表没食子儿茶素没食子酸酯减轻大鼠血管滑腻肌细胞钙化的实验研究

1、表没食子儿茶素没食子酸酯减轻大鼠血管滑腻肌细胞钙化的实验研究徐华，纳春祥，李桂忠，曹军【摘要】 目的观看表没食子儿茶素没食子酸酯 (epigallocatechingallate, EGCG)对大鼠血管滑腻肌细胞钙化的阻 碍。方式 制备8-甘油磷酸盐诱导血管滑腻肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)钙化模型。实验分为4组：对照组、钙化组、 单纯EGCG组及EGCG干与组(又分为10-7、10-六、10-5和10-4 mol <-1 的EGCG 4个亚组)。Von Kossa染色观看细胞钙化情形，生化试剂盒 比色法测定钙含量及碱性磷酸酶(alkal

2、ine phosphatase, ALP)活性。 结果VSMCs钙化组Von Kossa染色见滑腻肌细胞内和细胞间基质有大 量黑色颗粒聚集;与对照组比较，钙化组VSMCs钙含量、ALP活性均有 明显增加；10-710-4molL-1 EGCG干与组VSMCs钙含量、ALP活性 呈剂量依托性有显著降低。结论EGCG具有抑制VSMCs钙化的作用。【关键词】表没食子儿茶素没食子酸酯;血管钙化绿茶及其要紧提取物表没食子儿茶素没食子酸酯 (epigallocatechingallate, EGCG)可延缓动脉粥样硬化的形成和进 展，降低动脉粥样硬化的危险1-2,且能够抑制由血管紧张素H (angiote

3、nsin II, Ang H )诱导的 c-Jun mRXA 的表达，使 c-Jun 氨基 端激酶(JNK)的激活受阻，从而抑制由Angl【刺激产生的血管滑腻肌细 IM (vascular smooth muscle cells, VSMCs)肥大，防治心血管疾病(高 血压、动脉粥样硬化和血管成形术后再狭小等)3。本研究组已证明 4,绿茶可明显减轻大鼠血管钙化模型的钙化程度，且绿茶抑制钙化 的效应可能部份与干与血浆和血管组织的AngH系统有关。但绿茶要 紧提取物EGCG与血管钙化之间的关系迄今未见报导。本研究拟在制备 大鼠血管滑腻肌细胞钙化的模型上，观看EGCG对血管钙化的阻碍，以 探讨EGC

4、G对血管钙化的作用。1材料与方式材料雄性Sprague-Dawley大鼠150180g,由宁夏医科大学实验动物 中心提供。甘油磷酸钠、DMEM胰蛋白酶及EGCG购自Sigma公司； 胎牛血清购自武汉三利生物制品厂;碱性磷酸酶、钙测试盒购自南京建 成生物技术;其余试剂均为市售分析纯。原代大鼠血管滑腻肌细胞培育取材及培育材料的制备取大鼠，胸腹部备皮，环枕关节脱臼 后，消毒、开胸，暴露并分离主动脉至腹主动脉肾动脉分支处。将 分离出的动脉，置入预先加有培育液的无菌培育皿中，清洗，剥除外 膜的纤维脂肪层。纵向剖开血管，内膜面向上，用刀片刮内膜12 次。警惕撕下近内膜面的中膜层，浸泡在含10%胎牛血清的D

5、MEM培 育液内，将血管条剪成1 mmXl mm的小块。原代血管滑腻肌细胞接种与培育用吸管将小块组织吸出注入培 育瓶中，在瓶底壁上摆置均匀，以小块间距离cm为宜，轻轻翻转培 育瓶，瓶底朝上(注意勿使组织块流开)，加入培育液，37, 5% C02 培育。培育24h后慢慢翻转培育瓶，令液体缓缓覆盖组织小块，注意 勿使组织小块从瓶壁上冲掉，再继续培育约5d,可见滑腻肌细胞从组 织块的断面中长出，待接近长满瓶底85%时即可传代。大鼠血管滑腻肌细胞钙化模型的制备及实验分组参照文献5 组织块贴壁法培育大鼠VSMCs,培育液为含15%(v/v)胎牛血清的DMEM, 细胞呈梭形及典型的“峰谷”状生长，成“峰”

6、部位细胞密集多层生 长，而成“谷”部位细胞密度相对较少，a-actin免疫组化染色阳性 证明培育的细胞为VSMCs。实验用58代细胞，将细胞按IX 105个孔 -1接种于24孔培育板，每组6孔，分为：对照组(C0N)：单纯DMEM 培育基(含15%FBS,下同)培育;钙化组(VDN)：培育基中加入10-3 mol -L-1的B-甘油磷酸盐;EGCG组：培育基含10-4 mol - L-1的EGCG;钙化+EGCG组(VD'+EGCG)：在钙化培育液中别离加入10-7.10- 六、10-5和10-4 mol - L-1的EGCG,共分四个亚组。每2天换液1 次，10d后搜集细胞做下述测定

