第十章：分子生物学研究方法

1、第十章 分子生物学研究方法克林顿克林顿“拉链门拉链门”事事件件第一节、PCR技术的基本原理PCR (Polymerase chain reaction)：聚合酶链式反应：聚合酶链式反应将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术将极微量的生物标本化为可供鉴定的现代技术目的片段目的片段ATCG引物1引物2DNA聚合酶大量扩增得到大量扩增得到的的DNA片段片段 PCR的最早设想 Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因”。 PCRPCR的实现的实现19851985年美国年美国PE-CetusPE-Cet

2、us公司人类遗传公司人类遗传研究室的研究室的Mullis Mullis 等发明了聚合酶等发明了聚合酶链反应。其原理类似于链反应。其原理类似于DNADNA的体内的体内复制。复制。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。其缺点是： PCRPCR的改进与完善的改进与完善Klenow酶不耐高温，酶不耐高温， 90会变性失活，会变性失活，每次循环都要重新加。每次循环都要重新加。引物链延伸反应在引物链延伸反应在37下进行，容易发生下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物产物特异性较差，合成的特异性较差，合成的DNA片

3、段不均一。片段不均一。 19881988年初，年初，KeohanogKeohanog改用改用T4 DNAT4 DNA聚聚合酶进行合酶进行PCRPCR，其扩增的，其扩增的DNADNA片段很片段很均一，真实性也较高。但每循环一均一，真实性也较高。但每循环一次，仍需加入新酶。次，仍需加入新酶。 耐热耐热TaqTaq酶的发现酶的发现19881988年年Saiki Saiki 等从温泉中分离的一株等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌水生嗜热杆菌thermus aquaticus thermus aquaticus 中中提取到一种耐热提取到一种耐热DNADNA聚合酶。聚合酶。耐高温；耐高温；在热变性时不会被钝

4、化。在热变性时不会被钝化。提高了扩增片段特异性和扩增效率，增提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度。加了扩增长度。将此酶的发现使将此酶的发现使PCRPCR广泛的被应用。广泛的被应用。此酶具有以下特点：此酶具有以下特点： PCR PCR技术的基本原理技术的基本原理PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction）即聚）即聚合酶链式反应，是指在合酶链式反应，是指在DNADNA聚合酶催化下，聚合酶催化下，以母链以母链DNADNA为模板，以特定引物为延伸起点，为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出通

5、过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板与母链模板DNADNA互补的子链互补的子链DNADNA的过程。的过程。 PCRPCR反应成分反应成分模板模板DNADNA引物引物四种脱氧核糖核苷酸四种脱氧核糖核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶反应缓冲液、反应缓冲液、MgMg2+2+等等 PCRPCR反应基本步骤反应基本步骤预变性（预变性（pre-denaturationpre-denaturation）变性（变性（denaturationdenaturation）退火（退火（anneallingannealling）延伸（延伸（extensionextension）总延伸（总延伸（extensione

6、xtension）循环数循环数 PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理模板DNA引物1引物2ATCGDNA聚合酶反应缓冲液、Mg2+60729435Target Sequence607294Pre-denaturation607294Begin cycle 1Step 1607294A A T T C G T CT T A A G C A GT A C G T T G T CA T G C A A C A G55553333Primer 1Primer 2Each primer binds specifically to the 3 end of the target sequence on

7、 the appropriate strands of DNA.Step 260729455553333Primer 1Primer 2Taq polymerase60 / 72Free nucleotides6072945step 355533555533End cycle 1Begin cycle 260729455553333Step 155553333607294Primers attach to the 3 end of the target seqence.Step 255553333607294Polymerase extends the primers.60 / 7255553

8、3334 longer length molecules. End cycle 2607294Step 3Begin cycle 36072945555333355553333Step 15555333355553333607294Primers attach to the 3 end of the target seqence.Step 2Step 355553333555533336072942个目标片段个目标片段55553333555533332个目标片段个目标片段Cycle 44个目标片段个目标片段4个目标片段个目标片段By the end of cycle 30, there wil

