基因工程工具酶简化版ppt课件

1、第二章第二章 基因工程的工具酶基因工程的工具酶一、限制性核酸内切酶的发现一、限制性核酸内切酶的发现第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制限制 (restriction)修饰修饰 (modification) 限制性核酸内切酶的生物学功能：自我维护功能限制性核酸内切酶的生物学功能：自我维护功能(只只切外来的切外来的DNA，本身，本身DNA被甲基化后切不动被甲基化后切不动)核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的核酸酶：水解断裂多核苷酸链的两个相邻核苷酸的3,5磷酸二酯键磷酸二酯键核糖核酸酶核糖核酸酶RNase：脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶DNase：核酸外切酶核酸外切酶exonu

2、clease：核酸内切酶核酸内切酶endonuclease： 限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶： 二、限制性核酸内切酶的分类二、限制性核酸内切酶的分类主要特性主要特性I I 型型II II 型型III III 型型限制修饰限制修饰蛋白构造蛋白构造异源三聚体异源三聚体同源二聚体同源二聚体异源二聚体异源二聚体切割位点切割位点距识别序列距识别序列1kb1kb处随机性切割处随机性切割识别序列内或识别序列内或附近特异性切附近特异性切割割距识别序列下距识别序列下游游24-26bp24-26bp用途用途无运用价值无运用价值运用广泛运用广泛无运用价值无运用价值平末端平末端粘性末端粘性末端1单位酶活性单位酶活

3、性(1unit 1U)：在最适反响条件：在最适反响条件下下1小时完全切割小时完全切割1ugDNA样品的酶量。样品的酶量。同序同裂酶同序同裂酶(识别及酶切位点一样识别及酶切位点一样):同序异裂酶同序异裂酶(识别位点一样但酶切位点不同识别位点一样但酶切位点不同):同尾酶同尾酶(酶切位点不同但产生一样的粘性末酶切位点不同但产生一样的粘性末端端):酶切位点的计算：酶切位点的计算：四核苷酸识别序列：四核苷酸识别序列：44 = 25644 = 256六核苷酸识别序列：六核苷酸识别序列：46 = 409646 = 40962 2个假设：个假设：a a 随机陈列；随机陈列；b GCb GC含量含量50%50%

4、如：用如：用Bgl(A/GATC/T)Bgl(A/GATC/T)酶切酶切DNA49KbDNA49Kb: : 实际上的切点数：实际上的切点数： 49000/4096=12 49000/4096=12个个 实践情况？实践情况？三、限制性核酸内切酶的命名1973年年H.Smith和和D.Nathans提议提议每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个每一种酶都由产生并纯化生出该酶的细菌的种属名中的三个英文字母合起来代表：英文字母合起来代表：第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写；第一个字母采用细菌属名的第一个字母大写；第二和第三个字母小写，采用细菌种名的前两个字母；第二和第三个字母小写，采

5、用细菌种名的前两个字母；如大肠杆菌如大肠杆菌Escherichia coli用用Eco表示，代表从表示，代表从大肠杆菌中分别出的限制性内切酶。大肠杆菌中分别出的限制性内切酶。第四个字母表示菌株的类型大小写均有，如第四个字母表示菌株的类型大小写均有，如EcoR中的中的R代表大肠杆菌代表大肠杆菌R株。株。假设一个菌株有几种限制酶，那么在代表菌株的字母后用罗假设一个菌株有几种限制酶，那么在代表菌株的字母后用罗马数字表示。马数字表示。思索题：思索题：流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌Haemophilus influenzaed菌株菌株有三种限制酶，分别怎样表示？有三种限制酶，分别怎样表示？Hind I、Hin

6、dII、HindIIIBaciUus amyloliquefaciens H Streptomyces albus I一、天然一、天然DNADNA的制备的制备 1 1、天然、天然DNADNA的来源的来源染色体染色体DNADNA病毒和噬菌体病毒和噬菌体DNADNA质粒质粒DNADNA线粒体和叶绿体线粒体和叶绿体DNADNA第二节第二节 DNA分子片段化分子片段化2、天然、天然DNA的提取的提取 预备生物资料。预备生物资料。裂解细胞。裂解细胞。分别和抽提分别和抽提DNA。二、二、DNA的纯化的纯化 琼脂糖凝胶电泳洗脱法琼脂糖凝胶电泳洗脱法 适用于小剂量适用于小剂量DNA的纯化和酶切的纯化和酶切DN

