学士学位毕业论文

1、黑龙江八一农垦大学本科毕业论文学士学位毕业论文 酶解对玉米醇溶蛋白水溶性的影响学生姓名：陈俊学 号：20124064101指导教师：李丹所在学院：食品学院专 业：粮食工程中国·大庆2016年 5 月摘 要 玉米醇溶蛋白是玉米黄粉其中利用价值较高的副产物，其附加价值有很高的提升空间。本课题是以玉米醇溶蛋白为原料，通过胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白，并测定水解后玉米醇溶蛋白的最佳水解条件，溶解条件，以及在两者最佳条件下，醇溶蛋白对Fe2+ Cu2+的螯合能力的影响， 以使其有更大的应用空间。通过单因素试验研究，得出胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最佳工艺条件为：反应时间2h，反应温度27，酶添加量6

2、40U/g，玉米醇溶蛋白底物浓度为7%，乙醇浓度为75%，并对在最佳工艺条件下水解的脱玉米醇溶蛋白的水解度和与Fe2+Zn2+螯合能力进行研究。关键词：玉米醇溶蛋白，酶解，水解度，螯合能力AbstractZein is the by-product of corn gluten by high value, high added value promotion space. This topic is based on zein as raw materials, by

3、60;Trypsin Hydrolysis of zein, and determination ofhydrolysis of zein degree of hydrolysis and Zn2+ chelating ability, provide a theoretical basisfor further development and utilization of zein. Through single factor experiments, the optimumcondition

4、s of Trypsin Hydrolysis of zein protein:substrate concentration of 7% alcohol solublecorn, reaction time 2h, ethanol concentration 75%, reaction temperature is 27, adding amount of enzyme 640U/g, and studied the hydrolysis under t

5、he optimum conditions of hydrolysis and zein the degree of protein.Key words: Zein, Trypsin, Degree of hydrolysis目 录1. 前言21.1 课题背景21.2 研究概况21.3 本课题的目的、意义32材料与方法42.1实验材料与设备42.1.1实验材料与试剂42.1.2 实验仪器设备42.2 实验方法52.2.1 胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白条件优化52.2.1.1 反应时间对水解度的影响52.2.1

6、.2 反应温度对水解度的影响52.2.1.3 酶添加量对水解度的影响52.2.1.4 底物浓度对水解度的影响62.2.1.5 乙醇浓度对水解度的影响62.2.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析62.2.2.1 样品处理62.2.2.2 样品电泳62.2.2.3 胶片染色和脱色72.2.2.4 结果分析72.2.3 玉米醇溶蛋白水解物与Zn2+螯合能力的测定72.2.4 玉米醇溶蛋白水解度测定方法72.2.4.1 实验原理72.2.4.2 试剂的配制82.2.4.3 标准曲线的绘制82.2.4.4 样品中游离氨基含量和蛋白质水解度（DH）的测定83 结果与分析83.1胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白条件

7、优化83.1.1 反应时间对水解度的影响83.1.2 反应温度对水解度的影响93.1.3 酶添加量对水解度的影响103.1.4 底物浓度对水解度的影响113.1.5 乙醇浓度对水解度的影响123.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析133.3 玉米醇溶蛋白及水解物与Zn2+螯合能力的测定144. 讨论155.结论15参考文献16致 谢171. 前言1.1 课题背景介绍玉米 介绍玉米副产物 醇溶蛋白性质应用 发展前景 我国玉米年产量已达11左右亿吨，黑龙江省是我国玉米主产地之一。玉米80以上成份是淀粉类物质，它的出路决定了玉米深加工企业的发展，而玉米深加工企业的经济效益更多地来源于玉米胚芽、玉米蛋

8、白等副产品综合深加工。以低脂玉米粉生产淀粉糖时，产生大量副产物玉米渣。玉米渣中含有30左右的蛋白质，其中70为醇溶蛋白。经提纯后醇溶蛋白质含量高达90以上。玉米醇溶蛋白有较强的疏水性，为改善它的食品功能，就必须使其具有水溶性。 于是，利用酶解来研究对玉米醇溶性蛋白的影响成为重点。然而，限制玉米醇溶蛋白蓬勃发展的最主要因素是其生产成本。为了扩大玉米综合利用的范围，提高玉米的附加值，为醇溶蛋白的开发和应用提供理论依据。研究了从玉米蛋白粉中提取醇溶蛋白的工艺，并建立了玉米醇溶蛋白提取量的快速检测方法，在单因素试验的基础上采用中心组合设计法，确定了玉米醇溶蛋白的最佳提取工艺条件：乙醇浓度80%，提取温