9、l be 1,073,741,766 target molecules.琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA、cDNAcDNA及其微量的模板就可用于扩增。及其微量的模板就可用于扩增。 PCR技术的具体操作技术的具体操作 模板的制备模板的制备l掌握掌握PCRPCR引物设计的原则引物设计的原则 引物设计的总原则就是提高扩增的引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。效率和特异性。 PCRPCR 引物设计引物设计l掌握引物设计的方法掌握引物设计的方法手工设计和计算机软件设计引物：手工设计和计算机软件设计引物：以基因或以基因或cDNAcDNA的的5353方向的单方向的单链为标准，确定待扩

10、增片段两侧的链为标准，确定待扩增片段两侧的引物序列。引物序列。5-ATTAGGCACGGT CTATTGGGCAA-3 5-ATTAGGCACGGT GATAACCCGTT-5 5-TTGCCCAATAGPrimer 1Forward primerPrimer 2Reverse primerPCR扩增的基本方法扩增的基本方法PCRPCR反应的成分和作用反应的成分和作用 l无无MgMg2+2+ bufferbuffer（MgMg2+2+ free free）：）：PCRPCR反反应的缓冲液：由纯水、应的缓冲液：由纯水、KClKCl、TrisTris组组成。其目的是给成。其目的是给Taq DNAT

11、aq DNA聚合酶提供聚合酶提供一个最适酶催化反应条件。一个最适酶催化反应条件。lBSABSA：有助于酶的稳定。：有助于酶的稳定。lMg2+Mg2+ ：Taq Taq 酶具有酶具有 Mg2+Mg2+依赖性。依赖性。l底物（底物（dNTPsdNTPs）l引物：浓度一般为引物：浓度一般为0.10.10.5M0.5M，过，过高会引起错配和非特异扩增，增加高会引起错配和非特异扩增，增加引物之间形成引物二聚体，产量降引物之间形成引物二聚体，产量降低；浓度过低则得不到产物或产量低；浓度过低则得不到产物或产量过低。过低。引物二聚体引物二聚体lTaqTaq酶酶-不同的不同的DNA polymeraseDNA

12、polymerase活性不同，可依据实验的目的选活性不同，可依据实验的目的选择不同的酶。择不同的酶。l模板：模板：PCRPCR对模板对模板DNADNA的纯度不要求很的纯度不要求很高，但应尽量不含有对高，但应尽量不含有对PCRPCR反应有抑反应有抑制作用的杂质。存在过高：非特异产制作用的杂质。存在过高：非特异产物增加；过低：产量降低。物增加；过低：产量降低。从人基因组从人基因组DNA中扩增出的中扩增出的15kb的大片段的大片段tPA基因，基因， M-分子量标准，分子量标准，1-25ng模板；模板；2-5ng模板；模板；3-1ng模板。模板。 PCRPCR反应条件的选择（影响因素）反应条件的选择（

13、影响因素）94 25 min94 40 sec55 40 sec72 1 min72 10 min2530 cyclesPCRPCR扩增仪扩增仪 l没有扩增产物没有扩增产物 PCRPCR常见问题常见问题 循环温度：变性温度、退火温度循环温度：变性温度、退火温度引物设计引物设计DNADNA聚合酶活性聚合酶活性抑制性成份抑制性成份( (蛋白酶、核酸酶、其它蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合酶活性的成份抑制聚合酶活性的成份) ) DNADNA样品样品 l非特异产物及电泳呈涂布状非特异产物及电泳呈涂布状 MgMg2+2+ 浓度浓度调整引物、模板、聚合酶的用量调整引物、模板、聚合酶的用量适当减少循环数适当减少

