不同毒性条锈菌生理小种分泌蛋白基因变异分析

1、xxxxx大学本科生毕业论文（设计） 题 目： 不同毒性条锈菌生理小种分泌蛋白基因变异分析学 院： 生命科学学院 专业班级： xx级生物技术xx班 学生姓名： xx 指导教师： xxx教授 撰写日期： 201x 年 x 月 xx日不同毒性条锈菌生理小种分泌蛋白基因变异分析xx生命科学学院摘 要：小麦条锈病是世界性小麦病害，在全球大多数小麦产区均有发生，严重威胁小麦粮食生产安全。小麦条锈病是由条形柄锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici，Pst）引起的叶部病害，属担子菌亚门柄锈菌属。通过对CY32（China）、CY23 (China) 、PK-CDRD(P

2、akistan）、Pst-78 (US)菌种的扩繁，收集到了足量的条锈菌,然后对其用CTABSDS法提取条绣菌基因组DNA；通过对重测序结果进行分析，筛选出一个候选分泌蛋白基因striiformis_Gene7472进行测序验证，发现这个基因在四个生理小种之间存在单核苷酸多态性（SNP） 、小片段插入缺失（InDel)变异。关键词: 小麦条锈病；单核苷酸多态性；短序列的插入/缺失variation analysis of different isolates secretory protein gene HE Sheng(College of Life Sciences)Abstract:Wh

3、eat stripe rust is a worldwide wheat disease, occurring in most of the wheat producing regions, threatening the safety of wheat grain production.Wheat stripe rust (Puccinia striiformis f. sp. tritici. Pst) caused by leaf disease, belongs to basidiomycotina Puccinia.We inoculate CY32 (China), CY23 (C

4、hina), PK-CDRD (Pakistan), Pst-78 (US) on the wheat cultivars MX169, collected plenty of stripe rust;Then we extract the genomic DNA by using the method of CTABSDS, and selected a candidate secretory protein gene striiformis_Gene7472 by collating and organizing the re-sequencing results.Finally we i

5、dentify the results and found that the gene between the four isolates exist single nucleotide polymorphisms (SNP) , a small fragment insertion deletion (InDel) variation.Key words : Wheat stripe rust;SNP;InDel引言 小麦锈病是世界性小麦病害，包括条锈病、叶锈病与秆锈病，在全球大多数小麦产区均有发生，严重威胁小麦粮食安全生产。同时，锈菌可借助气流实现高空远距离传播，导致病害在各个小麦产区间流

6、行，是影响粮食安全的重大生物灾害。小麦锈病曾频繁造成包括我国在内的全球小麦主产国毁灭性的产量损失。仅建国后,条锈病在我国就发生了9次大流行，对小麦生产造成了灾难性的影响。特别是1950、1964、1990和2002年的四次大流行分别使小麦减产60亿kg、32亿kg、25亿kg和10亿kg。进入本世纪以来，由于小麦条锈菌毒性变异和新小种产生，小麦条锈病已在我国小麦产区连续流行了近10年，年损失小麦在10亿公斤左右。 近年来，小麦锈病在全球的发生和流行引起各国科学家的高度关注，世界各国非常重视小麦锈病研究工作。在诺贝尔和平奖获得者N. E. Borlaug博士的倡导下，国际博伦厄全球麦锈病协作中心

7、（/）组织各国科学家开展合作研究，在全球范围内共同抵御锈病对小麦造成的威胁。Hovmøller等在国际学术顶级期刊“Science”上也特别撰文警示，锈病将在世界范围内引致更为广泛而严重的暴发流行。因此，持续有效控制小麦锈病是确保小麦稳产增产的重要保障。 小麦条锈菌在小麦上先产生亮黄色的夏孢子堆（urediniospore）和夏孢子（uredium），每个夏孢子堆均可持续产孢数天，由夏孢子堆形成的纵向扩展病斑可以维持较长时间的产孢。随着小麦叶片逐渐衰老，以及不适合其夏孢子生长的逆境刺激下，条锈菌开始形成黑色的冬孢子堆（teliospor

8、e），继而产生双孢冬孢子（telium），每个冬孢子细胞都含有一个经过核配形成的二倍体细胞核（姚娟妮等 2012）。冬孢子成熟萌发后，产生担孢子（basidiospore）和担子（basidium），担孢子在适宜的条件下可以侵染转主寄主小檗，并在小檗叶片的正面形成性孢子器（pycnium）和性孢子（pycniospore），随后在小檗叶片的背面，与正面性子器相对的地方，产生乳突状的锈孢子器（aecium），锈子器发育成熟后可以释放锈孢子（aecidospore），而锈孢子可以侵染小麦，在小麦上产生条锈菌夏孢子，完成其有性生活史周期1。这一惊人的发现证明了小麦条锈菌存在着有性阶段，为更深入的研究