9、度60，液料比(mL/g)9.25，浸提时间2h。产品提取率为50%，产品为淡黄色粉末，其中蛋白质含量在90%以上。1同时，玉米中的蛋白质主要为醇溶蛋白, 它具有一定的粘合力,易加工成薄膜和纤维, 其薄膜的耐水性、耐热性及耐酸性尤为出色, 可用于食品、制药及其它领域。61.2研究概况自20世纪70年代开始，世界上兴起玉米深加工业，美国是一马当先的国家。其玉米原料利用率已达到98一99。然而，我国在这方面的工作还比较落后，除了主产品淀粉以外，只有玉米油、粗蛋白粉等少数产品。由此可见，玉米的综合利用及深加工是玉米产业化的根本出路。以玉米为原料进行深加工的企业中，如生产淀粉、淀粉糖、有机酸、氨基酸等

10、产品的工厂，都会产生大量的下脚料。在这些下脚料中，大约可以分离出占原料质量5%-6%的玉米蛋白粉，这类玉米蛋白粉的蛋白质含量在60%左右，但由于缺少赖氨酸、色氨酸等人体必需氨基酸，其生物学价值低，目前均作为低价值饲料蛋白出售，国际上每吨仅200多美元，国内每吨约2500 元，许多工厂甚至未作任何利用而自然排放。目前，我国每年随废液排放的玉米蛋白高达8万多吨。 玉米醇溶蛋白是玉米蛋白粉中的主要蛋白质，由于它不溶于水且缺乏赖氨酸、色氨酸等必需氨基酸，还存在色泽和气味等问题，因而较少作为食品原料应用。但玉米醇溶蛋白具有很好的成膜性、凝胶化性及较强的抗氧化性等，随着高度脱色、脱臭技术的发展，大大拓宽了

11、其应用范围，使之成为一种用途广泛的工业原料。21.3本课题的目的、意义 玉米淀粉生产工艺主要是湿法工艺，用湿法生产玉米淀粉的过程中会产生许多的玉米黄粉，玉米黄粉中含有60%以上的蛋白质，其中大多数为玉米醇溶蛋白，若不加以利用，会造成很大的浪费，但玉米醇溶蛋白不溶于水，并存在色泽和气味问题, 其作为食品原料的应用较少，如果能通过改性使之改变某些功能性质，必会使其在食品等其他方面有所深入。本课题研究了其主要蛋白，玉米醇溶蛋白的最佳水解条件，溶解条件，以及在两者最佳条件下，醇溶蛋白对Fe2+ Cu2+的螯合能力， 以使其有更大的应用空间。2材料与方法2.1实验材料与设备2.1.1实验材料与试剂材料来

12、源玉米黄粉龙岗淀粉厂邻苯二甲醛（化学纯）中国医药集团上海化学试剂公司L-亮氨酸天津市光复精细化工研究所氢氧化钠天津市大茂化学试剂厂硫酸锌天津市大茂化学试剂厂硫酸铜天津市大茂化学试剂厂硫酸钾天津市大茂化学试剂厂硼酸沈阳市化东试剂厂溴甲酚绿天津市博迪化工有限公司甲基红天津市博迪化工有限公司无水乙醇沈阳市化东试剂厂十二烷基磺酸钠（SDS）天津市红岩化学试剂厂磷酸天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠天津市大茂化学试剂厂磷酸氢二钠天津市大茂化学试剂厂甲酚橙指示剂天津市大茂化学试剂厂碳酸钠天津市大茂化学试剂厂氯化亚铁 天津市东丽区天大化学试剂厂EDTA天津市大茂化学试剂厂Ferrozine天津市大茂化学试剂厂-

13、巯基乙醇天津市光复精细化工研究所酒石酸钾钠沈阳市化东试剂厂所有药品除特殊说明外均为分析纯2.1.2实验仪器设备仪器型号厂家电子天平AR224CN奥豪斯国际贸易（上海）有限公司可见分光光度计722S上海精密科学仪器有限公司精密定时电动搅拌器JJ-1江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司电热恒温水浴锅DK-S12上海森信实验仪器有限公司pH计PHS-3C上海虹益仪器仪表有限公司全自动凯式定氮仪Foss2300瑞典Foss公司消化炉Q/IDYQHYP-上海纤检仪器有限公司全温振荡培养箱 HZQ-F160江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司台式离心机LD4-1.8北京京立离心机有限公司冷冻干燥机LGJ-1上海医