7、A片片段的回收。段的回收。三、三、 DNA DNA的浓缩的浓缩 乙醇沉淀法在含一价阳离子的DNA溶液中参与2体积的无水乙醇，使DNA沉淀-20，时间在30min以上经过离心搜集沉淀的DNA溶于适量的TE缓冲液或无菌水中四、限制性核酸内切酶反响四、限制性核酸内切酶反响1 1、限制性核酸内切酶反响缓冲液、限制性核酸内切酶反响缓冲液 2、单酶切法、单酶切法 假设假设DNADNA样品是环状样品是环状DNADNA分子，完全酶切后，分子，完全酶切后，产生与识别序列数产生与识别序列数n n一样的一样的DNADNA片段数，片段数，并且并且DNADNA片段的两末端一样片段的两末端一样 假设假设DNADNA样品本

8、来就是线形样品本来就是线形 DNA DNA片段，完全片段，完全酶切的结果，产生酶切的结果，产生n n 1 1个个 DNA DNA片段数，其中片段数，其中有两个片段的一端仍保管原来的末端有两个片段的一端仍保管原来的末端 3、双酶切法 应先用需求较低盐浓度缓冲液的酶进展切割，然后调理缓冲应先用需求较低盐浓度缓冲液的酶进展切割，然后调理缓冲液的盐浓度，再参与需求较高盐浓度缓冲液的酶进展切割。液的盐浓度，再参与需求较高盐浓度缓冲液的酶进展切割。 假设两种限制性核酸内切酶的最适反响温度不同，那么应先假设两种限制性核酸内切酶的最适反响温度不同，那么应先用最适反响温度较低的酶进展切割，升温后再参与第二种酶用

9、最适反响温度较低的酶进展切割，升温后再参与第二种酶进展切割。进展切割。 假设两种限制性核酸内切酶的反响系统相差很大，会明显影假设两种限制性核酸内切酶的反响系统相差很大，会明显影响双酶切结果，那么可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳响双酶切结果，那么可以在第一种酶切割后，经过凝胶电泳回收需求的回收需求的DNADNA片段，再选用适宜的反响系统，进展第二种片段，再选用适宜的反响系统，进展第二种限制性核酸内切酶的切割。限制性核酸内切酶的切割。4、部分酶切 当某种限制性核酸内切酶在待切割的当某种限制性核酸内切酶在待切割的DNADNA分分子上有多个识别序列，并且其中一个识别序子上有多个识别序列，并且其中一个

10、识别序列正好在切割后需求回收待用的列正好在切割后需求回收待用的DNADNA片段上，片段上，假设完全酶切，势必将此待用的假设完全酶切，势必将此待用的DNADNA片段从中片段从中切断。在此情况下，对切断。在此情况下，对DNADNA样品进展部分酶切，样品进展部分酶切，经过凝胶电泳，根据待用经过凝胶电泳，根据待用DNADNA片段的大小，可片段的大小，可回收待用的回收待用的DNADNA片段片段 5、DNA分子的限制性图谱五五 、影响核酸内切限制酶活性的要素、影响核酸内切限制酶活性的要素1 1DNADNA的纯度的纯度2 2DNADNA的甲基化程度的甲基化程度3 3酶切消化反响的温度酶切消化反响的温度4 4

11、DNADNA的分子构造的分子构造 5 5星星活性星星活性 第三节第三节 DNA DNA聚合酶聚合酶 一、一、DNA聚合酶概述聚合酶概述 DNA聚合酶聚合酶polymerase： 以以DNA或或RNA为模板催化合成互补新为模板催化合成互补新链的酶。大多需求一个引物来起始互补新链链的酶。大多需求一个引物来起始互补新链的合成。的合成。 延续延续(discontinuity)：在：在DNA的一条链上某一位置两的一条链上某一位置两个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。个相邻的核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂。缺刻缺刻(nick)：某一位置上丧失了一个或几个核苷酸。：某一位置上丧失了一个或几个核苷酸。1以

12、以DNA聚合酶聚合酶I为代表的为代表的“合成型合成型2以以klenow聚合酶为代表，只需聚合酶活聚合酶为代表，只需聚合酶活性和部分外切酶的活性性和部分外切酶的活性3逆转录酶类，以逆转录酶类，以RNA作为聚合模板作为聚合模板根据模板和作用方式的不同分为三类：二、大肠杆菌二、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I全酶全酶1 1、性质、性质: :5 533 DNA DNA聚合酶活性聚合酶活性3 355外切核酸酶活性外切核酸酶活性5 533外切核酸酶活性外切核酸酶活性三、大肠杆菌三、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段Klenow片段片段 1、性质、性质 它具有它具有53聚合活性和聚合活性和35外切外切酶活

13、性酶活性,失去了失去了53的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性.四、四、T4噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶1、性质、性质具有具有53聚合酶活性及聚合酶活性及35外切核酸酶活性。其外切核酸酶活性。其35外切外切酶活性对单链酶活性对单链DNA的作用比对双链的作用比对双链DNA的作用更强。它的的作用更强。它的外切核酸酶活性比外切核酸酶活性比kenow片段要强片段要强200倍。倍。2、用途、用途1补平或标志限制性内切酶消化补平或标志限制性内切酶消化DNA后产生的后产生的3凹端。凹端。2对带有对带有3突出端的突出端的DNA分子进展末端标志。分子进展末端标志。五、五、T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶1 1、

