第二章 流加发酵与高密度培养

1、.流加发酵与高密度培养流加发酵与高密度培养.流加发酵n所谓流加发酵，即补料分批发酵(Fed-batch fermentation)，有时又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法.优点缺点分批发酵1.一般投资较小1.因放罐、灭菌等原因，非生产时间长2.易转产、生产灵活2.经常灭菌会降低仪器寿命3.分批操作中某一阶段可获得高的转化率3.前培养和种子的花费大4.发酵周期短，菌种退化率小4.需较多的操作人员或较多的自动控制系统连续发酵1.可实现有规律的机械、自动化1.操作不灵活2.操作人员少2.因操作条件不易改变，原料质量必须稳定3.反应器体积小、非生产时间

2、少3.若 采 用 连 续 灭 菌 ， 加 上 控 制 系 统 和 自 动 化设备，投资较大4.产品质量稳定4.必须不断地排除一些非溶性的固型物5.操作人员接触毒害物质的可能性小5.易染菌，菌种易退化6.测量仪器使用寿命长流加发酵1.操作灵活1.非生产时间长2.染菌、退化的几率小2.需较多的操作人员或计算机控制系统3.可获得高的转化率3.操 作 人 员 接 触 一 些 病 原 菌 和 有 毒 产 品 的 可能性大4.对发酵过程可实现优化控制5.因经常灭菌会降低仪器使用寿命分批、连续、流加操作方式的比较.流加发酵的研究进展流加发酵的研究进展n在20世纪70年代以前流加发酵的理论研究几乎是个空白，流

3、加过程控制仅仅以经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇或恒速流加n1973年日本学者Yoshida等人首次提出了“Fed-Batch Fermentation”这个术语，并从理论上建立了第一个数学模型，流加发酵的研究才开始进入理论研究阶段.流加发酵所取得的三个方面的重大进展n 20世纪70年代中后期对流加发酵过程的动力学解析n 结合发酵过程的可测参数对流加过程进行反馈控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸商)法、pH法、代谢物法、萤光法等）n流加发酵的最优化研究.n流加发酵最优化研究的核心问题是找出最佳的底物流加方式，以维持发酵过程始终处于最佳状态n流加发酵最优化的研究内容包括： n （1）状态方程

4、的建立n （2）目标泛函的确定n （3）最优化底物流加方式的求解.流加发酵的物料衡算式可以表达为：XVdtXVd)(FSXVdtSVdF)(XVdtPVd)(FdtdV流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值(最大值)原理等.在采用流加发酵技术之前要考虑的两个在采用流加发酵技术之前要考虑的两个问题问题一、何时采用流加发酵方式？一、何时采用流加发酵方式？二、如何进行底物的流加？二、如何进行底物的流加？.一、何时采用流加发酵方式？一、何时采用流加发酵方式？ 所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制作用作用 高菌体浓度培养即高密度培养系统高菌体浓度培养即高密度培养

5、系统 非生长耦联性次级代谢产物非生长耦联性次级代谢产物( (如产物的合如产物的合成需要某些营养物质或前体成需要某些营养物质或前体) ) 利用营养突变体的系统利用营养突变体的系统( (过量加入营养物只能使菌体过量加入营养物只能使菌体迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小 ) ) 营养缺陷型菌株的培养营养缺陷型菌株的培养.二、如何进行流加发酵操作？二、如何进行流加发酵操作？1. 流加发酵类型流加发酵类型2. 采用流加发酵应该解决的关键问题？采

6、用流加发酵应该解决的关键问题？3.流加发酵过程中某些重要参数的确定流加发酵过程中某些重要参数的确定4.合适的流加发酵类型的确定合适的流加发酵类型的确定5. 流加方式的应用流加方式的应用.1. 流加发酵类型流加发酵类型流加发酵的分类流加发酵的分类类别类别流流 加加 方方 式式无 反 馈 控无 反 馈 控制制反馈控制反馈控制恒流量流加、变流量流加和间歇流加恒流量流加、变流量流加和间歇流加直接控制流加、间接控制流加直接控制流加、间接控制流加定值控制流加、程序控制流加、最优控制流定值控制流加、程序控制流加、最优控制流加加.2. 采用流加发酵应该解决的关键问题采用流加发酵应该解决的关键问题(1) 流加什

