缺血性脑损伤治疗新策略：促进血管新生和神经再生

1、文章编号1007-7669（2013）缺血性脑损伤治疗新策略：促进血管新生和神经再生收稿日期 2013-02-03 接受日期基金项目国家自然科学基金（81060349），贵州省科技厅联合资金（黔科合J字LKZ201127号），教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-11-0927），教育部创新团队（IRT1197）作者简介 丁利静，女，硕士研究生，主要从事神经药理学研究；龚其海，男，教授，博士，硕士生导师，主要从事神经药理学研究, Phn：86-852-860-9623，Fax：86-852-860-9266，E-mail：gqh丁利静，石京山，李 菲，黄 彬，杨丹莉，龚其海（遵义医学院 药理

2、学教研室暨贵州省基础药理重点实验室, 贵州 遵义 563000）关键词 脑缺血；血管生成调节剂；神经再生摘要 缺血性脑损伤病因及发病机制仍不完全清楚。目前促进血管新生和神经再生在其发生和发展中的作用日益受到关注。本文综述了近年来关于促进血管新生和神经再生的研究进展，旨在为将来研发治疗缺血性脑损伤治疗药物提供新策略。 中图分类号 R96 文献标志码 ANew strategies for ischemic cerebral ischemia injury therapy: promoting angiogenesis and neurogenesis DING Li-jing, SHI Jing

3、-shan, LI Fei, HUANG Bin, YANG Dan-li, GONG Qi-hai (Department of Pharmacology and the Key Laboratory of Basic Pharmacology of Guizhou Province, Zunyi Medical College, Zunyi GUIZHOU 563000, China)KEY WORDS brain ischemia; angiogenesis modulating agents; nerve regenerationABSTRACT The etiology and pa

4、thogenesis of ischemic cerebral injury are complicated and unclear, and recently promoting angiogenesis and neurogenesis becomes more and more important. This article summarizes the development of promoting angiogenesis and neurogenesis, which aims to provide a new strategy for subsequent developmen

5、t and application of the drug for cerebral ischemic injury therapy.缺血性脑损伤是以脑部缺血性损伤为主要表现的疾病，是脑卒中最常见的临床类型，以高发病率、高致死率及高致残率著称。大量研究证明，缺血性脑损伤是一系列复杂的多环节的病理生理变化过程，早期主要以自由基产生、脑水肿、兴奋性氨基酸毒性为主；中期以炎症、神经元凋亡为主；后期以神经再生、血管新生和胶质细胞增殖为主要表现的脑重构为主。脑血管新生可能为神经元重构提供了关键的神经血管底物1。目前，脑缺血治疗策略有血管方案和细胞方案两种。较为成功的血管方案之一是溶栓剂的应用，缺血后早期

6、应用溶栓剂可以使缺血区尽快得到血供，但由于严格的时间窗（3 6 h）及可能带来的再灌注损伤以及增加出血风险等不良反应而应用受限。另一方案是神经保护剂的应用，即干预半暗带细胞死亡通路，抑制半暗带细胞的死亡。迄今为止，单纯采取挽救神经元的治疗策略并未取得有效的临床效果，因为该策略过于单一，未考虑到脑缺血后发生的级联反应的复杂性2。因而，美国国立神经病学与卒中研究所提出了“神经血管单元”（neurovascular unit，NVU）这一卒中治疗靶点的概念框架，即神经系统的结构和功能单位。神经元与血脑屏障（blood brain barrier, BBB）是NVU的结构基础，包括内皮细胞（endot

7、helium cell，EC）、星形胶质细胞、小胶质细胞、基底膜以及与EC生理作用相近并维持脑组织完整性的细胞外基质3。这一概念主要强调细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用和动态平衡。脑缺血后，NVU内的各种成分之间失衡，引起一系列的“联级”损伤反应。研究表明，上游信号如氧化应激与炎症细胞相互作用，激活EC，上调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）和纤溶酶原激活剂（plasminogen activators, PA），降解细胞外基质，破坏BBB，加重脑缺血损伤反应。因此，对NVU具有多重作用的单一保护剂或者联合治疗策略为卒中治疗带来新的机会4。 本文

