细胞分子生物学实验复习

1、考试题型：名字解释（每题3分，共21分）简答题（每题7分，共42分）论述题（37分）载体（vector）: 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。带电物质在电场中向相反电极移动的现象称电泳。核酸限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA的酶，即是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性内切酶作用于磷酸二酯键，使双链DNA中两条单链上的3,5-磷酸二酯键断裂，产生的DNA片段5端为P,3端为OH类酶由两种酶组成及作用: 一种就是通常指的限制性内切酶，它识别并切割某一特异的D

2、NA的核苷酸序列，产生特异的DNA片段；另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列,使A（嘌呤）甲基化。类酶中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础，绝大多数能识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3)，有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如Sma:5-CCCGGG-3)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（ 3 突出和5 突出的单链末端）的DNA片段称粘性未端可变酶：识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的，且其识别序列一般大于6

3、个碱基。在适当的反应条件下（包括温度、pH、离子强度等），1小时内完全酶解1ug特定的DNA底物所需要的限制性内切酶的量，定义为1个活性单位（1U) 酶影响限制性内切酶的活性的因素：DNA纯度、DNA的分子结构、缓冲液、温度条件及限制性内切酶本身质粒的基本性质质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子,呈超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录的能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录主要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,

4、而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。质粒的两种类型：紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时，它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子，如F因子。后者在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上,质粒的不相容性：利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒

5、却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒中的一种，这种现象称质粒的不相容性。碱法提质粒的原理：用含SDS的碱性溶液即溶液裂解大肠杆菌细胞，变性蛋白质和染色体DNA，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段, 碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状质粒DNA的两条链不会相互分开。然后用溶液中和提取液的pH以使质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中，而线状染色体DNA片段难以复性，并与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起经

6、离心沉淀，在溶液中只剩下质粒DNA和RNA。溶液中的RNA可用RNA酶A降解，从而使溶液中仅仅留下质粒DNA。DNA片段琼脂糖凝胶电泳的原理：核酸分子是两性解离分子，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在 pH 值为 8.0-8.3 时，核酸分子中碱基几乎不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与DNA分子大小及构像有关，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。限制性内切酶反应的终止通常有以下三种方法：1、采用65条件下温浴

7、20min，通过加热失活内切酶；2、加终止反应液（如0.5 mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10 mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切酶变性以终止反应；3、通过电泳割胶回收或用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀，此法最为有效且有利于下一步的DNA的操作。限制性内切酶用量：对质粒DNA酶切反应而言, 限制性内切酶用量可按标准体系1 g DNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-5倍，反应时间也要适当延长，但过分加大酶量，甘油会影响反应外，酶本身会导致识别序列的特异性下降,产生酶的星号活力。限制性内切酶的星号活力及其产生原因：限制性内切酶在非标准

8、的反应条件下，能切割一些与其识别序列类似的序列，这种现象称星号活力。每一种酶在特别的条件下均会产生这种活力。星号活力的识别形式常对标准识别序列中两侧的碱基没有特异性。产生星号活力的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在大多数限制酶贮存在50甘油溶液中，以避免在-20条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于5时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。溴化乙锭染料检测核酸的原理：在凝胶中加入少量荧光嵌入染料溴化乙锭（注意：EB是强诱

9、变剂！），其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254-365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测，可以检出1-10ng的DNA条带，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。在电场中决定DNA的迁移速率的因素：在电场中，在碱性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小 2、琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、电源电压 5、嵌入染料的存在 6、离子强度影响 乙酸钾溶液的作用：用高浓度低pH的乙酸钾溶液中和的作用是使质粒DNA复性，并沉淀大部分去污剂(十二烷基硫酸钾不溶于水)。酚/氯仿抽提的目的：用酚或酚-氯

10、仿混合液抽提以去除碱裂解液中残余的蛋白质。 采用酚或酚-氯仿混合液对裂解液用进行抽提是经典的蛋白清除方法。酚相与水相不相溶，当剧烈振荡然后静置或离心分相后，变性了的残余蛋白会沉降出来处于酚相与水相的界面。溶解EDTA二钠盐时的关键是什么：EDTA二钠盐只有当溶液pH用氢氧化钠调至8.0左右时才能溶解核酸电泳时加样孔一侧靠近阴极（黑末端），配制10 % SDS溶液的主意事项：10 % SDS无须高压灭菌，SDS有毒，且微细晶粒易于扩散，故称量时要戴口罩，称量完后要清除在称量工作区和天平上的SDS碱法提质粒的溶液中的葡萄糖的作用：可以提高细菌悬浮液的渗透压，减少细菌裂解时DNA泄漏过快产生的机械剪