9、小麦条锈病发生流行的规律和病原菌遗传变异的机制提供了重要途径。 小麦条锈病菌主要以夏孢子在小麦上完成周年的侵染循环。目前尚未发现病菌的转主寄主。其侵染循环可分为越夏、侵染秋苗、越冬及春季流行四个环节。小麦条锈菌在我国甘肃的陇东、陇南、青海东部、四川西北部等地夏季最热月份旬均温在20以下的地区越夏。秋季越夏的菌源随气流传播到我国冬麦区后，遇有适宜的温湿度条件即可侵染冬麦秋苗，秋苗的发病开始多在冬小麦播后1个月左右。秋苗发病迟早及多少，与菌源距离和播期早晚有关，距越夏菌源近、播种早则发病重。当平均气温降至12时，条锈菌开始进入越冬阶段。一月份平均气温低于67的德州、石家庄、介休一线以北，病菌不能越

10、冬，而这一线以南地区，冬季最冷月均温不低于上述温度的四川、云南、湖北、河南信阳、陕西关中、安康等地则可以菌丝状态在病叶里越冬，成为当地及邻近麦区春季流行的重要菌源基地。翌年小麦返青后，越冬病叶中的菌丝体复苏扩展，当旬均温上升至5时显症产孢，如遇春雨或结露，病害扩展蔓延迅速，引致春季流行，成为该病主要为害时期。在具有大面积感病品种前提下，越冬菌量和春季降雨成为流行的两大重要条件。如遇较长时间无雨、无露的干旱情况，病害扩展常常中断。因此常年发生春旱的华北发病轻，华东春雨较多，但气温回升过快，温度过高不利该病扩展，发病也轻。只有早春低温持续时间较长，又有春雨的条件发病重。品种抗病性差异明显，但大面积

11、种植具同一抗源的品种，由于病菌小种的改变，往往造成抗病性丧失。 国内外研究表明，病菌毒性变异是导致小麦品种抗病性“丧失”，病害大规模流行的根本原因。因此，揭示小麦病原菌毒性变异的基础是解决品种抗性“丧失”，实现病害持久控制的必由之路。锈菌毒性变异的根源是遗传物质的变异，在分子水平揭示毒性及其变异的物质基础至关重要。生物遗传变异的重要表现是其基因组及其表达的变异，包括基因组序列和结构的变异。序列变异主要有单核苷多态性（SNP）、短序列的插入/缺失（indel）、微卫星或简单重复序列（SSR）和转座子等类型；结构改变主要包括有/无变异（presense/absence variation，PAV）

12、和基因拷贝数变异（copy number variation，CNV），主要为基因组区域大范围的插入、缺失、复制、倒置（inversion）和移位（translocation）2。随着新一代高通量测序技术的出现，使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。日益完善测序技术和低廉的成本正在使基因组研究发生革命性变化，大大促进了锈菌基因组学研究。2011年，两个植物锈菌-杨栅锈菌（Melampsora. larici-populina）和小麦秆锈菌（P. graminis f. sp. tritici）基因组测序工作同时完成，并对其中专性寄生菌基因组特性进行了分析3。比较基因组发现，

13、活体专性寄生菌与腐生菌、兼性寄生菌之间基因谱系中保守基因没有显著变化。但具有明显的活体专性寄生菌的典型特性，如分泌组中存在种内特异候选效应子、类效应子小分泌蛋白，氮、硫吸代谢途径有缺失，氨基酸及寡肽的膜转运蛋白家族扩增等4。本课题组也于近期已完成了中国小麦条锈菌生理小种CYR32的测序以及CY23 (China) 、PK-CDRD(Pakistan）、Hu09-2 (Hungary)、104E137A- (Australia) 、Pst-78 (US)的重测序工作，比较基因组学分析将大大加深和促进对条锈菌的进化、毒性变异及致病机制的研究。小麦锈菌菌基因组数据为我们全面解析病菌的毒性变异分子机制