8、对此做一综述。神经发生对缺血性脑损伤的意义 神经发生主要局限在海马齿状回颗粒细胞层下（subgranular zone, SGZ）和侧脑室嘴侧室管膜下区（rostral subventricular zone, SVZ）两个区域。FONT等5最近发现神经发生是自出生以后一直持续着并可由损伤激活。SGZ、SVZ、黑质和梗死周边区的前体细胞均产生新的神经元。缺血性卒中晚期的老年人的脑组织经尸检后可看到增殖的SVZ区细胞和成神经细胞增加6。研究7表明，SGZ和SVZ的前体细胞增殖分化成神经元和其他神经细胞，这种迁移方式并不是一成不变的，短暂性局灶性脑缺血损伤后，SVZ的神经干细胞（nerve ste

9、m cell, NSC）可重新定向，向缺血损伤的纹状体迁移，并表达纹状体神经元。1 影响神经发生的体内因素 神经发生是由内在的遗传机制和生长因子控制6。LIU等8表明成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors, FGFs）是多功能的信号蛋白，能调节神经发生。卒中后，FGF8和FGF15在SVZ区域的细胞是上调的，它们参与到嗅球神经发生，而胰岛素样生长因子表达是下降的。另外，白血病抑制因子在卒中的SVZ区细胞中是增加的，并调节胚胎干细胞增殖和分化，故其与神经发生有关联。激肽释放酶（kallikerin）是一种血管再生因子，LING等9报道其能增加皮质梗死高血压大鼠SV

10、Z和梗死周边区神经再生和血管发生并改善神经功能。研究表明kallikerin 治疗后，SVZ区的BrdU （5-溴脱氧尿嘧啶核苷，5-bromodeoxyuridine）/双皮质素（doublecortin，DCX） 和BrdU/Nestin在第3日时明显增加，第7、14日达到高峰，而后逐渐减少。而BrdU/神经元特异性核心抗原（neuron-specific nuclear protein，NeuN）在第14、28日时明显增加的。这表明随时间推移，增殖细胞逐步分化成未成熟神经元最后转变成成熟神经元。经过kallikerin 治疗，在梗死周边皮质区BrdU/NeuN增加，但未发现BrdU/胶质

11、纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）细胞表达。这表明外源性的kallikerin提高新生NSC有选择地向成熟神经元分化。Angiopoietin 2（Ang2）在SVZ区的表达，说明其对神经前体细胞(nerve precursor cell, NPC)有作用。通过刺激MMP2表达，Ang2诱导神经胶质瘤细胞侵入经过整合素V1。无论在正常情况下还是在卒中时，SVZ区域细胞中的MMP2、MMP9均能调节成神经细胞迁移。目前的数据表明卒中后SVZ细胞中的整合素V的mRNA和蛋白是增加的。Ang2的上调能激活MMP2，从而调节成神经细胞向缺血区域迁移

12、8。卒中诱导的神经发生在成年人和老年患者的大脑中均有表达。这些研究成果为卒中的神经恢复治疗提供了希望，但如何操纵内源性神经发生并提高脑修复能力仍存在不少问题。2 脑缺血中NPC反应在神经发生的作用 在啮齿类动物的皮质神经发生过程中，NSC主要定位在侧脑室并产生皮质神经元。短暂性和永久性中脑动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）导致身体同侧SVZ神经发生的增加、SVZ成神经细胞向纹状体和皮质的缺血区域迁移。BROWN等10已报道影响SGZ神经发生的活性因素，海马的神经发生可以通过学习、跑步和丰富的环境增加。由于缺血脑损伤经常扰乱中枢神经系统（ce

13、ntral nervous system，CNS）中神经功能，理解缺血后NPC的反应是很重要的。ZHANG等11表明，在成年大鼠中约15%20%的SVZ细胞是主动分化的，体内研究表明卒中使SVZ分化细胞的百分比增加，卒中后2 d开始增加（24%）和第7日时达到高峰（31%），14 d时则降到卒中后第2日的水平。Notch信号途径和sonic hedgehog信号途径调节卒中诱导的神经发生。在发育的过程中，Notch信号途径可以通过调节细胞周期维持NPCs池，还可以与纤毛神经营养因子相互作用促进星形胶质细胞的产生12。体外研究表明13脑缺血上调SVZ的NPC的Notch和Hesl表达并促进Not

