原发性肝癌肿瘤标志物检测研究进展

1、原发性肝癌肿瘤标志物检测研究进展【摘要】原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，肝硬化、病毒性肝炎、化学致癌物及环境因素等所造成的慢性肝脏损害均可诱发原发性肝癌，其恶性度高，容易复发及转移，预后差，而且早期诊断较困难，易延误最佳治疗时期。目前认为HCC是多因素、多基因、多突变综合作用的结果。随着细胞分子生物学技术的开发和完善越来越多的研究提示细胞因子在HCC发生、增殖与发展同样存在着密切关系，原发性肝癌的生物标志物对于原发性肝癌的早期诊断、监测肿瘤进展、疗效判定、复发和存活率的判定十分重要。因此，寻找有效的原发性肝癌生物标志物是医学工作者多年以来的努力方向，并取得了很大的进展。除了甲胎蛋白外，

2、近年来aL一岩藻糖苷酶、1一谷氨酰转肽酶、铁蛋白、血清胆碱酯酶等肿瘤标志物，由于其敏感性及特异性均较高。可能不久以后会成为原发性肝癌早期诊断及疗效观察的重要依据。本文就近年来关于PHC标志物的研究进展综述如下。【关键词】原发性肝癌；肿瘤标志物；研究进展1. 甲胎蛋白I alpha feto protein AFP)甲胎蛋白是在胎儿发育过程中由胎肝合成的，AFP在胚胎的12一14周合成达高峰，血清浓度可达13 gL，胎儿出生后，基因表达即关闭，出生1天后，血清浓度降至正常水平，约为58彬L，但当肝细胞发生病变时，AFP基因表达开放，血清中AFP浓度显著升高。因此AFP成为诊断肝癌的首选标志物。其

3、阳性值设定为>400ugL，AFP检测具有较高的敏感性，60一70的PHC患者表现为AFP的显著升高1。但AFP诊断PHC仍有一定的局限性，因为有相当多的肝硬化患者的血清AFP值在200ugL以上。Gupta等2发现AFP对丙型肝炎患者的敏感性和特异性分别是41一65和80一94。此外。部分良性肝病、生殖系统和胃肠道的一些恶性肿瘤中AFP值也升高。而且在乙肝表面抗原阴性的PHC患者中，AFP水平明显低于乙肝表面抗原阳性或者丙肝表面抗原阳性的患者3。这说明单独应用AFP诊断PItC仍有一定的局限性，因此有必须和其他PHC血清标志物进行联合诊断，以提高诊断的准确性。甲胎蛋白(AFP)是诊断H

4、CC的传统标志物，然而其诊断敏感性、特异性均较低。近年很多研究报道，不同肝细胞组织分泌的AFP糖链结构存在差异，根据不同糖链的AFP与小扁豆凝集素的亲和力不同，可将AFP分为AFP-L1、AFPL2、AFP-L3，AFP-L1主要存在于良性肝病中，AFP-L2来自孕妇，而AFPL3为肝癌细胞所特有，AFPL3是HCC诊断的高特异指标，被称为新一代肝癌标志物【57】2. aL一岩藻糖苷酶(aLFueosidase AFuaL一岩藻糖苷酶(AFIJ)是一种溶酶体酸性水解酶，广泛分布于人体组织细胞和体液中，参与体内多种生物活性物质的分解代谢，肝、肾等组织中活性较高。当这些组织出现病变时，会引起血清中

5、的AFU活力增高。Tangkijvanich4早期报道表明在PHC患者中AFU阳性率为75，并且AFP在PHC患者中钓活性明显高于继发性肝癌及肝硬化患者。AFU及AFP在原发性肝癌诊断中敏感性及特异性各有所长。血清AFU活性与肝癌直径大小无明显相关性，小肝癌组血清AFU阳性率(708)显著高于AFP阳性率(375)【5】；血清AFU活性与AFP水平无相关性，AFP阴性的PHC患者，其血清AFU的阳性率可达808。因此两者协同应用，将显著提高阳性率，并可降低AFP阴性PHC的漏诊率。AFP、AFU联合检测可以大大提高PHC诊断水平，其灵敏度可达862，与单一检测AFP(645)或AFU(766)

6、比较，具有显著意义(P<005)【6】。研究发现原发性肝癌患者组经过相应治疗后，血清AFU水平明显下降(P<001)，因此，可以认为血清AFU值测定对PHC疗效观察有积极的监测作用。3.1一谷氨酰转肽酶(GGT)1一谷氨酞转移酶(gammaglutamyl transferase，GGT)是y一谷氨酰循环中的关键酶，广泛存在于人体的各种组织和体液中。GGT在体内以肾脏含量最高，肝和胰次之，小肠、心肌和其他组织中较低。正常肝组织中GGT活性较低，多分布于细胞浆、细胞膜及肝内胆管上。GGT从胆道排泄，半衰期为710 d，但酒精性肝病时，半衰期可达到28 d【7 】。由于前列腺中该酶含量