7、么物质？流加什么物质？ 补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加葡萄糖、葡萄糖、 饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油脂，有时也能同时起到补充碳源的作用脂，有时也能同时起到补充碳源的作用 补充菌体所需要的氮源，有机氮或氨水补充菌体所需要的氮源，有机氮或氨水 加入某些微生物生长或合成需要的微量加入某些微生物生长或合成需要的微量元素或无机盐元素或无机盐 加入酶合成诱导物或前体物质加入酶合成诱导物或前体物质.(2) 如何流加？如何流加？ a.底物流加速率底物流加速率 b.流加开始时间及总流加时间流加开始时间及总流加时间 c.需控制的

8、底物浓度需控制的底物浓度.3. 流加发酵过程中某些重要参数的确定流加发酵过程中某些重要参数的确定 最佳底物浓度的确定最佳底物浓度的确定 (包括菌体生长阶段和产物合成阶段包括菌体生长阶段和产物合成阶段)b. 底物的消耗速率底物的消耗速率c. 菌体比生长速率菌体比生长速率( )d. 菌体对底物的产率系数菌体对底物的产率系数(Yx/s) 及产物对底物的产率系数及产物对底物的产率系数(Yp/s).4. 合适的流加发酵类型的确定合适的流加发酵类型的确定 a.恒速流加恒速流加(包括单一速率和分阶段恒速流加包括单一速率和分阶段恒速流加) b.指数速率流加指数速率流加 c.底物在线测定后的反馈流加底物在线测定

9、后的反馈流加 (如葡萄糖反馈流加如葡萄糖反馈流加) d. pH-stat e. DO-stat.5. 流加方式的应用流加方式的应用(1) 恒速流加恒速流加采用恒流速流加培养时，可得到如下的物料平衡方程式：细胞平衡：碳平衡：产物平衡：体积平衡：xVrdtVXd)(0)(FSVrdtVSdspdVPVrdtdVFdt.恒流速流加过程中的流量F的确定： 预试验中所得出的流加时刻菌体对所流加基质的消耗速率 发酵液中残留基质浓度 流加后需要控制的发酵液中的基质浓度.(2) (2) 指数速率流加指数速率流加在菌体生长阶段采用指数速率流加法的几点假设如下：(a)发酵罐内为理想混合；(b)葡萄糖为唯一限制性碳

10、源；(c)残留菌体对葡萄糖的产率系数(YX/s)为常数；(d)菌体生长遵循Monod方程。.对底物葡萄糖进行衡算，则：F为体积流加速率(L/h)，S0为流加液中基质浓度(g/L)，Yx/s为菌体对底物的产率系数(g/g)，ms为细胞比维持系数(g/g/h)，X为菌体浓度(g/L)，V为培养液体积(L)，为菌体比生长速率(h-1)。VXmYFSdtVSdssx)()(/0XVmYSFdtdVSdtdSVcx)(/0.对菌体量的变化进行物料衡算，则：XVdtXVd)(假定为常数，则上式积分可得：)(FttFFeVXXV. 由于生长符合由于生长符合Monod方程方程是是S的函数，要使的函数，要使恒定

11、，恒定，S必须必须恒定，则有：恒定，则有：SKSsm0dtdS.)(/0)()(1FttFFssxeVXmYSSF 其中tF为开始指数速率流加的时间， ttF，XF和VF分别为tF时刻的菌体浓度和发酵液体积指数速率流加的速率指数速率流加的速率F的表达式为的表达式为:. 指数速率流加方式在实际过程中的注指数速率流加方式在实际过程中的注意事项：意事项： 方程中各参数要预先求知方程中各参数要预先求知 应用时流加速率应用时流加速率F可采用阶梯递增方可采用阶梯递增方式进行设定式进行设定.微生物的高细胞密度培养微生物的高细胞密度培养.概述概述n发酵研究和工业的一个主要目标是使发酵研究和工业的一个主要目标是