14、ch胞内细胞域向神经元核的迁移。在NPC的分化过程中，Notch信号的激活使卒中后NPC膨胀并促进缺血NPC中神经元的产生。因此，以这些信号途径放大内源性神经发生为靶点治疗脑缺血是很有意义的。不过，调节神经再生的基因是怎样调节NPC增殖和分化的仍待解决。3 内源性神经发生在脑缺血中的意义 脑血管内活化的EC分泌间质源因子（stroma derived factor 1, SDF-1）能使成神经细胞表达CXCR4（一个SDF-1的受体），缺血激活的EC促进NPC增殖和神经元分化。研究14表明，成年时，在种属和区域之间是有神经元募集差异的，不是因为是否有适当的前体细胞存在，而是在于支持有丝分裂后神

15、经元的迁移和存活的局部脑环境。目前主要评价非神经元细胞类型对来自前体细胞的新神经元局部产生和募集调节作用。SGZ的BrdU阳性细胞形成簇表明这些细胞已从原始的前体细胞分化并表达Msil(一个NSC/前体细胞的标记蛋白)，尽管星形胶质细胞也表达Msil在成年大脑中。在SGZ中形成簇的Msil阳性细胞没有表达GFAP，BrdU注射4周，70% 的BrdU阳性细胞有神经元类型，其结果表明缺血应激刺激年轻和老年大鼠的SGZ区NPCs的增殖。当然，在脑缺血后提高内源性神经发生尤为重要15。4 脑微环境对神经发生的影响 脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor

16、s, BDNF）能刺激纹状体的神经再生。有报道16称，侧脑室或SVZ注射BDNF能刺激纹状体的神经再生，而且 ARVIDSSON等17表明卒中后的成神经细胞最初生成远远超过幸存的新生神经元的数量，表明神经再生反应可能会被放大。如果新生的神经元存在功能的话，对患者来说是一个有希望的治疗策略。卒中后2周，观察到在损伤的纹状体部有6 300个·m-2DCX阳性新神经元，表明神经再生的能力是强大的。基于卒中后2周BrdU/DCX 和6周的BrdU/NeuN阳性表达细胞的密度的比较，发现在此时间段内，80%或者更多的新生神经元死亡，且最多存活6周17,18。这种新生神经元的低生存率可能是由缺乏

17、营养支持、交接和暴露在严重损伤组织的有害行为等不适宜的微环境导致的。TAGUCHI等19的结果也表明给予CD34+细胞引起的血管新生是通过提供必需的支持环境来诱导神经发生。脑微环境对卒中后的神经发生的作用是很重要的，可以调节干细胞自我更新、前体细胞分化和成神经细胞迁移。在SVZ和纹状体区，有实质的NPC增殖，并且新生神经元向缺血损伤区迁移并分化成变性的神经元表型，在损伤数周后发现纹状体中死亡的神经元仅约有0.2%被新的神经元代替 17。5 NSC的增殖有利于神经发生 当局部脑缺血发生时NSC被激活，并促进成年海马NSC的增殖。NOCHI等20用钙成像检测，发现mGLuR5分子在NSC上表达，并

18、且mGluR5拮抗剂（MPEP）明显抑制NSC的增殖，揭示NSC的mGLR5信号与MCAo后NSC的增殖有关。干细胞的再生治疗对卒中来说是有希望的治疗方法。最近，INOUE等21研究表明，患有pMCAO雄性SD大鼠鼻内给予来自于人脱落的乳牙（SHED）源的条件培养液 （SHED-CM）的NSC后，在梗死周边区SHED-CM组有更多的阳性表达与DMEM组比较，比如DCX、神经丝H（NF）、神经元和大鼠内皮细胞抗原（rat endothelial cell antigen, RECA1）。在第6日和第16日时NPC和来自于SVZ区的DCX向梗死周边区迁移。这表明SHED-CM促进内皮NPC的分化和