7、。血管滑腻肌细胞Von Kossa染色参照文献5的方式制作细胞爬片，孵育终止后将培育的细胞放入 4, 4%的多聚甲醛溶液中固定45 min,蒸镭水清洗后将玻片放入5% 的硝酸银溶液中，在紫外灯下照射30 min,经%的硫代硫酸钠溶液定 影处置5min后，碱性品红返染，脱水、透明、封片，于光镜下观看。血管滑腻肌细胞总钙含量6和碱性磷酸酶(ALP)活性测定细胞培育终止后用冷的PBS洗3次，用刮刀把细胞刮入200 HL 的溶解缓冲液%NP-40溶于10-3 mol - L_1 MgC12)中，利用超声波破碎 (功率40 W),样品试管置入冰水中，破碎10s,暂停10s,共6次， 破碎成效用显微镜证明

8、，然后离心(4, 3500 r min-1, 10 min), 取上清液。用生化试剂盒比色法进行细胞钙含量及ALP活性测定。统计学方式数据以均数土标准差表示(土 s),两样本均数间比较采纳t查验, 多样本均数间比较采纳One-way ANOVA查验，组间的两两比较采纳Student-Newman- Keuls （SNK）方式查验，以P&lt;为不同有统计学意义。2结果血管滑腻肌细胞Von Kossa染色正常大鼠VSMCs呈梭形，贴壁正常，无钙沉积现象（图1A,见封 3）o 8-甘油磷酸盐诱导的钙化VSMCs生长9lid后，细胞聚集呈菊 花状的结节，胞内及细胞间质可见大量钙沉积（黑色颗粒

9、沉积），部份 聚集成团并形成钙结节（图1B,见封3）;而经不同浓度的EGCG处置后 的钙化VSMCs钙沉积明显减少（图1CF,见封3）o血管滑腻肌细胞钙含量的转变与对照组比较，甘油磷酸盐诱导的VSMCs钙化组，其细胞总钙 含量高倍（P&lt;。与B -甘油磷酸盐钙化组相较，EGCG 10-六、10-5和10-4 molLT 与13 -甘油磷酸盐一起孵育减少其诱导的细胞钙含量，别离低、% 和（均P&lt;,其相关分析见图2。血管滑腻肌细胞碱性磷酸酶的转变VSMCs钙化组ALP活性较对照组高倍（P&lt;,见表1。EGCG （10-7、 10-六、10-5和10-4molL

10、-1）呈浓度依托性降低B -甘油磷酸盐诱导 的钙化VSMCs的ALP活性，与钙化组比较，别离低（P&lt;、和（均 P&lt;,其相关分析见图3。表1 VSMCs钙含量、ALP活性转变（土s, n=6）3讨论本实验用B -甘油磷酸钠诱导大鼠VSMCs钙化5,引发大鼠VSMCs 总钙含量增加，ALP活性增强，VonKossa染色可见VSMCs内有大量钙 沉积及钙结节形成等典型血管钙化表现，与文献报导一致6,说明 VSMCs钙化模型成立成功。在离体培育的P -甘油磷酸盐诱导的VSMCs钙化模型上，用绿茶的 要紧提取物EGCG进行干与，呈浓度依托性降低VSMCs的ALP活性，减 轻细

11、胞钙超负荷;本实验条件下，随培育用EGCG浓度的增加，VSMCs 钙化程度慢慢减轻。以上结果提示EGCG具有抑制VSMCs钙化的作用。 研究已证明，绿茶干与血管钙化的效应与下调血浆和血管组织的Ang II有关4,而EGCG抑制血管钙化效应是不是与AngII下调有关，及 与其他钙化调剂因子如肿瘤坏死因子、尾加压素等的关系值得进一步研究。【参考文献】1 Janie EM, Portocarrero C, Zhu Y, et al. Effect of Long-Term Oral Administration of Green Tea Extract on Weight Gain and Gluc

12、ose Tolerance in Zucker Diabetic (ZDF) RatsJ. J Herb Pharmacother, 2005, 5 (3): 5565.2J Bursill CA, Roach PD. Modulation of cholesterol metabolism by the green tea polyphenol (-)-epigallocatechin gallate in cultured human liver (HepG2) cells J. J Agric Food Chem, 2006, 54 (5) : 1621.3 Zheng Y, Song

13、HJ, Kim CH, et al. Inhibitory effect of epigallocatechin 3-0-gallate on vascular smooth muscle cell hypertrophy induced by angiotensin II J. J Cardiovasc Pharmacol, 2004, 43 (2) : 200.4徐华，万定，杨晓明，等.绿茶对实验大鼠血管钙化的阻碍 J.宁夏医学院学报,2020, 30(4): 424-426.5 Tintut Y, Parhami F, Bostrom K, et al. cAMP stimulates osteoblast-like differentiation of calcifying vascular cells.Potential signaling pathway for