14、提供了信息资源和物质基础。基于全基因组关联分析的方法为研究变异规律提供了思路。2009年Kentaro Yoshida实验室对水稻稻瘟菌进行重测序，全基因组关联分析显示三个新的无毒基因（AVR-Pia,AVR-Pii, AVR-Pik/km/k）5。 最近，HIGS（Host-Induced Gene Silencing，寄主诱导的基因沉默）已应用于植物病害研究，为小麦锈菌功能基因组学研究提供了新的方法和途径。Daniela（2010）等应用HIGS研究小麦白粉菌病，表明寄主诱导的基因沉默通过沉默效应基因Avr10的获得证明，效应基因Avra10可以抑制真菌的发展但不能消除其存在。小麦锈菌关键

15、生长发育和代谢基因、关键效应蛋白基因的鉴定，将为借助HIGS技术利用这些基因来实现持久控制小麦病害提供基因资源和技术保障6。 总结，通过对菌系CY32(China)、CY23(China) 、PK-CDRD (Pakistan）、Pst-78(US）的扩繁，收集到了足量的夏孢子；然后对其用CTABSDS法提取条绣菌DNA；通过对重测序结果基因组分析，选择了两个候选分泌蛋白基因striiformis_Gene7472进行测序验证，发现四个生理小种之间存在SNP 、InDel变异，为下一步进行荧光定量分析以及功能分析奠定了基础。1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 植物材料及培养材料取自不同国

16、家的菌系CY32 (China) 、CY23 (China) 、PK-CDRD (Pakstan）、Pst-78 (US)。优良小麦种子、营养土、蛭石、塑料盆等植物培养材料。1.1.2 培养基及常用溶液配制LB培养基（1L）：蛋白胨10g，酵母提取物5g， NaCl 10g，琼脂粉15g，pH7.0，高压灭菌15min。DNA提取液:200mmol/L Tris-HCl (PH7.4)、25mmol/L EDTA (PH8.0) 、250mmol/L NaCl 、0.5% SDS。1.1.3 各种试剂及耗材异丙醇、75%乙醇、镊子、移液枪、 1.5ml 离心管（EP管）、枪头、小研磨棒、玻璃棒

17、、小试管、Master Mix、PCR热循环仪，移液枪、枪头、96孔样板、琼脂糖、溴化乙锭（EB）、琼脂糖凝胶电泳仪、微波炉、称量纸、三角瓶、量筒、恒温培养箱、离心机、超低温冰箱、高压灭菌锅、涡旋混匀器、凝胶成像体统、电热恒温水浴锅、超净工作台、有PCR仪、电泳仪、常温离心机、高速冷冻离心机、全智能光照培养箱、恒温摇床、分析天平、显微镜、通风橱、纯水仪等。1.2 实验设计及技术路线DNA提取菌种的收集 基因组变异分析（SNP、InDel 揭示小麦条锈菌基因组变异与其毒性变异关系测序鉴定，确定变异区段1.3 实验方法1.3.1 小麦的种植以及条锈菌的收集：小麦条锈病菌属于专性寄生菌，尚不能进行离

18、体培养（不能在人工培养基上进行培养），限制了通过分子手段对小麦条锈病菌群体遗传结构和生理小种变化的研究，只能通过侵染小麦，收集，再侵染，再收集的方法富集小麦条锈菌，以进行下一步的研究。1) 准备阶段：1 材料：森林土壤、蛭石、筛好的细黄土、小麦种子（铭贤169，特点不抗小麦条锈病，即易被侵染），小花盆，托盘，喷壶、量杯、一次性手套，镊子等。2 栽培土壤的准备：森林土壤和蛭石按2：1的比例混合，再添加适量的水混合均匀，以混合后的土壤可以捏成团，但不会有水渗出为宜。将处理好的土壤分批装入到小花盆中去，并将表面弄平、压实。（为下一步小麦的播种做准备）3 小麦的播种：在压好的土壤表面，按五行五列的标准

19、播种小麦（间距要均匀）。4 覆土的准备：将处理好的细黄土和森林土壤（1：1）混合，揉搓均匀，不要留有的较大的颗粒。将处理好的覆土均匀的洒在小麦种子上，覆盖一层，不要太厚也不要太薄，太厚小麦不容易出苗，太薄小麦苗容易长不稳。5 后处理：将栽种好的小花盆均匀的摆放在托盘上，并将托盘放置在室温向阳的地方，在托盘中浇上适量的水。待小麦出苗后转移到控温控湿的培养室。记录下播种时间。6 待小麦苗长到合适的高度后进行下一步的操作，一般为一周左右。2) 人工接菌阶段1 菌种：一般有CY32 (China) 、CY23 (China) 、PK-CDRD (Pakstan）、Pst-78 (US)的菌种。2 器材

