混匀使血清成1:20稀释。后吸出25l于第4 孔纵向，同上混匀使血清成1:40稀释,后吸出25l弃去，自动卸去吸头。 同上操作进行第2n号样本、阴性对照、阳性对照

6、倍比稀释。倍比稀释 一个样本一个吸头。10 全部样品及对照倍比稀释完成后，调节移液器为75l，然后在第一行纵 列第一孔吸取75ml弃去，一个样本一个吸头。11) 检查每孔液面是否在同一高度，否那么应及时纠正。 12 充分混匀致敏红细胞悬液每加假设干次要混匀一次，然后在每孔加致敏红细胞 悬液25l原那么上以每个样品为单位即列为单位加液，不需换吸头，但不能 触碰反响板，自动卸去吸头。13 先试一试震荡器，正常运转后将反响板震摇12分钟，盖上盖子，置37 (水 浴)30min后下垫白纸观察结果。并做好记录。14 记录结果后，实验台面清理：未使用试剂、未使用吸头、移液器刻度复原至最 高档等放回原处；实

7、验废物放入规定的收集器内。5 结果判定1首先应观察对照管：阴性对照应不出现凝集现首先应观察对照管：阴性对照应不出现凝集现象，阳性对照应出现象，阳性对照应出现凝集现象，结果方可成立。如出现异常那么说明凝集现象，结果方可成立。如出现异常那么说明实验操作有误或血球实验操作有误或血球本身有自凝现象，试验结果不能成立。本身有自凝现象，试验结果不能成立。2根据红细胞凝集程度以根据红细胞凝集程度以“，“，“，“记录结果，以呈记录结果，以呈“凝集的血清最高稀释度作凝集的血清最高稀释度作为血清的效价为血清的效价,以效价以效价1:10作为阳性判断标准。作为阳性判断标准。3报告形式：报告形式：1:40阳性阳性4血凝

8、反响强度的判定如下： ：红细胞全部下沉在孔底，形成肉眼可见紧密、边缘光滑的小圆点。 ：多数红细胞下沉在孔底形成圆点，周围可见少量凝集红细胞，肉眼见周边模糊(或中间出现较为明显的空白点) 。 ：孔底中心可见少量红细胞下沉的小圆点，多数凝集红细胞在孔底周围形成小薄层：红细胞形成薄层凝集,边缘呈现不规那么的皱褶。6 本卷须知1 结果观察时不能移动反响板，如条件限制那么要非常小心慢移，切勿摇动反响板，以免凝集分 散，影响结果判断。结果观察时下垫白纸。2 血凝板以96孔“V型底角应为90度有机玻璃板为适宜，确保所用器材清洁,血凝板清洗不能 用毛刷、移液吸头不能触碰反响孔,以防止损坏反响孔,造成假阳性。

9、3 待测血清或血浆不能混有红细胞或被细菌污染。标本不能及时检测可在内4度保存2 3 天。长时间保存应放冰箱冻存。4 结果判断的时间与温度有关，应根据作业指导书在相同温度相同时间条件下判断。 5 使用加样器加样，每测1个样本要更换滴头，在倍比稀释待检血清中，混匀时应防止产生气泡 混匀吸打都在第一档进行而影响吸量准确性。6 试剂盒于28避光保存。自检定合格之日起有效期为2年。醛化红细胞能耐60加热，并可 反复冻融不破碎，在4可保存36个月，在20可保存一年以上。从冰箱取出使用时先要 放室湿平衡一定时间。1 根本原理 血吸虫病患者血清中存在的抗血吸虫抗体IgG与胶体染料标记的日本血吸虫可溶性虫卵抗原

10、SEA)相结合，形成染料标记的抗原抗体复合物，这复合物通过层析技术与固定在硝酸纤维膜上的抗人IgG二抗相结合，形成可见的染色带，即为阳性反响。四、胶体染料试纸条法四、胶体染料试纸条法DDIA操作规程操作规程2 实验操作准备1) 穿戴好工作服、口罩和手套，做好根本实验准备工作。2 实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期符合产品 说明；器材符合相关质量要求。3) 检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4 实验试剂和器材 实验试剂盒：1. 染料标记液2. 试纸条 3. PVC小杯 4. 使用说明书 器材：1. 移液器50l一支、吸头、吸头盒及移液器架等2. PVC小杯架、废弃物杯