19、迁移，诱导血管新生，同时与先前牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSC)移植的作用一样，改善缺血脑损伤。张兰兰等22实验表明，局部脑缺血21d后，SVZ的BrdU阳性细胞明显增加，槲皮素能维持SVZ区NSC增殖的高水平。 6 神经细胞增殖与年龄有关 通过检测微型染色体维持蛋白-2（MCM-2）阳性细胞数量，与非缺血年轻大鼠相比，非缺血老龄大鼠表现出细胞增殖主动性很弱且相对静止。Ki67+细胞（增殖细胞的标记）大多是DCX阳性细胞（迁移成神经细胞），表明尽管这些大鼠SVZ的NPC和NSC减少，但是西地那非增加老龄大鼠SVZ的神经发生。局部脑缺血增加年轻成年大鼠SVZ的

20、神经发生并在缺血区产生新神经元，不过很多新的神经元没有存活23 。在中枢神经系统发育过程中，DCX表达与成神经细胞迁移有关。在成年时，DCX仍有生成新神经元的功能。成年神经再生DCX的表达模式具有时态性，随着年龄的增长，DCX阳性表达急剧减少，直到最后检测不到，故成熟神经细胞增殖减少。血管新生对缺血性脑损伤的意义 HÖCKEL等24在1993 年首先提出血管新生（angiogenesis，AG）的概念，是指已存于组织的成熟血管EC以出芽或嵌入的方式通过增殖和游走并相互连接形成新的子代血管的过程。生理状态下血管生长处于相对平衡状态，当发生缺血、缺氧及肿瘤等应激情况时，血管新生的过程被激

21、活即EC和血管平滑肌进行有丝分裂，从而引起侧枝血管的形成。而后，周细胞和血管平滑肌细胞覆盖在新生的血管内皮上，为血管提供一定的强韧性，从而调控血管的灌注量，最后成为肌性动脉。有研究提出在脑缺血后，EPCs 促进形成一个有利于神经发生的富含血管的环境。血管新生在脑缺血神经保护和神经修复过程均发挥重要作用，缺血脑组织如能及时恢复血供，重建血循环，可逆转缺血损伤25。1 产生有功能的新生血管有助于缺血性脑损伤的恢复 KRUPINSKI等26表明缺血半暗带血管密度越高，卒中患者的存活时间越长。尽管血管新生的时间和空间动力学还不完全明白，但脑缺血区的EC增殖诱发卒中后的血管新生。微血管EC能分泌生长因子

22、和细胞因子，它们能为新形成的神经元存活提供营养5。脑缺血1d时，在缺血周边区新生血管是很明显的。不过随着新血管的成熟，在脑缺血后期其中一些新生血管是肿胀和扭曲的，脑水肿减弱，这表明新形成的微血管是有功能的并促进脑损伤的恢复27。非缺血与缺血SVZ区获得的脑EC共培养后，明显增加NPC的增殖数量，且EC增加的是神经元而不是星形胶质细胞数量28。研究表明EC是分泌型BDNF的来源，通过支持神经元募集并在CNS中生存的毛细微血管来实现的。XIE等29用激光共聚焦显微镜和ELISA检测轻度低温对缺血区域血管发生以及BDNF表达水平的影响情况，主要表现为轻度低温增加微血管直径、血管枝的数量和血管表面积等

23、方面，证明轻度低温至少是通过BDNF明显改善脑缺血的血管新生。2 促进血管新生的因子有助于神经功能恢复 最近，LIAO等30报道消旋亚三倍体芹菜甲素可能通过增加血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）和缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor, HIF-1）的表达，从而增加脑微血管数量，改善神经行为功能、减少脑梗死体积且CD31阳性细胞数量增加促进血管新生。侧枝血管新生在患者的恢复过程中是很重要的。在动物模型中，这些新生的血管有助于清除坏死组织和促进血管新生。所以，持续增加脑梗死区的微血管密度对缺血性脑损伤的恢复