11、切力酚:氯仿:异戊醇（25:24:1体积比混合）的作用：酚、氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可消除抽提过程中出现的泡沫。DNA片段纯化回收的原理：本试剂盒适合从各种琼脂糖凝胶中回收多至8ug DNA (70bp-10kb),回收率为60-85%。琼脂糖凝胶在温和缓冲液（DE-A溶液）中溶解，其中的保护剂能防止线状DNA在高温下降解，然后在DE-B溶液的作用下使DNA选择性结合到膜上，经W1、W2溶液的洗涤清除蛋白和盐分，最后有pH洗脱液从膜上洗脱下来。纯化的DNA可直接用于连接、体外转录、PCR扩增、测序、微注射等分子生物学实验。DNA片段纯化回收注意事项:1.在步骤1中，

12、将凝胶切成细小的碎块可大大缩短凝胶融化时间（线性DNA长时间暴露在高温条件下易水解），从而提高回收率。勿将含DNA的凝胶长时间地暴露在紫外灯下，减少紫外线对DNA造成的损伤。2.步骤2中凝胶必须完全熔化，否则严重影响DNA回收率。3.Eluent或去离子水加热至65，有利于提高洗脱效率。4.DNA分子呈酸性，建议在2.5 mM Tris-HCl，pH8.5洗脱液中保存,减少DNA的脱氨反应。5.尽量切除不含DNA的凝胶。得到凝胶体积越小越好，不然影响回收率。6.回收纯化的DNA 片段一般在100bp到50kb之间，过长，过短片段的回收效率迅速降低。7.使用前，Buffer W1中加入等体积的无

13、水乙醇DNA连接的概念：在一定条件下，由DNA连接酶催化两个双链DNA片段相邻的5端磷酸与3端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶，前者是T4噬菌体基因30编码的产物，后者是大肠杆菌基因组中lig基因编码的产物。DNA连接酶作用机制：DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。反应过程可分三步： (1)NAD或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶的一个赖氨酸残基的氨基上形成共价的酶-腺苷酸中间物，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸；(2)将酶-腺苷酸中间物上的腺苷酰基再转移到DNA的5-磷酸基端，

14、形成一个焦磷酰衍生物，即DNA-腺苷酸；(3)这个被激活的5'-磷酰基端可以和DNA的3'-OH 端反应合成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 10l反应体系中加入T4 DNA连接酶 1l (350U），温度 16推荐过夜，通常在4过夜连接效果尚佳。为什么PCR产物可与T载体连接: 因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3末端添加一个“A”的特性，能直接和T载体进行TA克隆。蓝白斑筛选的机理:载体上带有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常

15、功能。E. coli DH5菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下, 载体和DH5编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在二者融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫-互补。 由-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去-互补能力, 因此在同样条件下

16、含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。 在麦康凯培养基上，-互补产生的Lac+细菌由于含-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去-互补能力，因而不产生-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。 基因带有相同的粘性末端的连接的策略： 用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端。在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。1）必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接

17、产物的数量达到最高水平。2）可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去除, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 碱性磷酸酶（CIAP)在连接中的作用：是一个二聚体蛋白，它是从线状DNA上去除5磷酸基团，从而抑制质粒DNA的自身连接和环化。基因连接的注意事项：1.DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。2. 连接反应后，反应液在0储存数天，-80储存2个月，但是

18、在-20冰冻保存将会降低转化效率。 3. 粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37，在连接粘性末端时，反应温度以10-16为好，平齐末端则以15-20为好。 4. 在连接反应中，如不对载体分子进行去5磷酸基处理，便用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。转化：将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。DNA