20、：喷壶，烧杯，泡沫盒、空气加湿器，玻璃棒，剪刀，大头针等3 步骤：1、处理和筛选：对所有小花盆中长出的小麦苗进行处理，用剪刀将未长到对应高度的、高度过高的、倒伏的苗剪去不要。并将所剩苗过少的小花盆予以淘汰。最终剩下的就是我们进行下一步操作需要的。 2、脱腊：a、原理：小麦叶片的表面有一层角质层，会增加锈病菌侵染失败的几率，所以我们要先脱腊。b、方法：用烧杯盛取洁净的水，用食指和大拇指蘸水，捏住叶片来回的捋动即可完成脱腊目的。注意：不要太大力，挣断或损伤叶片。4 潮湿环境的创造：空气加湿器中加入洁净的水，源源不断的向干净的泡沫盒中通入潮湿空气，以创造潮湿的环境。5 接菌：（麦苗经过脱腊后就可以进

21、行接菌操作了） a、取一张锡箔纸，倒取少量的某一菌种 b、先用喷壶喷洒苗，保持湿润，取一根洁净的大头针，将叶片表层多余的水刮去 c、用大头针蘸取锡箔纸上的菌种，顺着叶片纹路涂抹在小麦叶片的上表皮 d、确定每一叶片均接菌种后，用喷壶以悬喷的方式喷水，使水雾自然飘落在叶片上e、将接完菌的花盆做好标签放入泡沫盒中，保湿等待下步处理注意事项：1、取菌的时候要本着用多少取多少的原则。2、接菌的时候不能损伤叶片。3、接菌完成后的喷水不能对着喷，在泡沫盒中也不能直接对着通气的管子，以防将接上的菌喷落。4、不同的菌种接种时要分开接种，防止污染。6 暗处理：在泡沫盒中加水，并用黑色塑料袋盖住顶部（但不能太严，保

22、持通气），转移到人工气候箱中进行控温控湿培养24h48h。7 暗处理完成后，转入培养室正常处理。8 其他重要细节操作：套袋，暗处理完成后，将塑料纸制成桶装整齐的套在小花盆上，注意过程中不要损伤叶片，目的为了避免相互之间的交叉感染。要注意经常浇水和喷水。3) 菌种的收集 侵染成功的小麦苗会呈现出相应的条锈病病理状态，并开始萌发孢子，且大约15天后到达高峰期，我们则要趁这段时间收集菌种孢子。器材：玻璃棒，试管，剪刀等（均要洁净，避免污染）步骤：1 收菌要一盆一盆的来，使小花盆倾斜的靠在托盘上，且托盘处于桌子的边缘。轻轻的取下塑料套，使小麦叶片自然缓慢的下垂。2 取之前准备好的试管将一片小麦叶片伸入

23、其中，用玻璃棒敲动试管，使孢子震落在试管中即完成收集。重复此操作，直到确定每一片叶片上的孢子都收集完了。3 重复操作把所有的小麦苗都收集完。收集完的小麦苗要重新套袋，培养，进行下次收集。4 收集菌种孢子的试管要做好标签，放入干燥器，低温保存。注意事项：1 整个过程要经可能的轻柔，避免碰撞，以防孢子的损失。2 收菌时要保证所选的叶片与其他叶片尽量不交联，且敲动时不要震动到其他叶片造成损失。3 收完菌后要注意剪二叶，即剪去多余的叶片保证营养的供应，新长出的苗业应剪去。整个过程注意不要损伤长有菌斑的叶片。4 不同的菌种要分开收集防止交叉，混合，影响后期的实验。4）菌种的保存 要保存在干燥器里，且试管

24、口用塑料纸包裹住（用皮筋缠住），放4冰箱里低温保存！1.3.2 CTABSDS法提取条绣菌DNA:1) 称取50g夏孢子，液氮研磨至粉状，转入两个2ml离心管。2) 加入1mL预热的CTAB(PH8.0）提取液:(2%CTAB,1.4M NaCl,0.02M EDTA,0.1MTris-cl, 0.2%巯基乙醇），充分混匀。3) 置65水浴1h左右，上下翻转几次保证混匀，10min一次4) 加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）轻轻颠倒混匀冰水浴5min，12000rpm离心10min，转移上清。5) 加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀冰水浴5min，1min摇一次，4，12000rpm离心1