14、用分析仪器厂2.2 实验方法2.2.1提取玉米醇溶蛋白的工艺流程3,4 （1）最适条件：乙醇浓度80%；提取温度57.9；液料比（ml/g)9.25；浸提时间2h。 （2）工艺流程:玉米黄粉粉碎过筛（70目筛）浸泡提取（体积分数80%乙醇，用氢氧化钠1mol/L调至pH为8左右）离心分离（3000r/min，15min）提取液冷水（10）稀释乙醇浓度至40%调节PH(用盐酸1mol/L调至pH为6.2左右)静置沉淀（30min）水洗至中性冷冻干燥磨碎成品2.2.胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白 本实验通过研究乙醇浓度、底物浓度、反应温度、pH来得出玉米醇溶蛋白的最佳水解条件，溶解条件。2.2.2.1乙

15、醇浓度对胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影响 称取一定量的玉米醇溶蛋白，并分别溶于乙醇浓度70%、75%、80%、85%、90%五个浓度梯度的乙醇溶液，将反应体系的盐酸浓度调制pH为9，反应温度固定为45，反应时间为1h，底物浓度5%,酶浓度5u/ml。反应过程中，用水浴摇床进行震荡，使玉米醇溶蛋白与氢氧化钠充分反应。按照2.2.4.2测定水解程度。 按照2.2.5.3测定溶解度.2.2.2.2酶添加量对胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影响 将酶浓度分别配成为1u/ml，3u/ml，5u/ml，7u/ml，5u/ml，9u/ml五个梯度的悬浮液。用移液管称取一定量的盐酸。将反应体系的盐酸浓度调制pH为9，

16、反应温度固定为45，反应时间为1h，乙醇浓度为80%。反应过程中，用水浴摇床震荡，使玉米醇溶蛋白与氢氧化钠充分反应。按照2.2.4.2测定水解程度。按照2.2.5.3测定溶解度.2.2.2.3反应温度对胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影响 将反应体系的盐酸浓度调制pH为9，反应时间为1h，乙醇浓度为80%，底物浓度5%,酶浓度5u/ml并分别在35、40、45、50、55五个温度梯度下反应中，用水浴摇床震荡，使玉米醇溶蛋白与氢氧化钠充分反应。按照2.2.4.2测定水解程度。按照2.2.5.3测定溶解度.2.2.2.4pH对胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的影响 将反应体系的浓度分别调为pH8，8.5， 9，

17、9.5，10五个浓度梯度进行反应1h，而乙醇浓度为80%，温度为45，底物浓度5%,酶浓度5u/ml。反应过程中，用水浴摇床震荡，使玉米醇溶蛋白与氢氧化钠充分反应按照2.2.4.2测定水解程度。按照2.2.5.3测定溶解度.。2.2.3玉米醇溶蛋白水解物与金属离子螯合能力的研究 2.2.3.1 对二价铁离子螯合能力的研究12 采用Ferrozine显色法测定二价铁螯合能力。准确吸取250 L 1mg·mL-1的样品溶液（样品最终浓度为100 g·mL-1）直接与X L 1 mmol·L-1的FeCl2溶液混合（最终浓度为1060 mol·L-1，此溶液现

18、用现配FeCl2），加入一定量的超纯水，使反应体系终体积为1.5 mL。混匀后，放置2 min，再加入1mL 500 mol·L-1的 Ferrozine显色剂水溶液（Ferrozine终浓度为200 mol·L-1），充分振荡、混匀。混合体系在室温下静置10 min，使Fe2+与Ferrozine充分结合，形成Fe2+-Ferrozine复合物，然后用紫外分光光度法在562 nm条件下测吸光值。对照样中加入一定量的EDTA钠盐溶液（终浓度为10 mol·L-1）2.2.3.2 对二价锌离子螯合能力的研究13 取5 mL反应液于烧杯中浓缩至近干，加入15 mL无水