19、分子转化的原理：吸附完整的双链DNA 分子吸附在受体菌表面；转入双链DNA 分子解链，单链DNA 分子进入受体菌，另一链降解；自稳外源质粒DNA 分子在细胞内又复制成双链环状DNA；表达供体基因随同复制子同时复制，并被转录和翻译。热击转化包括的主要步骤：从-70冰箱中取200 l感受态细胞悬液,室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；加入连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30分钟；42水浴中热击60秒，热击后迅速置于冰上冷却5分钟；向管中加入1 ml LB液体培养基，混匀后37振荡培养1小时；将上述菌液在6500 rpm离心3分钟，剩余100 l 上清，将沉淀混匀后涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置

20、半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37培养16-24小时。感受态细胞：受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)制备感受态细胞的关键：受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，并应具有最佳的细胞生长状态和密度；器具必须是非常洁净的，试剂均需是最高纯度的；制备过程中保证菌体的有氧代谢；控制细胞悬浮液中的各种离子；制备感受态细胞过程中防治菌株被污染；保存感受态时，使用冷冻保护剂，并采用液氮速冻感受态细胞；要在冰上操作。转化子：带有异

21、源DNA分子的受体细胞。CaCl2法制备感受态细胞的原理：是细菌处于0，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞 ）。 质粒转化的方法有哪几种：热击转化法：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过42热击处理将载体DNA分子导入受体细胞。电击转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作

22、用将载体DNA分子导入受体细胞。提高转化率因素，即转化的注意事项： 1. 细菌生长状态和密度2. 质粒的质量和浓度3. 试剂的质量4. 防治杂菌和杂DNA的污染5. 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。 卫星菌落：有些载体带有-内酰胺酶的基因，表达出-内酰胺酶，它可以破坏氨卞青霉素。当细菌培养时间过长，-内酰胺酶积累过多，就会使氨卞青霉素失效，导致不含质粒的空菌落大量生长，这就是卫星菌落。PCR(Polymerase Chain Reaction, 聚合酶链反应)是DNA基因在体外的一种扩增方法。PCR的基本原理及三个步骤：PCR(Polymerase Chain R

23、eaction, 聚合酶链反应)是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与体内相似，不同之处是耐热的Taq酶取代DNA聚合酶，用合成的DNA引物替代RNA引物，用加热(变性)、冷却(退火、保温(延伸)等改变温度的办法使DNA得以复制，反复进行变性、退火、延伸循环，就可使DNA无限扩增。PCR具体分三个基本步骤：(1)变性(Denature):将PCR反应体系升温至94左右，目的双链的DNA模板就解开成两条单链，此过程为变性；(2) 退火(Anneal):将温度降至引物的Km值以下(50左右)，3'端与5'端的引物各自与两条单链DNA模板的互补区域通过氢键配对结合，此过程称为退火

24、；(3)延伸(Extension)：当将反应体系的温度升至70左右时，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种脱氧核糖核苷酸按照于与模板DNA的核苷酸序列的互补方式依次加至引物的3'端，形成新生的DNA链。由这三个基本步骤组成一轮循环,每一次循环使反应体系中的DNA分子数增加约一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。参与PCR反应体系的因素及其作用参与PCR反应的因素主要包括模板核酸、引物、TaqDNA聚合酶、缓冲液、Mg2+、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、反应温度与循环次数、PCR仪：1. 引物：PCR反应产物的特异性与长度由

25、一对上下游引物，即5'端引物与3'端引物所决定。5'端引物是指与模板5'端序列相同的寡核苷酸，3'端引物是指与模板3'端序列互补的寡核苷酸。引物的好坏往往是PCR成败的关键。一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0mol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费, 难以合成,且引物过长使延伸温度超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74度)，亦会影响产物的特异性。(

26、2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度：Tm4(G+C)+2(A+T)。(3) 四种碱基应随机分布，尤其在3'端不应存在连续3个G或C,否则会使引物与核酸的G或C富集区错误互补，而影响PCR的特异性。(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，起码引物自身连续互补碱基不能大于3bp。(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4

27、个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增。(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。(10) 引

28、物3'端是引发延伸的点。因此不应错配。由于ATCG引起错配有一定规律，以引物3'端A影响最大，因此，尽量避免在引物3'端第一位碱基是A。引物3'端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第3位简并性而影响扩增特异性。5GTAGATGGACTTATGC3CGTCCCGGTGACTCCTGGAATAATCGTCCATCCACTCTAAATCAGTTACGGCCTTATCCGCAGGAGTTGAAGTACAAAGGATGTATGATTCGAGGCTTACGGAGTAGAGATGTTCATTTTTCCAGCTTTCAATGGTCTCATGACACATGAGGGAC