14、循环数适当提高退火温度，缩短退火或延伸适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间时间 55 57l引物二聚体的形成引物二聚体的形成检查引物的序列检查引物的序列提高退火温度提高退火温度调整引物与模板浓度调整引物与模板浓度增加引物长度增加引物长度 l实验器材应一次性使用（实验器材应一次性使用（tiptip头、头、PCRPCR管）管）l注意操作环境，戴一次性手套注意操作环境，戴一次性手套 l严格严格PCRPCR操作规程操作规程l多次取样的试剂应分装多次取样的试剂应分装l设置阴性对照和阳性对照设置阴性对照和阳性对照 l假阳性结果的预防假阳性结果的预防 第二节、第二节、 PCRPCR相关技术相关技术 逆转录逆

15、转录PCRPCR （reverse transcription PCRreverse transcription PCR，RT-PCRRT-PCR）RT-PCRRT-PCR是将是将mRNAmRNA的反转录（的反转录（RTRT）和）和cDNAcDNA的聚合酶链式扩增（的聚合酶链式扩增（PCRPCR）相结）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从合的技术。首先经反转录酶的作用从mRNAmRNA合成合成cDNAcDNA，再以，再以cDNAcDNA为模板，扩为模板，扩增合成目的片段。增合成目的片段。 RT-PCR的原理的原理 RT-PCRRT-PCR的步骤的步骤两步法两步法RT-PCRRT-PCR 第一步

16、：逆转录反应第一步：逆转录反应 RNA Oligo(dT)18混匀，离心，混匀，离心，70 10 min70 10 min，然后立即冰浴。然后立即冰浴。 依次加入下列溶液：依次加入下列溶液：M-MLV Buffer，dNTP，RNasin，M-MLV加水补足总体积。加水补足总体积。混匀，离心，混匀，离心，37 / 42 1-2h70 15min（破坏（破坏MLV）直接进行直接进行PCR反应反应或放置或放置-20保存。保存。一步法一步法RT-PCRRT-PCR 热启动聚合酶链式反应（热启动聚合酶链式反应（Hot start PCRHot start PCR）是一种改良的聚合酶链式反应方法，主要是

17、一种改良的聚合酶链式反应方法，主要用来避免操作过程中产生非特异性序列的用来避免操作过程中产生非特异性序列的扩增。将扩增。将DNADNA聚合酶与其他反应物隔绝，聚合酶与其他反应物隔绝，或是使用在高热状况下才会活化的聚合酶，或是使用在高热状况下才会活化的聚合酶，避免在未达到设定温度前就开始反应。避免在未达到设定温度前就开始反应。蜡隔绝法：将除了聚合酶以外的反应蜡隔绝法：将除了聚合酶以外的反应物加入物加入PCRPCR管后，加滴熔融的石蜡；待管后，加滴熔融的石蜡；待石蜡凝固后再加入聚合酶。放入石蜡凝固后再加入聚合酶。放入PCRPCR仪仪开始反应升温后，石蜡融化浮至最顶开始反应升温后，石蜡融化浮至最顶层

18、，聚合酶才与其他反应物混合。石层，聚合酶才与其他反应物混合。石蜡可同时作为防止蒸发用。蜡可同时作为防止蒸发用。 热启动热启动PCR有几种方式：有几种方式：热启动聚合酶（化学型）：经过化热启动聚合酶（化学型）：经过化学分子修饰的聚合酶，高热下结构学分子修饰的聚合酶，高热下结构改变而启动。改变而启动。 热启动聚合酶（抗体）：带有针对热启动聚合酶（抗体）：带有针对聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体聚合酶的免疫抗体，高热下使抗体分离而启动。分离而启动。热启动聚合酶（共价键结）：改良热启动聚合酶（共价键结）：改良自抗体型，使用小分子的化合物，自抗体型，使用小分子的化合物，阻塞聚合酶作用位置，高温下分离。阻塞

19、聚合酶作用位置，高温下分离。逆转录酶（逆转录酶（reverse transcriptasereverse transcriptase）是存）是存在于在于RNARNA病毒体内的依赖病毒体内的依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。这种酶是这种酶是19701970年美国科学家特明和巴尔的摩年美国科学家特明和巴尔的摩分别于动物致癌分别于动物致癌RNARNA病毒中发现的，他们并病毒中发现的，他们并因此获得因此获得19751975年度诺贝尔生理学或医学奖。年度诺贝尔生理学或医学奖。 该酶具有依赖该酶具有依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶活性：以聚合酶活性：以RNARNA为模板合成为模板合成c