11、3. 实验记录纸、记录笔、记号笔5 要求：1 待检血清要新鲜，不能有溶血或混有红细胞3 实验操作1 样本编号1n号，并从左到右按1n号排列。2 取PVC小杯架子，装上PVC小杯下垫白纸3 编号： 横向行标在小杯架子上从左到右编号：1、2、3、 。做好相应 实验记录。4 轻轻颠倒混匀染料标记液，确保沉淀完全被混悬。5 调节移液器为50l。根据样品数每小杯加50l染料标记液至PVC小杯中。加液完毕，检查每孔是 否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。6 调节移液器为20l。分别加20l待检血清加血清时要核对一下样本编号防止加错位，每个样 本缓缓混匀吸打4次，混匀时应防止产生气泡。整板样本加完后，检查每孔

12、是否有漏加孔或加 双倍孔，并及时纠正。7 将整板放手上轻轻震荡，加血清一分钟含混匀时间后加试纸条。8 取试纸条插入小杯中，待小杯内反响液吸干后观察结果15分钟。9 在光线充足但非强光下观察，正面面向试纸条观察阳性检测带一般 在对照带下0.9cm处，插入杯底斜靠时一般在PVC小杯上沿略上处，防 止误判，观察结束放回原处，记录结果。 10实验台面清理：未使用试剂、未使用吸头、移液器刻度复原至最高 档等放回原处；实验废物放入规定的收集器内。4 要求1标记液混均要轻，倒置时没有沉淀物后再颠倒2次；2一个样品一支吸头；加血清时要集中注意力切不可漏加或跳管或重叠；3取试纸条时，用手捏住吸水垫较长的一端，严

13、禁触摸检测膜或倒捏。4试纸条一定要入杯底。5试纸条面向自己排列整齐、一次放好，在结果观察前严禁触碰试纸条和小杯架，也不要做台面清洁工作，防止试纸条顷倒；6 观察结果时要注意光线、方向，不要刻意判断，防止将“固相二抗的折光误判阳性。5 结果判断l 阳性反响：1检测带和对照带都出现紫蓝色带。l 2检测带出现深紫蓝色带反响强，对照带显色减l 弱甚至不显色。l 阴性反响：对照带出现紫蓝色带而检测带无显色带。l 无效：检测带和对照带都不出现显色带。l 6 储存条件及有效期l 试剂盒保存于4 - 8，防止冷冻。 有效期6个月。五、酶联免疫吸咐试验五、酶联免疫吸咐试验ELISA操作规程操作规程1 1 根本原

14、理根本原理1) 抗原日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA以物理性地吸附于固相载体聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板外表包被，并保持其免疫学活性；2) 加待检标本有相应的特异性抗体一抗，即与固相上抗原结合，形成抗原抗体复合物。3) 加酶标记的二抗形成Ag-Ab1-Ab2*HRP三联复合物第二抗体通过共价键与酶连接形成酶结合物-辣根过氧化物酶HRP标记结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 4) 洗涤后加底物和显色剂H2O2的邻苯二胺OPD或四甲基联苯胺TMB，酶结合物中的酶再催化底物和显色剂反响，产生显色反响。5) 根据参加底物的颜色反响来判定是否有免疫反响的存在，而且颜色反响的深浅是与标本中相应抗

15、原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。 2实验操作准备实验操作准备1) 穿戴好工作服、口罩和手套，做好根本实验准备工作。2) 实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期检查符合产品说明；器材符合相关质量要求。3) 检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4 实验试剂盒(康百得)：1预包被板 SEA预包被聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板 48T/96T2酶结合物1号液 辣根过氧化物酶HRP标记结合物 1支3洗涤液2号液 1支4底物3号液 四甲基联苯胺TMB 1支5显色剂4号液 H2O2 1支6样本稀释液5号液 1支7终止液6号液 硫酸H2SO4 1支8阳性对照品冻