19、乙醇，混匀后5 000 r/min离心20 min，取沉淀并用蒸馏水定容至50 mL。用EDTA络合滴定法测定螯合态锌的含量。移取容量瓶中溶液20 mL至锥形瓶中，加两滴二甲酚橙指示剂（0.5%水溶液），滴加质量分数为20%的六亚甲基四胺-盐酸缓冲液（pH 5.0）至溶液呈稳定的紫红色后再加入4 mL缓冲液，用已标定的0.001 mol/L EDTA溶液滴定至溶液由紫红色变成黄色，记录EDTA的消耗量2.2.4一些重要的理化分析方法2.2.4.1 蛋白质含量凯氏定氮法8,11盐酸标准滴定溶液配制方法GB/T 5009.1-2003；甲基红-溴甲酚绿混合指示剂配制方法GB/T 5009.1-20

20、03。称取0.20 g或5mL待测样品加入到消化管中，分别称取3.00 g硫酸钾、0.10 g硫酸铜加入消化管，加入10mL浓硫酸，将消化管置入消化炉中消化，用小火缓慢加热，使溶液保持在沸点以下，待泡沫消失后，加强火力并保持管内液体沸腾，逐渐升温至420 ，待消化管中的液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热30min后，自然冷却。将消化管取下，使用全自动凯氏定氮仪直接进行蒸馏和滴定。硼酸吸收液、氢氧化钠溶液、水加入量分别为30mL、40mL、50mL，在仪器显示屏上读取氮含量结果（单位mgNg-1或mgNmL-1），然后计算蛋白质含量。平行试验3次，平均值为测定结果。2.2.5.2蛋白质水解度OPA

21、分光光度法6,7本研究采用OPA分光光度法测定游离氨基氮，采用凯氏定氮法测定总氮的方法测定水解蛋白的水解度。1、实验原理碱性条件下，OPA在-巯基乙醇（-MCE）存在的条件下能够与游离氨基迅速反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚。此加成产物在340nm处有较强的吸收，并对所有的-NH2吸光系数相同，另外-NH2和-NH2的吸光系数也相同。运用十二烷基磺酸钠（SDS）将蛋白变性后，其吸光系数将不受影响，从而可以利用分光光光度法测定蛋白质在水解前后的游离氨基的含量，进而能够计算出水解过程中释放出的游离氨基的量。2、试剂的配制（1）OPA溶液：准确称取2.00g 十二烷基磺酸钠（SDS），加入30mL

22、0.4moL·L-1的硼酸缓冲液（pH 9.5），水浴加热使其完全溶解，冷却至室温后再加入1mL 浓度为80 mg·mL-1的OPA乙醇溶液和200 L -巯基乙醇，最后用pH 9.5的硼酸缓冲液定容至100mL。此溶液现用现配。（2）600g·mL-1的亮氨酸标准溶液：精确称取亮氨酸0.3000 g，加入5mL 浓度为1moL·L-1的盐酸溶液使其完全溶解，用蒸馏水定容至100mL，其浓度为3000 g·mL-1，再取此液10mL，用蒸馏水定容至50mL，即配成600g·mL-1的亮氨酸标准溶液。此溶液配成后应及时使用或放入4冰箱内

23、保存。3、标准曲线的绘制取不同体积的标准亮氨酸溶液，配成不同浓度的溶液（0、12、18、24、30、36g·mL-1），再各取稀释液3mL，与同体积的OPA试剂混合并开始计时，准确计时5 min，立即在340nm处测定溶液吸光值。每个浓度做3个平行，以吸光值的平均值为横坐标，亮氨酸浓度为纵坐标，绘制标准曲线。4、样品中游离氨基含量和蛋白质水解度（DH）的测定将待测样品按一定倍数稀释后，取稀释液3mL，按照标准曲线制作步骤，测定其吸光值。然后利用标准曲线所得方程，计算出样品中游离氨基的浓度（moL·mL-1）。水解度计算公式如下，其中计算大豆分离蛋白水解度时A=5.71；计算

24、酪蛋白水解度时A=6.38：2.2.5.3福林法测定蛋白质含量氮溶解指数9（1）试剂的配置：试剂甲： 4 %碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠（Na2CO3）20 g，定容至500 mL； 0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液； 1 %CuSO4·5H2O：准确称取0.5 g CuSO4·5H2O，定容至50 mL； 2 %酒石酸钾钠：准确称取1.0 g酒石酸钾钠，定容至50 mL。使用前，分别将与、与等体积混合，再将两混合液按501比例混合，即为试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。试剂乙：福林试剂的配置。于2000 mL磨口回流装置内，加入钨酸钠（Na2WO4·