25、0min，转移上清。6) 取上清液移入1.5ml离心管，加入1/2体积的7.5M pH7.5 NH4OAc，2倍体积异丙醇到样品中，混匀，-2010min，12000rpm离心15min;用75%乙醇洗一次，12000rpm，4，离心5min，室温晾干10min。7) 加500l 10mM Tris-Hcl（PH8.0)溶解，5l RNase（10mg/ml) 37温浴20min，加等体积的氯仿轻轻颠倒混匀冰水浴5min，12000rpm，4，10min。8) 取上清，加入1/10体积的3M pH5.3的NaOAc，2.5倍体积无水乙醇，-20静置10min。12000rpm，4,15min，

26、75%乙醇洗两次，加适量50l 10mM Tris-Hcl（pH8.0)溶解，20保存备用。1.3.3 PCR扩增7（1）用Cobuddy Super Fidelity DNA polymerase PCR扩增的反应体系如下：试剂 20l 终浓度 5×Cobuddy PCR Buffer 4l 1×dNTP Mix，2.5mM each 1.6l 200 M eachForward Primer，10M 0.8l 0.4 MReverse Primer，10M 0.8l 0.4 MTemplate DNA <250ng <250ngCobuddy Super F

27、idelity DNA polymerase 0.2l 0.4U/20lPCR反应RNase-Free Water up to 20l （2）按下列程序进行PCR扩增 94 ， 5min 94 ， 30s 58 ， 30s × 30次 72 ， 1min 72 ， 10min 4保存1.3.4 琼脂糖凝胶电泳检测（1）选择并制备琼脂糖凝胶：用电子秤取0.8g琼脂糖放入三角瓶中，加入100mlTAE缓冲液，置于微波炉上加热至完全溶化，室温逐步冷却，至适宜温度加入适量EB（2）制备胶板： 取有机玻璃作胶托盘，洗净晾干，放置于一水平位置，放好挡板。 在适当的位置放好样品梳子（梳子高度0.5

28、1mm，与挡板平行安放）。 倒胶：将冷却到50左右的琼脂糖凝胶倒入作胶托盘中（倒胶时应防止气泡产生，以免影响实验结果的观察） 待胶充分凝固后，取出梳子，去掉挡板（拔出梳子时应小心的平行拔出，以免造成凝胶、点样孔破裂）。 将作胶托盘连同胶一起放入电泳槽中。 加入TE电泳缓冲液至电泳槽中，淹没胶面12mm注：因EB有剧毒，故上述操作需带手套进行操作（3）加样：将PCR扩增的目的产物点样入点样孔注：加样时应小心，以免弄破胶，如使得样孔破裂，造成样品外溢，可能会跑不出好的条带，或条带不清楚，不利于结果的鉴定（4）电泳：接通电泳槽与电泳仪的电源，注意正负极，DNA从负极向正极移动，本实验电泳仪的初始电压

29、调为150V，即不在调动，待染料移动出点样孔至胶的1/2处即可。（5）紫外分析仪扫胶:将胶置于紫外分析仪中电脑操作自动成像，拍照进行结果分析。1.3.5 割胶回收1. 柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500 l平衡液BL，12000 rpm (13400×g )离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）2. 将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。3. 向胶块中加入等倍体积溶液PN（如果凝胶重为0.1 g，其体积可视为100 µl，则加入100 µ

30、l PN溶液），50水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟或再补加一些溶胶液，直至胶块完全溶解 (若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。 注意：对于回收<300 bp的小片段可在加入PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好将溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。4. 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12000 rpm (13400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。

31、注意：吸附柱容积为800l，若样品体积大于800l可分批加入。5. 向吸附柱CA2中加入600l漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000 rpm (13400×g )离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，例如平末端连接实验或直接测序，建议PW加入后静置2-5 min再离心。6. 重复操作步骤5。7. 将吸附柱CA2放回收集管中，12000 rpm (13400×g )离心2 min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。注意

32、：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。8. 将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB（Buffer EB），室温放置2min。12000 rpm (13400×g )离心2 min收集DNA溶液。1.3.6 连载体1) 克隆反应体系：1 室温下（20-30），按照如下体系操作：PCR扩增好的DNA片段 0.58lPCloneEZ-TOPO载体 1l10×Enhancer 1lddH2O Xl 总反应体积 10l加完试剂后，轻轻混匀，然后低速短暂离心，使溶液集中在离心管底。此步骤不要在低温条件下（如碎冰）上操作。2