16、干品 1支9临界对照品冻干品 1支10阴性对照品冻干品 1支11使用说明书 1份5实验器材： 移液器20l、100l、1000l各一支、200l、1000l吸头及吸头盒和移液器架样品稀释板 酶标板架塑料洗瓶装蒸馏水恒温水浴箱一台吸水纸、废弃物杯实验记录纸、记录笔、记号笔、剪刀6血清样本检查，要求：1 待检血清要新鲜，不能有溶血或混有红细胞或脂血或严重黄胆或已污染，3操作程序操作程序1 样本编号：样本编号1n号，排列，并做好记录。2 样品稀释板编号：选取一块样品稀释板横向平放纵向使用。 横向行从左到右编号：1、2、3、.3 样本稀释： 样品稀释板内每孔参加样本稀释液5号液500l，根据样本数一次

17、全部加完。分别参加待检测血清5l待检测血清按1：100稀释，充分混匀吸打4次。4阴性、临界、以及阳性对照每支参加300l蒸馏水复溶，充分溶解后放置样品稀释板边以阴性、临界、阳性对照品排列。5加样反响：取预包被板放入板架内，安好，标记好或安排好样品与对照位置，并做好记录。样本检测孔第1-n孔每孔分别加已稀释样本血清100l，取样时要将样品吸打几次混均后再吸。每板最后依次为阴性、临界、阳性及空白对照孔，分别参加复溶后的阴性、临界、阳性对照液及样本稀释液5号液各100l。6置37水浴箱避光反响30分钟后甩去孔内液体。7 洗涤： 每孔加洗涤液2号液1滴(滴瓶垂直加液，下同)，立即用蒸馏水注满首次加蒸馏

18、水时尽量不要溢出孔外，以免抗体溢出到临孔，静置30秒后甩去，再直接用蒸馏水洗涤四次，每次均需静置30秒。最后一次甩去拍干。8加酶反响: 除空白对照孔外其余每孔加酶结合物1号液2滴，置37水浴箱避光反响30分钟后甩去孔内液体，如上洗涤，拍干关健操作：要洗涤到位并拍干，否那么可能产生假阳性。9显色反响：加底物3号液1滴。加显色剂4号液1滴，混匀轻轻敲打。置37水浴箱避光显色10分钟。初步观察，做好预记录。加终止液6号液1滴，混匀，终止反响加终止液后蓝色会变为黄色，无色的仍然无色。置白纸上观察结果。4结果判断结果判断1 肉眼观察： 空白无色，阴性对照无色或接近无色，临界对照呈浅黄色，阳性对照呈明显黄

19、色，表示实验有效。待检孔无色或呈浅于临界对照孔的微黄色表示该标本为阴性，待检孔呈深于临界对照空的黄色表示该标本为阳性。2仪器判断： 以空白对照调零，用酶标仪于450nmTMB620nm作参比波长读取OD值，待检孔OD值大于阴性对照P/N2.1倍者为阳性。当阴性对照OD值低于0.05时按0.05计算。3结果记录目测判读结果 B1-7,10-11,D1-2为正常血清，B8、9,12及D3、4为血吸虫病人血清；D5阴参，D6临界，D7阳参，D9空白病人血清阴参临界阳参正常人血清31加2M H2SO4后32 B1-7,10-11,D1-2为正常血清，B8、9,12及D3、4为血吸虫病人血清；D5阴参，

20、D6临界，D7阳参，D9空白测定OD值335本卷须知本卷须知1试剂盒在2-8保存，冰冻失效、温度过高保存活性降低。每次取出时先平衡至室温后使用。滴瓶每次用后一定要将盖拧紧，各瓶盖之间切不可混用。各试剂盒之间不可混用。2洗涤时将蒸馏水加满孔内，每次停放30秒钟后，甩去孔内液体。禁用自来水等其他水源。3为提高实验的可比性建议使用仪器判读结果，并对阴性对照测复孔以减少误差。4洗涤要彻底，特别是酶结合物反响后，洗涤一定要充分；5OPD对光非常敏感，应避光反响；结果应尽快检测6酶标反响均应在湿盒中进行。六、斑点免疫金渗滤法六、斑点免疫金渗滤法DIGFA操作规程操作规程1试验原理试验原理 将抗原日本血吸虫