29、TCGATGGGAAACTCAGGTGTGTAAGTGCTAACTGGGTCTGGGAATAGATGGCGTGCAGTGTAGTCGAAGTC33CGTCACATCAGCTTCAG 5 反向引物，亦称下游引物 2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP为PCR反应的合成原料。dNTP原液可配成5-10 mmol/L并分装，-20贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200mol/L，在此范围内，PCR产物的量、反应的特异性与忠实性之间的平衡最佳。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现

30、的错误掺入。 3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大, Mg2+浓度过低，Taq酶活力显暑降低；Mg2+浓度过高，又使酶催化非特异性扩增。通常Mg2+浓度范围为0.5-2 mmol/L。 4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 5. Taq DNA聚合酶：纯化的Taq酶在体外无3'-5'外切酶活性，因而无校正阅读功能，在扩增过程可引起错配。错配

31、碱基的数量受温度、Mg2+浓度和循环次数的影响。在100 l PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减，酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低。6. 反应缓冲液：缓冲液提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子，反应缓冲液一般含10-50 mmol/L Tris·Cl, 缓冲液中含有50 mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+，Tris·Cl在20时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8、50mmol/L的KCl有利于引物的退火。 PCR反应有哪些参数1.

32、 变性：在第一轮循环前，在94下预变性2-5 min非常重要，它可使模板DNA完全解链，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全，往往使PCR失败，因为未变性完全的DNA双链会很快复性，减少DNA产量。一般变性温度与时间为94 1min。在变性温度下，双链DNA解链只需几秒钟即可完全，所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC的序列，可适当提高变性温度。但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。为防止在变性温度时反应液的蒸发，可在反应管内加入1-2滴液体石蜡或PCR仪器

33、设置成热盖。 2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5。一般当引物中GC含量高,长度较长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。而退火温度过低，易引起非特异性扩增。 Tm：引物的解链温度，相当于4(G+C)+2(A+T)。可按下式粗略估计引物的解链温度：Tm4(G+C)+2(A+T)。实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低53. 延伸：延伸反应通常为72，接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75。延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度

34、。在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加，但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应，以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多，会使PCR产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-10

35、5倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。在PCR扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明显上升，这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应,减少非特异性产物。 标准PCR反应体系试剂的加入次序：水、10×扩增缓冲液、4种dNTP混合物、引物、模板DNA、 Mg2+ 、Taq DNA聚合酶一般在扩增反应完成后,都需要72延伸10min的作用：以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反

36、应尤为重要。 为什么PCR循环次数不是越多越好？1.平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。 2.通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足。说出PCR产物和质粒载体的连接反应策略？在许多研究中，需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法： 1.平末端连接由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前，可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。 2.P

37、CR产物与T-载体直接连接：Taq DNA聚合酶会在3端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合，所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。 3.粘性末端连接利用引物中附加在5'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端，与载体连接,产生重组DNA。如果上下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点，经酶切后定向克隆到载体中。 PCR常见问题及原因：PCR常见问题1无扩增产物：阳性对照有条带，而样品则无原因：1、模板含有抑制物，含量低2、引物设计不当或者发生降解3、退火温度太高，延伸时间

38、太短PCR常见问题2PCR中出现非特异性扩增的可能原因？非特异性扩增： PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致；或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。原因：1、引物特异性差2、模板或引物浓度过高3、酶量过多4、 Mg2+浓度偏高5、退火温度偏低6、循环次数过多PCR常见问题3假阳性： 空白对照出现目的条带。原因：1、靶序列或扩增产物的交叉污染对策：1、操作时防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2、 除不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。离心管及枪头等一次性使用。3、 各种试剂先进行分装，低温贮存。 菌落PCR ：是直接以转化菌的单个克隆为模板, 通过特异性引物或通用引物对插入