33、 室温下（20-30)放置5min，然后将离心管放置于冰上。如当天不进行转化实验，将连接产物放置-20保存。2） 转化1. 取5l连接液至50100l刚刚融化的DH10B感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min。2. 42水浴锅中热激30sec。3. 立即放置于冰上静置2min。4. 加入300-500l无菌SOC或LB培养基（不含抗生素），37,200-250rpm振荡培养60min注<2kb片段连AMP载体可以不复苏，直接涂平板。5. 吸取200l菌液铺板，为得到更多克隆，可先3000g离心2min弃掉部分上清，用移液器轻吹菌体，至充分悬浮，取全部菌液涂板，然后37过夜培养（12-16

34、h）。3） 阳性重组子的鉴定(菌落PCR)1. 挑取大小中等的克隆菌至10l无菌水中，充分混合。2. 取2l混合液作为PCR反应的模板，用试剂盒提供的M13F/M13R作为鉴定重组子的引物。3.PCR反应条件：94 2min94 30sec56 30sec 30cycles72 1kb/min （根据片段的大小确定延伸时间）72 10min4.取10lPCR产物电泳鉴定，若载体自连，则引物M13F/M13R扩增出片段大小为143bp。5.确定重组子后，将剩下的8l混合液转接到LB培养基中（含相应抗生素）过夜摇菌培养，然后抽提质粒，用M13F/M13R测序。1.3.7测序结果分析CY32（Chi

35、na）基因组序列长度1356 bp;1 ATGGGCATTT CGATCAAAAC CAATGCTATC TTTCTGCTTA CTGCCACCCT CTCAACTTTA61 CACAACGCGC AACTCGGACT CTGTCACGGT TACATCAAAG CGTGGTCTGC GGATGATGGC121 CATACTTGGA CTTTGGGACA AAAGCAAGAT CTGGCAACAT CTTCGATCCG TGGTTTCTCA181 GAAAACACTG GTTGGATTGG AAGCAAGTTT CTGACCAAAC CTGCCATCGT TTGCAGTTCC241 GGACT

36、AACAC CGAGTCTGAA GGTCGTTGCG CCAAGTGGGG ACCTCTTCAG TCAAGCTGAT301 CAAAGCGCCG GGAAAACTTT GTCGGTGGCA TCCGGGGCTA CAGTGCGCTT GCTAATCAAT361 GACGAACCTC ATAAAATGTG AGTCGGGCAA ATCGAGACTC TTGAACAATC TTGCTTCAAA421 TTTTGGCTTA CCTTTTCACC TTCGGATCTA GATATCCACA TGAGAACGGA CATATTCAGA481 TTTATCTGGG CTACTGCGGC CCCTCAG

37、AAA CCGCGTGCGA AAAATTTGAT GCCGCATCCA541 TTAGTTACTT CAAAATCTTG TCATTGAAGC ATGGGTTAGG ATCCAAGGAA GAATTTCCTT601 ACAACAAACA CAAGGACGGA AATGAAGTCA AAGTGCCGAT CCCCAAAAAT CTACCAATGG661 GTAGTTACAT CATGCGGATC GAATTGTAAG AGTTGTTTCC TTAAGCCCCT CCTCTTTTCA721 AGTCGACGTG AATGTGTGGT ATTGACTCCC AAACACCCTT CTTTCCTTA

38、C GCAGAATTGT781 TTTTGGCCAA TCCTCTGAGG CTGAGGGAAA GCAAAATCAA TATTACATCA CCTGTGGACA841 GATGGCACTC CCCAAACCAG AAATCAACCC ACCAATCTCT ATCGAAAGCT TAGAAAGCGT901 ACGATTTCCA GGCGCATACA AAAACGGAAA CATTGATCCA GAAGATCCTT TACCAGGCCC961 AAATGTCGTG GACTTCTCCG GGGAAGCCCA GGGCTCTGCC AAAGCATCGT CAACAGTTCG1021 ACAGAGT

39、ACT CCTTCTCCTA CCCCTTCTCC TAACGACAGC GGCGAAGATG AAGGATCCAG1081 GCTTTCGGGT AGCGTGCCCG AGTGCGCTAG AGCTTGTCTT GCCAAAAAGA TTTCGGAAAA1141 CGCCGAGGGA AAACTCGGCG TAATTTGCGC CACACCATCA CCTCAACCAG GACAAACCCA1201 AGCACTTTGT CAATGCAAGG ATGAAAAATT TACTGAGGCC TTTGCAAATT GCGCGAGAGA1261 TCATTGTCAG GTAATTTTTT GTTGA