21、可溶性虫卵抗原SEA包被于硝酸纤维素薄膜 (微孔滤膜)上,滴加在膜上的待检血清通过滤膜时，其中的抗体与膜上的抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，形成抗原抗体复合物。然后，红色胶体金颗粒标记的第二抗体所形成的金标探针，与复合物中的抗体结合，滞留在反响板上，形成肉眼可见的红色斑点。3实验操作准备实验操作准备1) 穿戴好工作服、口罩和手套，做好根本实验准备工作。2) 实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期检查符合产品说明；器材符合相关质量要求。3) 检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4实验试剂盒：1预处理空白反响板(含质控点)2洗涤液3金标抗体液 4使用说明书 5器材：1. 移液

22、器50l、200l吸头、吸头盒及移液器架2. 实验记录纸、记录笔、记号笔。6被检样血清检查，要求：本方法对待检血清要求高，要仔细检查，详见本卷须知。4 操作程序1 将试剂盒、试剂取出，置予室温下平衡2 样本编号：样本编号1n号，从左到右按1n号排列，并作好记录。3 取n块预处理空白反响板(含质控点)放好并编号。4 按顺序每次取2块板，依次在反响孔中间位置参加2滴洗涤液，待液体完全渗透5 依次在每块板反响孔正中间垂直参加25l新鲜特检血清对应编号，待血清完全渗透。关健操作：1、如没完全渗透就加液可呈假阴性，但过干后再加液那么呈假阳性。2、完全渗透的标准是膜上特别是孔周边折光液体消失6 依次在每块

23、板参加2滴洗涤液，待液体完全渗透。7 依次在每块板参加4滴金标抗体液，待液体完全渗透。8 依次在每块板参加2滴洗涤液，待液体完全渗透，观察结果。9 按顺序取下一轮2块板，同上进行第3和第4份、第5和第6份、样本检测。10 样品全部检测完成后复查结果但必须控制在1小时内，并记录。11清理台面，移液器调至最高档。5 结果判断 判断结果的时间应以完成操作后，即时观察为准。局部品种在放置数小时或1日后，结果会发生变化1出现两个红色圆点为阳性；2出现一个红色圆点为阴性；3无圆点呈白板状表示试剂失效或操作有误，应当重新测试6 本卷须知l 1本试验对血清标本要求高，最好应用新鲜血清。测定血清标本要求离心别离

24、以消除血脂的影响(4000转分，15分钟或8000转l分，5分钟)，不宜用未稍采血塑料管法样本。吸取血清标本时，应避开血脂、纤维蛋白或沉淀等，取其清亮透明局部。l 2试剂盒从冰箱取出后应恢复至室温才能使用，试剂盒最正确使用温度是3037。l 3以2个样本为一批依次进行操作。血清样品加样时，应在反响孔的正上方垂直加样。l 4待反响板上的液体完全渗透后，立即参加下一种液体。既要防止渗透不全，又须防止反响膜枯槁是本试验操作的关键。在加液时应防止出现气泡，尤其是金标液。l 5判断结果以即时观察为准假设较长期保存，将反响板正面朝下放置即可。l 6于2-8冷藏保存，切勿冷冻应当防止强烈光照和高温。检测完毕后,未用的反响板要立即放入自封袋中密闭冷藏。七、移液器的使用规程七、移液器的使用规程1 量程的调节在调节量程时，逆时针或顺时针按照正常的调节方法，旋转旋钮即可;在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否那么会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。2 枪头(吸液嘴)的装配方法是将移液枪(器)垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。如果是多道(如8道或12道)移液枪，那么可以将移液枪的第一道对准第一个枪头，然后倾斜地插入，往前前方向摇动即可卡紧。3 移液的方法u 移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于相同温度。u 吸取液体时，移液