39、载体中的目的基因快速扩增，用于鉴定和筛选阳性转化菌的技术。PCR反应的注意事项：1.PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 2.吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。3.加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 4.应设含除模板DNA外所有其它成分的阴性对照和阳性对照。 CTAB提植物基因组DNA的原理：离子型表面活性剂如十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)等可以有效裂解植物细胞壁，且与DNA形成可溶于高盐溶液的复合物，当降低盐浓度时DNA又可沉淀析出，从而与蛋白质及多糖等分离

40、。CTAB、SDS等离子型表面活性剂能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚 / 氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入异丙醇 / 无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE或水溶液中，即得植物总DNA溶液。 CTAB提植物基因组DNA的注意事项：1尽量取材幼嫩叶片，如太老，酚类物质多，必须用 10 mM 的 -ME 处理。叶片磨得越细越好。2研钵预冻，粉末至加 CTAB 前不要融化。324:1 的氯仿/异戊醇抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪宽的。4所

41、用试剂必需灭菌，戴手套。5. EDTA 只有在pH 达8.0 时才能彻底溶解，当EDTA溶解至少量时，缓慢滴加10 M NaOH调pH至8.0。如万一pH调过8.0，则补加EDTA·2H2O重新定容。用Trizol试剂提取植物总RNA的原理：Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

42、水相中的RNA用异丙醇沉淀，75%酒精洗涤，DEPC水溶解即可。RNA提取中使用焦碳酸二乙酯 ( DEPC )的作用及主意事项DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性；DEPC为剧毒物，尽量在通风柜中操作DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心；试验所用试剂可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度处理12小时以上，然后高压灭菌以消除残存的DEPC （DEPC会分解成水和CO2 ），否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏RNA活性；DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压

43、灭菌；DEPC对单链的 DNA或RNA具有破坏作用；配制的溶液如不能高压灭菌,，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。RNA电泳为什么要用甲醛琼脂糖凝胶变性电泳？因RNA具有二级结构，需变性成链状，这样不同分子量的RNA才能通过电泳（根据分子量大小）而分开。提RNA失败的原因？RT-PCR原理将RNA的反转录（Reverse Transcription，RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术，近年来得到快速发展和广泛应用。首先，经反转录酶的作用，以RNA为模板，合成互补的DNA链（cDNA），再以cDNA为模板，通过PCR扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用

44、途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列、分析基因的转录产物、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统等。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。反转录酶（Reverse Transcriptase，RTase）自然界中广泛存在着一类以RNA为遗传物质的反转录病毒，其携带的反转录酶是一类以RNA为模板，合成cDNA的DNA聚合酶。目前在生命科研领域中应用较为广泛的有鸟类成髓细胞性白血病病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV

45、）反转录酶（AMV RT）、莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine L：Leukemin Virus，M-MLV) 反转录酶（M-MLV RT）及其改造重组体M-MLV（RNase H）。AMV酶由两条肽链组成,有依赖于RNA及DNA的DNA合成的聚合酶活性和对DNA:RNA杂交体的RNA部分进行内切降解的很强的Rnase H活性; 最适温度为42, 最适pH为8.3。M-MLV酶由一条肽链组成, 有依赖于RNA及DNA的DNA合成的聚合酶活性和较低的Rnase H活性; 在42下很快失活; 最适pH为7.6。AMV RT具有反转录活性高、最适反应温度较高（4150）的特点，可以较好

46、地克服由于模板二级结构造成的反转录困难问题，然而由于AMV RT的RNase H活性高，易降解cDNA-RNA复合物中的RNA链，导致合成的cDNA片段偏短，一般为1 kb左右。M-MLV RT的RNase H活性较低，合成的cDNA可达34 kb，比较适宜全长cDNA的合成。但M-MLV RT扩增效率较低，最适反应温度在37左右，故对于具有复杂二级结构的RNA模板逆转录效果不佳。经过定点突变的M-MLV RT（RNase H），基本上消除了RNase H酶活性，并将酶的最适反应温度提高到42，大大提高了cDNA链的延伸性和产率，更适于完整基因的获得。模板RNA反转录反应中作为模板的RNA样品

47、可以是提取的总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。提取RNA的方法多种多样，如单相试剂法（TRIzol）、过柱纯化法、磁珠法等。无论使用哪种方法，最关键因素是抑制RNA酶活性并最大限度地去除基因组DNA污染。引物用于反转录的引物可视实验的具体情况选择。常用的引物有Oligo(dT)9、随机引物(Random Hexamer)和基因特异性引物(Gene-specific primer)。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种引物都可采用。Oligo (dT)9只适用于具有PolyA尾巴的RNA，对无PolyA尾巴的原核生物的RNA、真核生物的rRNA、tRNA以及某些种类的真核生物的