25、2H2O）100 g，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25 g，蒸馏水700 mL，85 %磷酸50 mL，浓盐酸100 mL，文火回流10 h。取去冷凝器，加入硫酸锂（Li2SO4）50 g，蒸馏水50 mL，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15 min，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000mL，用漏斗过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加1倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。（2）标准蛋白质溶液的配置：准确称取一定量的牛血清白蛋白，配置成0.25 mg·mL-1标准蛋白质溶液。（3）标准曲线的绘

26、制及蛋白含量的测定：牛血清白蛋白标准曲线的测定过程及样品蛋白质含量测定的操作步骤如表2-2所示。按照表2-2所示的测定过程，以牛血清白蛋白的质量为横坐标，吸光值A660为纵坐标绘制标准曲线，得到牛血清白蛋白的质量与吸光值A660关系方程。根据测定得到的待测样品的吸光值及上述方程，计算蛋白质含量。表2-2 样品蛋白质含量的测定过程样品空白12345样品蛋白质标准溶液（mL）0.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20待测样品（mL）1.0试剂甲（mL）5.05.05.05.05.05.05.0使上述混合溶液充分混匀，20-25水浴10 min试剂乙0.50.50.

27、50.50.50.50.5加入试剂乙后立即混匀，20-25水浴30min后，660nm处测定吸光值2、氮溶解指数（NSI）的测定（GB/T 5511-2003）样品经处理后，离心，分别测定上清液和样品中的总氮含量，并按下式计算： 3 结果与分析3.1胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白条件优化3.1.1 反应时间对水解度的影响3.1.2 反应温度对水解度的影响 将玉米醇溶蛋白用80%乙醇水溶液调配成5%的悬液，并用0.2 molL-1的NaOH溶液将蛋白溶液pH调至8.0，加酶量为840U/g的胰蛋白酶，分别在22、27、3237、42五个温度梯度下反应2h。反应过程中，加入一定量的NaOH溶液，保证反应

28、过程中反应体系的pH在8.0。反应完成后，将反应容器在沸水浴中加热1015min，使酶失活，终止反应。结果如图3-2。图3-2 反应温度对玉米醇溶蛋白水解度的影响Figure 3-2 reaction temperature influence soluble protein hydrolysis degree of corn alcohol 从图3-2中可以看出，在其他的条件相同的情况，反应温度在27-42之间，随着温度的升高，玉米醇溶蛋白的水解度呈现先上升后下降的趋势，在反应温度为27时，水解度为25.63%，达到最大值

29、。当反应温度达到32时，水解度已经开始下降，在此之后的几个温度梯度里水解度呈现出大致相同的下降幅度。呈现这种结果的原因，可能是在达到最适温度27之前，随着温度的升高，水解反应的速率增加，在达到最适温度之后再提高温度，温度过高而是玉米醇溶蛋白构想被破坏，从而降低了胰蛋白酶与底物的有效结合，影响酶与底物复合物的形成，使水解度下降。另一个原因可能是随温度升高而使酶逐步变性，有活性的酶减少，从而使胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白反应速率下降，酶构象改变，酶活性渐渐丧失，反应速度很快下降。因此，27为最适反应温度。3.1.3 酶添加量对水解度的影响将玉米醇溶蛋白用80%乙醇水溶液调配成5%的悬液，并用0.2 m

30、olL-1的NaOH溶液将蛋白溶液pH调至8.0，分别加入酶量为440U/g、540U/g、640U/g、740U/g、840U/g五个用量梯度的胰蛋白酶，在37下进行水解反应2 h。反应过程中，适当加入一定量的NaOH溶液，保证反应过程中反应体系的pH在8.0。反应完成后，将反应容器在沸水浴中加热1015min，使酶失活，终止反应。结果如图3-3。图3-3 酶添加量对玉米醇溶蛋白水解度的影响Figure 3-3 adding amount of enzyme solution influence protein hydrolysis degree

31、60;of cornalcohol 从图3-3中可以看出，在其他条将相同的情况，酶添加量在440U/g-840U/g之间，玉米醇溶蛋白的水解度呈现先上升后下降的趋势，酶添加量在640U/g时，水解度是26.76%，达到最大值。当酶添加量增加到740U/g后，水解度反而开始下降。可能是在底物浓度一定的条件下，加酶量较低时，酶已经与底物全部结合，所以加酶量越多水解速度越快，水解度上升明显，但是随着酶添加量的继续增加，反应体系中酶的浓度过高，酶与酶之间产生了竞争性抑制，导致了酶量增加，水解度却不再增加甚至降低。因此，酶添加量的最适条件是640U/g。3.1.4 底物浓度对水解度的影响将玉米醇溶蛋白用