24、是有利的。LUO等31发现蜕皮酮治疗后，微血管密度在脑缺血14d时达到高峰，表明蜕皮酮增加脑部微血管密度。一氧化氮(nitric oxide, NO)和VEGF等因子也促进血管新生，ZHANG等32用三维激光扫描共聚焦显微镜检测全身给予NO供体（DETANONOate）的大鼠，在缺血边缘区血管周长明显扩大、EC增殖数量增加并有新形成的血管。用ELISA检测得出用DETANONOate 处理后明显增加VEGF水平。在缺血脑组织中，DETANONOate诱导的毛细血管样管形成完全是由sGC抑制剂（ODG）抑制，从而抑制血管新生。通过抗VEGFR2中和抗体阻断VEGF活性，明显减弱DETANONOa

25、te诱导的毛细血管形成。而且在卒中24h后全身给予PDE-5抑制剂（Sild），明显增加缺血区的血管新生。Sild和cGMP同系物诱导毛细血管样管形成。这些发现表明外源性NO提高缺血脑的血管新生，是由NO/cGMP途径调节的。而且数据显示NO至少是通过VEGF提高缺血脑的血管新生。给予促血管新生的试剂，比如bFGF和VEGF可明显减少神经障碍。这可能是NO、VEGF和血管新生联合的结果。VEGF的发现为治疗脑血管疾病提供了一个新思路，但由于它的双重性使其应用受限，比如治疗时剂量、个体差异等因素。在脑卒中急性期早期抑制VEGF的表达可以减轻BBB通透性和脑水肿，降低脑出血的风险。有效的治疗策略是

26、在卒中恢复期应用VEGF促进新生血管生成，有可能减少神经缺损和脑卒中的复发33。LU等34表明激肽释放酶基因转移诱导微血管新生是通过促进梗死周边区新生微血管的VEGF的表达，12h开始出现，72h达到峰值。脑损伤的脑血流量与血管新生有关，但是血管新生和脑血流动力学变化之间的关系还不清楚。脑缺血后发生血管新生，而血管新生可提高局部脑血流量（reginal cerebral blood flow, rCBF）35，有助于脑功能恢复。皮质层CBF的增加还与血管再生的位置有关，这些结果的确切机制和生理意义仍待研究。LI等36表明，Sild组没有明显的减少梗死损伤面积，但确实增加血管新生且改善神经功能表

27、现，并选择性地增加缺血区CBF水平。激肽释放酶的过表达明显提高缺血周边区的rCBF，rCBF的恢复可能与VEGF的表达增加有关34。 3 脑损伤后脑部的血管微环境影响着神经发生 WEI等37研究表明缺氧前处理后，HIF-1表达上调利于保护细胞和血管再生，缺氧前处理能使细胞更好的存活并且大多数发生在缺血区，并表现出促进血管新生和神经再生的优越性。可能是因为缺氧延长HIF-1、VEGF和红细胞生成素（erythropoietin, EPO）的mRNAs的半衰期；活体缺氧前处理上调VEGF的mRNA 合成并刺激骨髓源基质细胞（BMSC）的分化。有报道38称，移植脂肪源干细胞（ADSC）对局部脑缺血后

28、脑中的血管新生有促进作用，并且损伤皮质区的微血管在缺血2周时达到高峰，可能与脑中的bFGF和VEGF合成增高有关。另有研究表明，大鼠卒中6周后，Sild组与盐水组之间，由T2*WI（T2*加权成像）证明血管新生的时间和空间特征是有显著差异的。MRI补充地检测了缺血性卒中后的血管新生，Sild治疗后明显提高血管新生35。卒中后，在新生的成神经细胞的区域发现有增加的血管重构，并新生纤维神经细胞从SVZ向梗死周边皮质迁移。人的脐带血源CD34+细胞诱导缺血周边皮质的血管新生并增加成神经细胞向损伤区域迁移。4 内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eN

29、OS)与血管新生的关系 eNOS的磷酸化有助于血管新生。CHEN等39发现TO90317(一个合成的肝脏X受体激动剂)明显增加血清中高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平，促进缺血脑中血管新生和血管稳定，并改善卒中后神经功能结果。TO90317增加缺血脑中的eNOS的磷酸化。TO90317治疗敲除eNOS的小鼠后明显增加HDL-C的水平，但没有增加血管新生和改善神经功能。体外实验表明，在培养的小鼠脑EC中，与对照组相比，TO90317和HDL-C明显增加微血管形成并促进eNOS的磷酸化活性。不过TO90317和HDL-C