14、性质、性质 继续合成才干最强继续合成才干最强 35 35外切核酸酶活性为外切核酸酶活性为klenowklenow片段的片段的10001000倍倍 没有没有5353外切酶活性。外切酶活性。2 2、主要用途、主要用途1 1用于拷贝长段模板的引物延伸反响。用于拷贝长段模板的引物延伸反响。2 2经过补平或交换置换反响进展快速末端经过补平或交换置换反响进展快速末端标志。标志。六、六、Taq DNA聚合酶聚合酶 具有53外切核酸酶活性。最正确作用温度为75-80。无3 5外切核酸酶活性，纠错功能较差。用途1可使特定序列扩增106倍。2用于聚合酶链式反响PCR，对DNA片段进展体外扩增。七、逆转录酶七、逆转

15、录酶reverse transcriptase 依赖于依赖于RNA的的DNA聚合酶聚合酶商品化逆转录酶：商品化逆转录酶： 禽源反转录酶禽源反转录酶AMVAMV， 鼠源反转录酶鼠源反转录酶MoMLVMoMLV反转录酶的根本特性：以反转录酶的根本特性：以RNA为模板聚合为模板聚合cDNA链链 双向外切双向外切DNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNA链链PCRPCRPolymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction 称为聚合酶链反响或称为聚合酶链反响或PCRPCR扩增技术，是一种高效快扩增技术，是一种高效快速的体外速的体外DNADNA聚合程序。具有特

16、异性强、灵敏度高、简聚合程序。具有特异性强、灵敏度高、简便快速、对标本的纯度要求低等特点。便快速、对标本的纯度要求低等特点。变性变性94C延伸延伸72C退火退火Tm-5C根本反响步骤根本反响步骤 PCR PCR技术的特点技术的特点高特异性高特异性高灵敏度高灵敏度简便快速简便快速低纯度标本也可运用低纯度标本也可运用第五节第五节 DNA衔接酶衔接酶ligase DNA衔接酶：将两个衔接酶：将两个DNA片段经过催化构成片段经过催化构成3，5磷酸二酯键而衔接起来的酶。磷酸二酯键而衔接起来的酶。 T4 DNA衔接酶：可衔接衔接酶：可衔接DNA链平粘端均可，也链平粘端均可，也可连可连RNA链，运用广泛。链

17、，运用广泛。 E.coli DNA衔接酶：平端衔接效率远低于衔接酶：平端衔接效率远低于T4DNA衔衔接酶，不能衔接接酶，不能衔接RNA分子。分子。 T4 RNA衔接酶：可催化两个单链衔接酶：可催化两个单链DNA或或RNA分子的分子的衔接。衔接。一、衔接酶功能一、衔接酶功能1、延续修复功能、延续修复功能2、衔接功能、衔接功能三、粘性末端衔接技术三、粘性末端衔接技术 1、衔接体、衔接体(linker)技术技术 2、结合体、结合体(adaptor)技术技术 3、同聚体、同聚体(homopolymer)加尾技术加尾技术第六节第六节 结合体技术的运用结合体技术的运用AFLP AFLPAmplified

18、Fragment Length PolymorphismAFLP一词是一词是1991年年Gustavo提出的提出的;该方法结合了该方法结合了RFLP(restriction fragment length polymorphisms)技术和技术和RAPD技技术的特点术的特点;运用人工接头运用人工接头Adaptor与限制性内切酶与限制性内切酶酶切的基因组酶切的基因组DNA片段衔接并以此为片段衔接并以此为DNA模板，合成系列模板，合成系列3末端随机变化数末端随机变化数个碱基且与人工接头序列相互补的个碱基且与人工接头序列相互补的PCR引引物，来进展物，来进展PCR特异条带扩增，经电泳检特异条带扩增，

19、经电泳检测后可获得测后可获得DNA指纹图谱。指纹图谱。此项技术优点此项技术优点1稳定，反复性好；稳定，反复性好；2需用的需用的DNA量少，适用于分析的量少，适用于分析的DNA大小范大小范围宽；围宽；3能产生更多的多态性标志，得到的条带也更密能产生更多的多态性标志，得到的条带也更密集，普通比集，普通比RFLP和和RAPD多多10100倍，便于比倍，便于比较分析；较分析；4操作易于规范化和自动化，适于大批量的样品操作易于规范化和自动化，适于大批量的样品分析。分析。 第七节第七节 基因工程的其它酶类基因工程的其它酶类一、一、DNADNA及及RNARNA的修饰酶的修饰酶一未端脱氧核苷酸转移酶一未端脱氧核苷酸转移酶二碱性磷酸酶二碱性磷酸酶(alkaline phosphatase(alkaline p