32、80%乙醇水溶液分别调配成1%、3%、5%、7%、9%五个浓度梯度的悬液，并用0.2 molL-1的NaOH溶液将蛋白溶液pH调至8.0，加酶量为840U/g的胰蛋白酶，在37下进行水解反应2 h。反应过程中，适当加入一定量的NaOH溶液，保证反应过程中反应体系的pH在8.0。反应完成后，将反应容器在沸水浴中加热1015min，使酶失活，终止反应。结果如图3-4。图3-4 底物浓度对玉米醇溶蛋白水解度的影响Figure 3-4 substrate concentration effect of solution protein hydrolysis degree&

33、#160;of corn alcohol从图3-4中可以看出，在其他条将相同的情况，底物浓度在1%-9%之间，玉米醇溶蛋白的水解度随着底物浓度的增加呈现向上升后下降的趋势，底物浓度在7%时，水解度是20.05%，达到最大值。当地物浓度超过7%，水解度反而下降。对该结果分析原因，应该是由于酶添加量相同时，随着底物浓度的增加，水解较快，当底物浓度达到一定浓度以后，玉米醇溶蛋白的含量较高，粘性较大，蛋白不能充分浸润，胰蛋白酶与玉米醇溶蛋白不能完全接触，影响了胰蛋白酶对玉米醇溶蛋白的作用。在较低底物浓度时，随着底物浓度增加，蛋白质水解度和降解率都逐渐增大，这是因为随着底物浓度增加，胰蛋白酶与

34、底物蛋白分子态间的接触几率增加，使可水解的肽键数增加，但底物浓度增加到一定程度后再继续增加，水解度下降。因此，水解反应的底物浓度以7%为最适底物浓度。3.1.5 乙醇浓度对水解度的影响将玉米醇溶蛋白分别用70%、75%、80%、85%、90%五个浓度的乙醇水溶液分别调配成5%的悬液，并用0.2 molL-1的NaOH溶液将蛋白溶液pH调至8.0，加酶量为840U/g的胰蛋白酶，在37下进行水解反应2 h。反应过程中，适当加入一定量的NaOH溶液，保证反应过程中反应体系的pH在8.0。反应完成后，将反应容器在沸水浴中加热1015min，使酶失活，终止反应。结果如图3-5。图3-5 乙醇浓度对玉米

35、醇溶蛋白水解度的影响Figure 3-5 the concentration of ethanol soluble protein hydrolysis degree of corn alcohol 从图3-5中可以看出，其他条件相同的情况，当乙醇浓度在70%-90%之间时，玉米醇溶蛋白的水解度呈现出先上升后下降然后趋于平缓的趋势。反应之处，水解度随着乙醇浓度的增加而升高，当乙醇浓度增加到75%是，水解度是23.52%，达到最大值。当乙醇浓度超过75%时，水解度随着乙醇浓度的增加而降低，当乙醇浓度超过80%以后，水解度趋于平

36、缓趋势。根据资料，玉米醇溶蛋白溶于70%-92%的乙醇中，不溶于水和无水乙醇，故过低的乙醇浓度或较高的乙醇浓度不利于玉米醇溶蛋白的溶解，即不利于胰蛋白酶与玉米醇溶蛋白结合，所以水解度较低。但是同时胰蛋白酶在乙醇溶液中也会发生变性，太高浓度的乙醇溶液会影响胰蛋白酶的作用性质，从而也会导致水解度的下降。因此，水解反应的乙醇浓度以75%为最适反应浓度。综上，胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最适反应条件为：反应时间2h，反应温度27，酶添加量640U/g，玉米醇溶蛋白底物浓度为7%，乙醇浓度为75%。根据上述最适的反应条件，反应分别进行不同时间并制备具有不同水解度的玉米醇溶蛋白产物，制备结果如下：反应时间分