48、mRNA不适用。因Oligo (dT)9引物需与mRNA的PolyA尾结合，所以对RNA模板的质量要求很高，即使模板有少量降解也会影响全长cDNA的合成量。随机引物适用于任何类型的RNA模板，可适用于长的或具有发卡结构的RNA，适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。但由于特异性低，主要用于单一模板的RT-PCR反应。基因特异性引物是根据模板序列设计的互补引物，特异性好，但仅适用于目的序列已知的情况。如果用随机引物和Oligo dT引物进行RT-PCR时，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物作模板继续用特异性引物进行扩增。一步法和两步法RT-PCRRT-PCR可

49、以通过一步法或两步法的形式来实现。一步法即将反转录和PCR扩增在同一管内完成，减少加样步骤，有助于减少污染。由于所有的cDNA产物都用于PCR扩增，其灵敏度非常高，尤其适用于检测大量样品和实时定量PCR。两步法将反转录和PCR扩增分开进行，在选择DNA聚合酶（如高保真度、高特异性、长片段等）和引物时具有更大的灵活性。荧光探针及其种类荧光物质是受激能发射荧光的物质。荧光探针是与非荧光物质结合或反应来显示非荧光物质（如钙离子，核酸和蛋白）的荧光物质，这个过程被称为荧光标记。荧光探针包括有机荧光染料、半导体量子点和荧光蛋白。荧光显微镜工作原理光源发出的光线通过激发滤镜分滤出一定波长范围的激发光。激发

50、光被二向色镜或分色镜改变方向通过物镜照射样品，激发样品发射出长波荧光。来自样品的荧光通过分色镜和阻断滤片进入目镜。而来自样品的反射光被分色镜阻挡不能进入目镜，样品发出的较短波长的荧光会被阻断滤片阻挡不能进入目镜。激光扫描共聚焦显微镜的成像原理在光源和检测器前各有一个针孔（pinhole）或狭缝，分别称为照明针孔和检测针孔。由激光器发射一定波长的激光经照明针孔形成点光源，由物镜聚焦于样品的焦点上。在焦点的荧光物质受激而发射的荧光经物镜和分光器后通过检测针孔到达检测器（光电倍增管；Photomultiplier tube，PMT）。通过照明针孔和检测针孔的光线经一系列的透镜都聚焦于焦点。焦点既是被

51、照射点又是被检测点，即共焦点，相应的焦平面即共焦平面。PMT检测到的由激光逐点扫描焦平面而发射的荧光信号被计算机数字图像处理系统转换为数字信号而成像在显示屏上。这样每一幅焦平面图像就是样品的一个光学横切面。而来自焦平面上方或下方的荧光会被检测孔光栏阻挡而不能成像。绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein；GFP)GFP是从水母中分离纯化得到的一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量约27kD。GFP的三维结构呈圆柱体，Ser65-Tyr66-Gly67环状三肽形成的生色团在圆柱体的内部。野生型GFP被紫外光和蓝光激发后能发出绿色荧光。GFP 的结构和光致荧光非常稳

52、定, 而且生色团的形成是自催化的, 所以检测GFP的光致荧光不需要外加底物和辅因子, 便于活体观察。荧光蛋白作为示踪报告分子用于监测靶基因表达和靶蛋白在活体内的定位和动态的工作原理监测靶基因的表达可将GFP编码序列连接到靶基因启动子序列之后让融合序列在细胞中表达。监测靶蛋白在活细胞中的定位和动态，一是可将决定靶蛋白定位的序列和GFP编码序列连接让定位信号肽指导GFP的定位；二是将GFP编码序列插入到靶蛋白基因序列之前或之后获得靶蛋白与GFP的嵌合体。如果嵌合体与靶蛋白有着相同的亚细胞定位和活性功能，那么GFP与某种细胞器蛋白或其定位信号肽的嵌合体就能被用于用荧光显微镜和共聚焦显微镜观测该细胞器