12、使体积生产率（体积生产率（g/Lg/Lh h）最大化，即在最大化，即在给定体积中和一定时间内获得尽可能给定体积中和一定时间内获得尽可能多的产品数量。多的产品数量。n高细胞密度培养是高生产效率的要求。高细胞密度培养是高生产效率的要求。n历史上，高细胞密度培养首先建立在历史上，高细胞密度培养首先建立在酵母上，用以生产单细胞蛋白、乙醇酵母上，用以生产单细胞蛋白、乙醇和菌体。和菌体。.n后来，建立起其它的嗜温菌的高密度培养，生后来，建立起其它的嗜温菌的高密度培养，生产各种类型产品。产各种类型产品。n甲基营养生物的高密度培养导致了聚羟基烷酸甲基营养生物的高密度培养导致了聚羟基烷酸的高效生产的高效生产。n

13、如今，微生物的高细胞密如今，微生物的高细胞密度培养的范畴已包括度培养的范畴已包括细菌、细菌、古细菌和真核生物（酵母）。古细菌和真核生物（酵母）。概述概述.微生物微生物DCW（g/l）细菌细菌 Methylobacterium extorquens233Escherichia coli190180148145Bacillus subtilis184Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599184Streptomyces laurentii157Lactococcus lactis141Pseudomonas putida BM01100古细菌古细菌 Marinococcu

14、s M52132Sulfolobus hibatae114真核真核 Candida brassicae268Saccharomyces serevisiae208235Pichia pastoris100HCDC中各种微生物的最大细胞密度中各种微生物的最大细胞密度概述概述.n随着重组随着重组DNADNA技术的发展，利用大肠杆菌或其它微生物技术的发展，利用大肠杆菌或其它微生物为宿主表达重组蛋白（如干扰素、白介素等）在分子和为宿主表达重组蛋白（如干扰素、白介素等）在分子和策略上已没有问题。但为了提高过程的经济性必需开发策略上已没有问题。但为了提高过程的经济性必需开发高效的培养和发酵技术。高效的培养

15、和发酵技术。 n对大肠杆菌的分子生物学和生理学知对大肠杆菌的分子生物学和生理学知识的熟识，使得它成为高细胞密度培识的熟识，使得它成为高细胞密度培养的先锋微生物养的先锋微生物。 概述概述.反应器反应器生理状态生理状态 代谢流向代谢流向 能量状况能量状况产物产物目的产物目的产物副产物副产物尾气尾气细胞细胞条件条件DO温度温度pH培养基培养基搅拌搅拌压力压力控制控制微生物微生物HCDCHCDC过程示意图过程示意图概述概述.Markl等计算出，填塞满长等计算出，填塞满长3m，直径直径1m细胞的培养液中，只有细胞的培养液中，只有25的空间是培养基。的空间是培养基。考虑到细胞干重是湿重的考虑到细胞干重是湿

16、重的2025%，细胞的，细胞的最大密度应该是最大密度应该是160200g(DCW)L。 高细胞密度带来的问题：高细胞密度带来的问题：底物对生长的限制或抑制底物对生长的限制或抑制产物或代谢副产物的抑制产物或代谢副产物的抑制CO2和热量和热量粘度增加、混合不充分粘度增加、混合不充分1. 氧的限制氧的限制当细胞浓度超过当细胞浓度超过200g(DCW)L-1时，培养液的粘度迅速增加，在时，培养液的粘度迅速增加，在220g(DCW)L-1几乎失去流动性。几乎失去流动性。 概述概述.反应器反应器HCDC的生物反应器类型包括：的生物反应器类型包括：n具有底物流加装置的通用式搅拌罐反应器具有底物流加装置的通用