20、DNAcDNA第一条链。第一条链。 RT-PCRRT-PCR反应的主要成分和作用反应的主要成分和作用RTRT的引物的引物 随机引物：适用于长的或具有发卡结随机引物：适用于长的或具有发卡结构的构的RNARNA。适用于。适用于rRNArRNA、mRNAmRNA、tRNA tRNA 等所有等所有RNARNA的反转录反应。主要用于的反转录反应。主要用于单一模板的单一模板的RT-PCRRT-PCR反应。反应。 OligoOligo（dTdT）：）：适用于具有适用于具有PolyA尾尾巴的巴的RNA（原核生物的（原核生物的RNA、真核、真核生物的生物的 rRNA和和tRNA不具有不具有PolyA尾巴）。由于

21、尾巴）。由于Oligo（dT）要结合到）要结合到PolyA 尾巴上，所以对尾巴上，所以对RNA样品的样品的质量要求较高，即使有少量降解也会质量要求较高，即使有少量降解也会使全长使全长cDNA合成量大大减少合成量大大减少. 基因特异性引物：基因特异性引物：与模板序列互补的与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。引物，适用于目的序列已知的情况。分离高质量分离高质量RNARNA 提高提高RT-PCRRT-PCR灵敏度灵敏度28S RNA18S RNA5S RNA260nm - 核酸核酸 320nm - 背景（溶液浑浊度背景（溶液浑浊度) 230nm - 盐浓度盐浓度 280nm - 蛋白质等

22、有机物蛋白质等有机物OD260/OD280（R）= 1.82.0R2.2 - RNA 已经被水解成了单核苷酸已经被水解成了单核苷酸RNA 浓度浓度=(OD260-OD320)稀释倍数稀释倍数0.04 g/l。 不同的逆转录酶合成不同的逆转录酶合成cDNAcDNA的能力不同的能力不同 cDNA总量全长cDNA总量原因在于其中的原因在于其中的RNase HRNase H活性的强弱。活性的强弱。使用无使用无RNaseHRNaseH活性的逆转录酶活性的逆转录酶提高逆转录酶保温温度：较高的保温提高逆转录酶保温温度：较高的保温温度有助于温度有助于RNARNA二级结构的打开，增加二级结构的打开，增加了反应的

23、产量。了反应的产量。PCR反应产物反应产物减少基因组减少基因组DNADNA污染污染 可在逆转录之前使用扩增级的可在逆转录之前使用扩增级的DNaseDNase对对RNARNA进行处理以除去沾染的进行处理以除去沾染的DNADNA。设计对照实验鉴定是否存在设计对照实验鉴定是否存在DNADNA污染。污染。DNAcDNAExon 1 Exon 2引物引物 反向反向PCRPCR（inverse PCRinverse PCR）用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。实验时选择已知序列内部没有序列的片段。实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段切点的限

24、制性内切酶对该段DNADNA进行酶切，然进行酶切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接，再用一对反向的引物进行接，再用一对反向的引物进行PCRPCR，其扩增产，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究。进行分析研究。 多重多重PCR（multiplex PCR）多重多重PCRPCR是在同一是在同一PCRPCR反应体系里加上反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的段的PCRPCR反应，多对引物同时对模板反应，多对引物同时对模板DNADNA上的多个区域进

25、行扩增。上的多个区域进行扩增。 概念概念在于其多对引物的设计，必需保在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板区域具有高体，引物与目标模板区域具有高度特异性。度特异性。 技术难点技术难点 应用应用应用于基因诊断，对与疾病相关的基因应用于基因诊断，对与疾病相关的基因（庞大）进行扩增检测。（庞大）进行扩增检测。 差别差别PCRPCR（differential PCRdifferential PCR）差别差别PCRPCR是将靶基因与已知拷贝的参照是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一基因置于同一PCRPCR反应体系中，用同一反应体系中，用同