53、在活细胞中的行为。荧光能量共振转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer ；FRET）受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，使后者被激发的过程。能量的提供者叫供体荧光素，能量的接受者叫受体荧光素。用供体荧光探针和受体荧光探针分别标记可能发生互作的蛋白质，当被标记蛋白质靠近互作时，激发供体荧光探针会发生FRET，表现为供体荧光衰减和受体荧光增强。双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation；BiFC）将荧光蛋白在合适的位点分成不发荧光的2个片段，并将这2个片段分别与不同的目标蛋白融合。当目标蛋白彼此靠近

54、相互作用时，荧光蛋白的2个片段重新形成有发光活性的荧光蛋白。BiFC用于检测蛋白间的互作，也可以定位相互作用的蛋白质。检测蛋白亚细胞定位的方法1）免疫荧光技术、细胞器特异荧光标记（如用ER-tracker染料标记内质网，用MitoTracker标记线粒体）和荧光蛋白标记技术结合荧光显微成像技术观察2）胶体金技术结合电子显微技术观察免疫荧光（Immuno-fluorescence）技术利用抗原和抗体特异结合的特性，用荧光探针标记抗体来定位抗原的技术。免疫胶体金（Immuno-gold）技术利用抗原和抗体特异结合的特性，用胶体金探针标记抗体来定位抗原的技术。酶细胞化学通过酶促反应,产生不溶性的电子

55、致密物，用透射电镜观察电子致密物的位点、密度和丰度，分析细胞内外酶或酶的底物的定位以及相对活性或含量。如何使光学显微镜的分辨率突破衍射极限？1）使经过透镜后聚焦的点足够小，使彼此靠近的两个亮点不重叠而得以被区分，即在受衍射限制下造出半径小于半光波波长的亮点。 2）使彼此靠近的AB两个点交替明暗，即用开关控制A亮时B暗，A暗时B亮。受激发射损耗显微术（Stimulated emission depletion microscopy; STED) 通过激发光与另一环形激光束共同作用，设法使受衍射极限限制的激发光斑外围产生受激发射损耗而不发射荧光，只有环形中心部分才发射荧光。即在入射光激发荧光探针后

56、，迅速将一个环状的光脉冲覆盖到激发光斑外围，在这个环状区域的受激分子还没发荧光之前引起受激发射消耗了发射荧光能级（荧光态）上的粒子数，从而使环状区域内的分子失去发射荧光的状态，而没有受激发射损耗的小于衍射极限的中心区域将保持发光状态。进而通过时间同步和光谱分光技术将荧光和受激发射光分开，从而获得超衍射极限的空间分辨率。随机光学重构显微术（Stochastic optical reconstruction microscopy; STORM) 光开关荧光探针能在不同波长的光照下在荧光态和暗态间转换。在变波长的连续闪光下，荧光探针不断地被照亮和熄灭，每次仅部分探针被照亮，而每次被照亮的个体探针是随

57、机的，是可以被清晰定位的；经一系列的光开关成像后，把所有的图像重新整合而清晰呈现所有被照亮的探针，从而获得超衍射极限的空间分辨率。微丝和微管特异性药物的种类和应用1）微丝解聚剂 细胞松弛素（cytochalasin）是真菌分泌的生物碱，能结合在F-actin正极端阻抑G-actin组装到该末端，但对微丝另一端的去组装没有影响，导致微丝解聚。 拉春库林（latrunculin） 分离自红海棉（Latrinculia magnifica）的剧毒大环内酯，只与G-actin结合阻抑G-actin组装到F-actin上，但对微丝去组装没有影响，导致微丝解聚。2）微丝稳定剂 鬼笔环肽（phalloidin）是从毒菇鬼笔鹅膏（Amanita phallodies）中分离的剧毒环状七肽，不与G-actin结合，只与聚合的F-actin结合而抑制微丝的解聚。3）微管解聚剂（Microtubule destabilizing agent） 秋水仙素（colchicine）与微管蛋白二聚体结合并组装入微管，抑制微管动态。长春花碱（vinblastine, catharanthus alkaloid ）能结合到微管正极端，阻止微管蛋白二聚体组装到正极端，但微管在负极端的去组装不受影响，导致微管解聚。4）微管稳定剂（Micr