37、别控制在1h、2h，制备出水解度分别为21.63 %、26.76%的玉米醇溶蛋白水解产物。3.3 玉米醇溶蛋白及水解物与Zn2+螯合能力的测定 将未反应的蛋白质和上述实验制备的两种玉米醇溶蛋白的水解产物进行与Zn2+螯合能力的测定。样品锌离子螯合能力的测定参照Wang等11的方法，计算方法略有改动。锌-肽螯合反应：取1.0 mL 0.05 mol/L ZnSO4（乙醇溶解）于25 mL离心管中，缓慢滴入10 mL 0.14%（w/v）的样品溶液（用体积分数为50%的乙醇溶解），室温下搅拌反应1 h，至有白色沉淀生成。肽螯合锌含量的测定：取5 mL反应液于烧杯中浓缩至近干，加入15 mL无水乙醇

38、，混匀后5 000 r/min离心20 min，取沉淀并用蒸馏水定容至50 mL。用EDTA络合滴定法测定螯合态锌的含量。移取容量瓶中溶液20 mL至锥形瓶中，加两滴二甲酚橙指示剂（0.5%水溶液），滴加质量分数为20%的六亚甲基四胺-盐酸缓冲液（pH 5.0）至溶液呈稳定的紫红色后再加入4 mL缓冲液，用已标定的0.001 mol/L EDTA溶液滴定至溶液由紫红色变成黄色，记录EDTA的消耗量。根据EDTA的消耗量计算出与Zn2+螯合能力。结果如图3-7。图中：玉米醇溶蛋白1水解度21.63%； 玉米醇溶蛋白2水解度26.76%图3-7 不同水解度的玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力Figur

39、e 3-7 Zn2+ chelating ability of different degree of hydrolysis of corn alcohol从图3-7中可以看出，同一种蛋白质在不同水解度的情况下，与Zn2+螯合能力有一定差异。随着玉米醇溶蛋白水解度的增加，各自与Zn2+螯合能力呈升高趋势。未参与反应的玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合能力是0.11，最适条件下水解1h后的玉米醇溶蛋白的水解产物与Zn2+螯合能力是0.18，最适条件下水解2h后的玉米醇溶蛋白的水解产物与Zn2+螯合能力是0.26。分析其原因，可能是水解程度越大，多肽暴露出来的能够与

40、Zn2+结合的基团越多，所以与Zn2+螯合能力越强。玉米醇溶蛋白分子中的大量氨基及部分酰胺基的存在，能够选择性地配位或吸附一些金属离子，尤其是对过渡金属离子具有较好的螯合能力，例如Zn2+。水解后的醇溶蛋白的氨基部分也随之增多，与Zn2+的螯合能力显著增强。4. 讨论玉米醇溶蛋白分子中的大量氨基及部分酰氨基的存在，能够选择性地配位或吸附一些金属离子，尤其是对过渡金属离子具有较好的螯合能力，食品领域有广泛的应用前景21。但是，由于大分子链的影响，使配位基与金属离子配位受到一定的空间阻碍。为提高吸附量，选择对玉米醇溶蛋白进行水解反应，高选择性的重金属离子配位吸附剂，以Zn2+为模板，采用先使玉米醇

41、溶蛋白与金属离子在均相中配位反应，制得玉米醇溶蛋白与Zn2+螯合物。本实验中，首先要研究胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最适条件，通过单因素反应，得出结论，最终确定的最适反应条件为：反应时间2h，反应温度27，酶添加量640U/g，玉米醇溶蛋白底物浓度为7%，乙醇浓度为75%。在上述的反应条件下，制备出水解度为26.76%的水解后的玉米醇溶蛋白产物。5.结论本试验主要是以玉米醇溶蛋白为底物，采用胰蛋白酶对玉米醇溶蛋白进行水解试验，使整个反应体系保持恒定不变为10毫升。通过对水解反应过程中反应时间、反应温度、酶添加量、底物浓度以及乙醇浓度等条件进行单因素反应，从而确定出最适反应条件。胰蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最适反应条件为：反应时间2h，反应温度27，酶添加量640U/g，玉米醇溶蛋白底物浓度为7%，乙醇浓度为75%。在上述的反应条件下，制备出水解度为26.76%的玉米醇溶蛋白水解产物。将玉米醇溶蛋白及玉米醇溶蛋白水解物与Zn2+螯合，发现玉米醇溶蛋白被胰蛋白酶水解以后提高了与Zn2+螯合能力，可以扩大玉米醇溶蛋白在食品中的应用范围。参考文献1，10，12，13，14段纯明，董海洲.玉米醇溶蛋白的特性及研究J.粮