40、AATCT TCTCCCTTTG AATGTAACAT AAGCTGATTT1321 TCCTCTTGAC TATCCGTTCA AACAGCCGGG CTGTGA Pst-78 (US)基因组序列长度1465bp1 ATGATGGGCA TTTCGATCAA AACCAATGCT ATCTTTCTGC TTACTGCCAC CCTCTCAACT61 TTACACAACG CGCAACTCGG ACTCTGTCAC GGTTACATCA AAGCGTGGTC TGCGGATGAT121 GGCCATACTT GGACTTTGGG ACAAAAGCAA GATCTGGCAA CATCTTCGAT

41、 CCGTGGTTTC181 TCAGAAAACA CTGGTTGGAT TGGAAGCAAG TTTCTGACCA AACCTGCCAT CGTTTGCAGT241 TCCGGACTAA CACCGAGTCT GAAGGTCGTT GCGCCAAGTG GGGACCTCTT CAGTCAAGCT301 GATCAAAGCG CCGGGAAAAC TTTGTCGGTG GCATCCGGGG CTACAGTGCG CTTGCTAATC361 AATGACGAAC CTCATAAAAT GTGAGTCGGG CAAATCGAGA CTCTTGAACA ATCTTGCTAC421 AAATTTTGG

42、C TTACCTTTTC ACCTTCGGAT CTAGATATCC ACATGAGAAC GGACATATTC481 AGATTTATCT GGGCTACTGC GGCCCCTCAG AAACCGCGTG CGAAAAATTT GATGCCGCAT541 CCATTAGTTA CTTCAAAATC TTGTCATTGA AGCATGGGTT AGGATCCAAG GAAGAATTTC601 CTTACAACAA ACACAAGGAC GGAAATGAAG TCAAAGTGCC GATCCCCAAA AATCTACCAA661 TGGGTAGTTA CATCATGCGG ATCGAATTGT

43、AAGAGTTGTT TCCTTAAGCC CCTCCTCTTT721 TCAAGTCGAC GTGAATGTGT GGTATTGACT CCCAAACACC CTTCTTTCCT TACGCAGAAT781 TGTTTTTGGC CAATCCTCTG AGGCTGAGGG AAAGCAAGAT CAATATTACA TCACCTGTGG841 ACAGATGGCA CTCCCCAAAC CAGAAATCAA CCCACCAATC TCTATCGAAA GCTTAGAAAG901 CGTACGATTT CCAGGCGCAT ACAAAAACGG AAACATTGAT CCAGAAGATC CT

44、TTACCAGG961 CCCAAATGTC GTGGACTTCT CCGGGGAAGC CCAGGGCTCT GCCAAAGCAT CGTCAACAGT1021 TCGACAGAGT ACTCCTTCTC CTACCCCTTC TCCTAACGAC AGCGGCGAAG ATGAAGGATC1081 CAGGCTTTCG GGTAGCGTGC CCGAGTGCGC TAGAGCTTGT CTTGCCAAAA AGATTTCGGA1141 AAACGCCGAG GGAAAACTCG GCGTAATTTG CGCCACACCA TCACCTCAAC CAGGACAAAC1201 CCAAGCAC

45、TT TGTCAATGCA AGGATGAAAA ATTTACTGAG GCCTTTGCAA ATTGCGCGAG1261 AGATCATTGT CAGGTAATTT TTTGTTGAAA TCTTCTCCCT TTGAATGTAA CATAAGCTGA1321 TTTTCCTCTT GACTATCCGT TCAAACAGCC GGGCTGTGAA GTAGAAGATG CAATCAATTC1381 ATTCAGCAAT TTGTGTGGAC TAAAGACTAA GCCTTCAAGA TGTCAAAATA ACAACAAAAG1441 AGAAAGACCA GTGTTACTCA TTTGAC

46、Y23 (China) 基因组序列长度1346bp1 ATGGGCATTT CGATCAAAAC CAATGCTATC TTTCTGCTTA CTGCCACCCT CTCAACTTTA61 CACAACGCGC AACTCGGACT CTGTCACGGT TACATCAAAG CGTGGTCTGC GGATGATGGC121 CATACTTGGA CTTTGGGACA AAAGCAAGAT CTGGCAACAT CTTCGATCCG TGGTTTCTCA181 GAAAACACTG GTTGGATTGG AAGCAAGTTT CTGACCAAAC CTGCCATCGT TTGCAGTTCC24