26、一套引物进行扩增，电泳染色后可根据套引物进行扩增，电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。产物的相对丰度对待测基因进行定量。 原位原位PCRPCR（In situ PCRIn situ PCR） 原位原位PCRPCR是指在组织或细胞标是指在组织或细胞标本片上直接进行本片上直接进行PCRPCR，对细胞中的，对细胞中的靶靶DNADNA进行扩增，通过掺入标记基进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。检测的方法。 概念概念可分为直接法和间接法。可分为直接法和间接法。基本步骤：组

27、织切片或细胞固定基本步骤：组织切片或细胞固定蛋蛋白酶消化白酶消化原位原位PCRPCR扩增扩增冲洗冲洗产物产物检测检测优点：灵敏度高，可进行细胞内定位优点：灵敏度高，可进行细胞内定位 方法方法 荧光定量荧光定量PCRPCR（FQ-PCRFQ-PCR）标记有荧光报告基团和荧光淬灭基标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，结合先进的光谱检测技术发展团，结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术。起来的一项新技术。 概念概念主要原理是在待扩增区域结合上主要原理是在待扩增区域结合上DNA探针，探针，PCR过程中，具有过程中，具有53外切酶活性的外切酶活性的Taq酶延伸引物链到酶延伸引物链到DNA探针时，将探针

28、时，将DNA探针探针逐个降解，释放出荧光报告基团，这样逐个降解，释放出荧光报告基团，这样PCR体系中荧光的强度与体系中荧光的强度与PCR产物量之间产物量之间存在正比关系，可通过测定荧光强度而对存在正比关系，可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。产物定量。 原理原理 荧光定量荧光定量PCRPCR的优点的优点可进行准确的定量检测。用于基因可进行准确的定量检测。用于基因诊断。诊断。定量范围宽。定量范围宽。特异性更强，克服了假阳性。特异性更强，克服了假阳性。操作简单快速，无须后处理和电泳操作简单快速，无须后处理和电泳检测。检测。安全，技术易于学习，易于进行电安全，技术易于学习，易于进行电脑化数据管理。

29、脑化数据管理。 遗传性疾病的基因诊断遗传性疾病的基因诊断 传染病的诊断传染病的诊断( (肝炎病毒肝炎病毒) ) 癌基因检测癌基因检测 法医学法医学( (亲子鉴定亲子鉴定) )上的应用上的应用第三节、第三节、PCRPCR技术的应用技术的应用 DNADNA测序测序 基因克隆基因克隆 引入基因点突变，基因融合等引入基因点突变，基因融合等 遗传病的诊断遗传病的诊断 基因缺失、插基因缺失、插入或置换等入或置换等地中海贫血地中海贫血珠蛋白链合成不珠蛋白链合成不平衡平衡PCR-RFLPPCR-RFLP法：法：限制性内切酶限制性内切酶 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）RasRas基因基

30、因突变突变限制性内切酶限制性内切酶 亲子鉴定：包括九组对偶基因及一组性亲子鉴定：包括九组对偶基因及一组性别基因别基因 现 嫌1 嫌2 嫌3 罪犯鉴定罪犯鉴定 引入基因点突变，基因融合等引入基因点突变，基因融合等第四节、差别杂交法（第四节、差别杂交法（differential differential hybridizationhybridization）又叫差别筛选，适用于分离经特殊处理又叫差别筛选，适用于分离经特殊处理而被诱发表达的而被诱发表达的mRNAmRNA的的cDNAcDNA克隆。属于克隆。属于核酸杂交的范畴。核酸杂交的范畴。 概念概念它不需要任何有关的目的基因的核它不需要任何有关的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是要拥有苷酸序列信息，而重要的是要拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。个细胞群体中目的基因不表达。 技术基础技术基础 灵敏度比较低，特别是对于那些低灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的丰度的mRNAmRNA。 需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片