17、式搅拌罐反应器n带有各种内置或外置细胞维持装置的搅拌带有各种内置或外置细胞维持装置的搅拌罐反应器罐反应器n膜透析反应器膜透析反应器n气升式反应器气升式反应器n陶瓷膜摇瓶陶瓷膜摇瓶 .透析反应器透析反应器反应器反应器.HCDCHCDC问题的解决问题的解决 HCDC遇到的主要问题有：遇到的主要问题有：n产物或代谢副产物的积累对生长的抑制产物或代谢副产物的积累对生长的抑制n氧的限制氧的限制nHCDC中培养基粘度不断增加，引起混合不充分中培养基粘度不断增加，引起混合不充分nCO2和热量的高释放率和热量的高释放率下面以大肠杆菌为例，来探讨如何解决下面以大肠杆菌为例，来探讨如何解决HCDCHCDC中中的问

18、题。的问题。.大肠杆菌大肠杆菌HCDC中乙酸的形成中乙酸的形成n乙酸是大肠杆菌流入中心代谢途径的碳超过生物合成乙酸是大肠杆菌流入中心代谢途径的碳超过生物合成的需要和产生能量超过细胞的容量时产生的。的需要和产生能量超过细胞的容量时产生的。n高浓度的乙酸（如高浓度的乙酸（如pH7，超过，超过5gL-1）会降低会降低HCDCHCDC的生的生长速率、生物量和可获得的最大细胞密度。长速率、生物量和可获得的最大细胞密度。n乙酸毒害作用的机理还未被阐明。乙酸毒害作用的机理还未被阐明。很有可能是因为抑很有可能是因为抑制制DNADNA、RNARNA、蛋白质和脂肪的合成。蛋白质和脂肪的合成。HCDCHCDC遇到的

19、问题遇到的问题.n控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下 一般可通过控制限制性底物浓度控制比生长速率。一般可通过控制限制性底物浓度控制比生长速率。 比生长速率临界值：比生长速率临界值： 在复合和半合成培养基中，约为为在复合和半合成培养基中，约为为0.2h-1和和0.35h-1； 在合成培养基中，为在合成培养基中，为0.14h-1。 HCDCHCDC遇到的问题遇到的问题减少乙酸合成的方法减少乙酸合成的方法.n选择合适的培养基选择合适的培养基 例如，甘油比葡萄糖吸收进入细胞的速度要慢，可例如，甘油比葡萄糖吸收进入细胞的速度要慢，可能会减少流入糖酵解途径的碳，这会极

20、大的减少乙能会减少流入糖酵解途径的碳，这会极大的减少乙酸的合成。酸的合成。HCDCHCDC遇到的问题遇到的问题此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸），此外，加入某些氨基酸（如谷氨酸、甲硫氨酸），可减轻乙酸的毒害作用。可减轻乙酸的毒害作用。使用酸和碱调节使用酸和碱调节pHpH而积累下来的盐会使乙酸的毒害而积累下来的盐会使乙酸的毒害作用加强。作用加强。.大肠杆菌大肠杆菌葡萄糖葡萄糖PtaAckAck乙酸乙酸去往其它产物去往其它产物（乙醇、乙醛等）（乙醇、乙醛等）TCA循环中循环中过剩的碳过剩的碳乙酸代谢过程示意图乙酸代谢过程示意图磷酸转移磷酸转移酶体系酶体系修饰修饰截断截断加强加强n代谢工程的

21、方法减少乙酸合成代谢工程的方法减少乙酸合成CoA.氧的限制氧的限制n氧经常是高细胞密度培养的限制因素。氧经常是高细胞密度培养的限制因素。n因为氧的溶解度很低。因为氧的溶解度很低。2525、1 1大气压下，水中饱大气压下，水中饱和溶解氧浓度为和溶解氧浓度为7 7mgLmgL-1-1。 HCDCHCDC遇到的问题遇到的问题 提高溶氧的方法有：提高溶氧的方法有：n提高通气速率和搅拌速度提高通气速率和搅拌速度 n富氧空气和纯氧富氧空气和纯氧n在加压环境下培养在加压环境下培养.混合的限制混合的限制nHCDCHCDC的另一个物理限制。的另一个物理限制。n发酵罐体积越大问题越明显。发酵罐体积越大问题越明显。