47、1 GGACTAACAC CGAGTCTGAA GGTCGTTGCG CCAAGTGGGG ACCTCTTCAG TCAAGCTGAT301 CAAAGCGCCG GGAAAACTTT GTCGGTGGCA TCCGGGGCTA CAGTGCGCTT GCTAATCAAT361 GACGAACCTC ATAAAATGTG AGTCGGGCAA ATCGAGACTC TTGAACAATC TTGCTACAAA421 TTTTGGCTTA CCTTTTCACC TTCGGATCTA GATATCCACA TGAGAACGGA CATATTCAGA481 TTTATCTGGG CTACTGCGGC

48、CCCTCAGAAA CCGCGTGCGA AAAATTTGAT GCCGCATCCA541 TTAGTTACTT CAAAATCTTG TCATTGAAGC ATGGGTTAGG ATCCAAGGAA GAATTTCCTT601 ACAACAAACA CAAGGACGGA AATGAAGTCA AAGTGCCGAT CCCCAAAAAT CTACCAATGG661 GTAGTTACAT CATGCGGATC GAATTGTAAG AGTTGTTTCC TTAAGCCCCT CCTCTTTTCA721 AGTCGACGTG AATGTGTGGT ATTGACTCCC AAACACCCTT CT

49、TTCCTTAC GCAGAATTGT781 TTTTGGCCAA TCCTCTGAGG CTGAGGGAAA GCAAGATCAA TATTACATCA CCTGTGGACA841 GATGGCACTC CCCAAACCAG AAATCAACCC ACCAATCTCT ATCGAAAGCT TAGAAAGCGT901 ACGATTTCCA GGCGCATACA AAAACGGAAA CATTGATCCA GAAGATCCTT TACCAGGCCC961 AAATGTCGTG GACTTCTCCG GGGAAGCCCA GGGCTCTGCC AAAGCATCGT CAACAGTTCG1021

50、ACAGAGTACT CCTTCTCCTA CCCCTTCTCC TAACGACAGC GGCGAAGATG AAGGATCCAG1081 GCTTTCGGGT AGCGTGCCCG AGTGCGCTAG AGCTTGTCTT GCCAAAAAGA TTTCGGAAAA1141 CGCCGAGGGA AAACTCGGCG TAATTTGCGC CACACCATCA CCTCAACCAG GACAAACCCA1201 AGCACTTTGT CAATGCAAGG ATGAAAAATT TACTGAGGCC TTTGCAAATT GCGCGAGAGA1261 TCATTGTCAG GTAATTTTT

51、T GTTGAAATCT TCTCCCTTTG AATGTAACAT AAGCTGATTT1321 TCCTCTTGAC TATCCGTTCA AACAGCCGGG CTGTGA注释(划线的部分为内含子序列）PK-CDRD(Pakistan）基因组序列长度1356bp1 ATGGGCATTT CGATCAAAAC CAATGCTATC TTTCTGCTTA CTGCCACCCT CTCAACTTTA61 CACAACGCGC AACTCGGACT CTGTCACGGT TACATCAAAG CGTGGTCTGC GGATGATGGC121 CATACTTGGA CTTTGGGACA AAAGC

52、AAGAT CTGGCAACAT CTTCGATCCG TGGTTTCTCA181 GAAAACACTG GTTGGATTGG AAGCAAGTTT CTGACCAAAC CTGCCATCGT TTGCAGTTCC241 GGACTAACAC CGAGTCTGAA GGTCGTTGCG CCAAGTGGGG ACCTCTTCAG TCAAGCTGAT301 CAAAGCGCCG GGAAAACTTT GTCGGTGGCA TCCGGGGCTA CAGTGCGCTT GCTAATCAAT361 GACGAACCTC ATAAAATGTG AGTCGGGCAA ATCGAGACTC TTGAACA

53、ATC TTGCTTCAAA421 TTTTGGCTTA CCTTTTCACC TTCGGATCTA GATATCCACA TGAGAACGGA CATATTCAGA481 TTTATCTGGG CTACTGCGGC CCCTCAGAAA CCGCGTGCGA AAAATTTGAT GCCGCATCCA541 TTAGTTACTT CAAAATCTTG TCATTGAAGC ATGGGTTAGG ATCCAAGGAA GAATTTCCTT601 ACAACAAACA CAAGGACGGA AATGAAGTCA AAGTGCCGAT CCCCAAAAAT CTACCAATGG661 GTAGTTACAT CATGCGGATC GAATTGTAAG AGTTGTTTCC TTAAGCCCCT CCTCTTTTCA721 AGTCGACGTG AATGTGTGGT ATTGACTCCC AAACACCCTT CTTTCCTTAC GCAGAATTGT7