30、治疗后可诱导缺乏eNOS的小鼠脑EC毛细血管形成。 5 年龄与血管新生存在必然联系 年龄影响着缺血性脑损伤的恢复程度。ZHANG等40表明，与年轻大鼠相比，老年组（18个月）脑的可塑性减少。Sild促进卒中的年轻动物脑可塑性并改善神经功能。老年大鼠表现出明显的功能恢复、血管密度和EC增殖的减少。10mg·kg-1的Sild治疗老年大鼠有明显的功能恢复改善并伴随着皮质环单磷酸鸟苷（cGMP）水平、血管密度、EC增殖和突触发生的增加与盐水组相比，年龄与卒中后的血管新生的减少以及神经功能减退程度有关。不过，老年卒中大鼠用Sild治疗后改善神经功能，这很有可能与血管新生和突触发生的增加有关。

31、 神经发生与血管新生的联系及两者对脑缺血的作用 血管系统为脑细胞提供氧气、葡萄糖和各种激素，并引导细胞对局部环境做出适当的应答；而脑细胞，尤其是胶质细胞能调节血管功能以适应局部需求41。 1 血管新生常伴有神经发生 WANG等42表明局部脑缺血后VEGF的内源性信号出现在神经元和星形胶质细胞中，且增加的VEGF利于卒中后脑功能的修复。NPCs迁移过程与血管有紧密联系，血管为NPCs向损伤脑区移动提供支架43。 另外，DING等35通过MRI动态检测发现血管新生和轴突重构之间是有关联的。在卒中发作24h给予Sild后，增加缺血脑中血管新生、神经发生和突触发生。LUO等31发现蜕皮酮明显改善实验卒

32、中的神经功能恢复，同时增加脑部微血管密度。微血管密度在脑缺血14d时达到高峰，GFAP数量有明显增加，并有更多更长的神经突出。提示蜕皮酮提高血管新生和GFAP活性，从而促进神经功能恢复。2 血管环境影响NSC和NPC的神经发生 EC释放许多神经营养因子包括BDNF和VEGF，这些因子刺激成年NSC自我更新、分化并促进神经元的产生。不过产生的SVZ成神经细胞向缺血区迁移是由血管新生介导的。卒中诱导血管新生和神经发生，它们是相关联的6。在卒中后1d用阿伐他汀治疗，动物实验表现出VEGF、cGMP、血管新生、EC增殖有明显的增加，并有突触蛋白和突触囊泡蛋白增加44。另有研究45表明，山茱萸环烯醚萜苷

33、（cornel iridoid glycoside, CIG）治疗组明显增加MCAo后第7、14、28日时大鼠SVZ区BrdU和Nestin-阳性细胞数。在卒中后28d时，纹状体中新成熟神经元和血管的数量有增加。VEGF及其受体Flk-1mRNA表达在第7、28日增高。这些结果表明CIG促进缺血性大鼠神经发生和血管新生的机制可能与CIG增加脑中VEGF和Flk-1表达有关。成年海马中，海马回门和颗粒细胞层或者SGZ之间的细胞是主动增殖的，整个生命中能产生新的神经元。尽管许多分化的神经命运已清楚，但是关于S期的细胞表型或者这些分化的细胞是怎样与相邻的细胞相互作用还不太清楚。PHLMER等46发现

34、与血管相关的约37%的分化细胞是有内皮标记活性的。多数新生ECs在数周后消失，表明神经发生最初与激活的血管募集和后续的重构过程有关。数据表明成年神经发生是在促血管新生的环境中进行的。展望 在缺血性脑损伤疾病的临床治疗中将NSC和EC、神经发生和血管生成结合起来，维持神经性小生境(niche)的稳定，促进“NVU”的协调和优化是今后努力的方向。哺乳类动物在整个生命过程中大脑都有神经发生和血管新生的功能，但随着年龄的增加逐渐减弱。并且当受到损伤时，机体自身修复能力相对有限。所以，如何促进机体神经发生和血管新生，有待更深入更细致的研究。 参考文献1 ARAI K, JIN G, NAVARATNA

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