22、n靠近进料口部分的细胞暴露在高浓度营养物中。靠近进料口部分的细胞暴露在高浓度营养物中。n而其它位置的细胞则处于饥饿状态。而其它位置的细胞则处于饥饿状态。HCDCHCDC遇到的问题遇到的问题有必要研究发酵罐中的搅拌模型，找到改善搅拌的方法。有必要研究发酵罐中的搅拌模型，找到改善搅拌的方法。.二氧化碳和放热的影响二氧化碳和放热的影响nHCDCHCDC中高细胞密度培养中的二氧化碳会影响细胞的生长。中高细胞密度培养中的二氧化碳会影响细胞的生长。高高COCO2 2分压（分压（0.30.3atmatm）会降低生长速率并刺激乙酸的生成。会降低生长速率并刺激乙酸的生成。n放热也是高细胞密度培养的一个问题。放热

23、也是高细胞密度培养的一个问题。这些问题可通过降低细胞比生长速率而部分的解决。这些问题可通过降低细胞比生长速率而部分的解决。热量的主要来源是搅拌产生的机械热和细胞代谢产生的热量。热量的主要来源是搅拌产生的机械热和细胞代谢产生的热量。HCDCHCDC遇到的问题遇到的问题.温度的影响温度的影响n把培养温度从把培养温度从37降到降到2630，会降低营养吸收和，会降低营养吸收和生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。n降低温度也能减少细胞对氧的需求。降低温度也能减少细胞对氧的需求。n降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质降低重组细胞温度也有

24、可能减少包含体形式的蛋白质的产生。的产生。以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌进行高细胞密度培养进行高细胞密度培养。HCDCHCDC遇到的问题遇到的问题.流加控制策略流加控制策略有两种主要的营养流加控制策略：有两种主要的营养流加控制策略：n开环（无反馈）控制开环（无反馈）控制n闭环（反馈闭环（反馈）控制）控制n补料方式是高细胞密度培养取得成功的关键因素。补料方式是高细胞密度培养取得成功的关键因素。n它不仅影响最大可获得细胞的浓度，而且影响细胞的产率。它不仅影响最大可获得细胞的浓度，而且影响细胞的产率。n产物形成会受各种补料策略的影响。

25、产物形成会受各种补料策略的影响。n高细胞密度培养通常在营养（碳）限制的条件下进行。高细胞密度培养通常在营养（碳）限制的条件下进行。.条件条件预设参数预设参数开环（无反馈）控制开环（无反馈）控制流加控制策略流加控制策略DO温度温度pH培养基培养基搅拌搅拌压力压力流加流加控制控制.无反馈控制的流加策略无反馈控制的流加策略n恒速流加恒速流加以预先决定的（恒定的）速率流加营养物质，比生长速率逐渐降低。n加速流加加速流加以逐渐增加的速率流加营养物质。可补偿一些比生长速率的降低。n指数流加指数流加以指数的速率流加营养物质。可得到恒定的比生长速率。 流加控制策略流加控制策略.条件条件闭环（反馈）控制闭环（反馈）控制即时即时DO即时即时pHCER细胞浓度细胞浓度碳源浓度碳源浓度反馈控制反馈控制流加控制策略流加控制策略DO温度温度pH培养基培养基搅拌搅拌压力压力流加流加控制控制.间接反馈控制间接反馈控制n即时即时DO当DO降低时补加营养物质。n即时即时pH主要碳源耗尽引起pH上升时补加营养物质。n二氧化碳释放率（二氧化碳释放率（CER）CER基本正比于碳源的消耗速度。这一方法最为经常用于控