7、十分丰富，并能释放入血，故正常男性GGT高于女性。运用聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳可将GGT分为13条酶带(13种同丁酶)，其中带只见于肝癌患者称为特异性肝癌同工酶，它们在诊断PHC方面较AFP有更高的敏感性和特异性。相关报道表明GGT对PHC诊断的敏感性为740，特异性为822，其诊断PHC的敏感性为438【8】。4.铁蛋白(serum ferritin，SF)铁蛋白是由网状内皮系统(肝、脾、骨髓)的吞噬细胞释放，广泛存在于人体组织和血清中，以肝实质细胞含量最多。SF参与细胞内铁蛋白和血红蛋白以及红细胞生成，参与免疫调控过程。由于肝脏含有丰富的铁蛋白，也是清除循环中铁蛋白的场所，因此，SF测定也可

8、作为诊断原发性肝癌的一个非器官特异性的肿瘤标志物。Impcz JB等在1997年就已报道，铁蛋白诊断PHC的敏感性为713，特异性为486(相应AFP的敏感性为588，特异性为974)，认为血清铁蛋白可作为PHC的相关抗原。国内的报道其敏感性在508一88O之间9-11，也有人认为AFP阴性或低值的原发性肝癌患者sF明显增高12。5.血清胆碱酯酶(cholinesterase。CHE)胆碱酯酶分为两种：(1)真性胆碱酯酶(ACHE)即乙酰胆碱酯酶；(2)假性胆碱酯酶(PCHE)或称丁酰胆碱酯酶，存在于肝、胰、子宫、中枢神经白质等处，是血浆中固有的酶，能水解丁酰胆碱，但难水解乙酰胆碱13,14。

9、血清中的胆碱酯酶主要是PCHE。PCHE由肝脏生成后分泌入血，反映肝实质合成蛋白的能力，与血清白蛋白的减低大致平行，但比白蛋白更敏感地反映病情变化。由于CHE主要在肝脏产生，因此当PHC出现肝功能损害时，CHE活性将降低15。PHC也可见PCHE升高，原因可能是肝细胞产生PCHE16。由于我国HBV与HCV感染率较高，而PHC的发生又与其密切相关，只有早发现早治疗才能提高生存率。6. AGGF1（ angiogenic factor with G and FHA domains 1）基因AGGF1（ angiogenic factor with G and FHA domains 1）基因 是

10、 2004 年 Tian 等在对 1 例染色体发生了 （t5；11）（ q13. 3；p15. 1）平衡位点先天性静脉畸形骨肥大综合征病人进行精 细的分子遗传学研究时，在染色体异位染色点克隆到的一个 新基因2。该基因在血管内皮细胞高度表达，所编码的蛋白在体外展现出强烈的血管生成能力。故被初步定性为一个新的血管生成因子。持续的肿瘤血管生成是肝癌的主要标志和特征之一，与肝癌的生长、侵袭、转移及复发有着密切的 关系18-19，在哺乳动物中存在三种甲基化酶，DNMTl、DNM33A和442000DNMT3B。已经报道在乳腺癌中存在甲基化酶表达异常，目前在乙肝相关性肝癌组织中DNMTl表达也可见不同程度

11、的阳性表达。研究表明乙肝相关性肝癌细胞存在DNA甲基化酶1异常表达，而且在乙肝相关性肝癌中DNMTl异常表 达与患者恶性病理特征存在一定的关系，表明乙肝感染可通过甲基化途径导致肝脏恶性肿瘤发生，是乙肝相关性肝癌发 生的重要机制之一，进一步研究其分子机制在肝癌预防和治疗中具有一定的价值【20-24】。 7. 微小RNA（ microRNA，miRNA） 近年来研究发现微小RNA（ microRNA，miRNA）在肿瘤研究领域有广阔的前景，在肝癌细胞中亦普遍存在miRNA 的表达异常，它们扮演着“ 癌基因”或“ 抑癌基因”的角色25。现已发现与肝癌密切相关的miRNA 有miR -122、let

12、-7、miR - 125a、miR - 139、miR - 145、miR - 223、miR -224、miR - 221 和miR - 21 等，它们都有可能成为肝癌治疗的目标靶点26。肝癌组织和癌旁正常组织中miRNA 含量比较肝癌组织中的miR - 122、miR - 199、miR - 451 含量均低于癌旁正常组织，差异均有统计学意义（ t =9. 842 16. 984，P 0. 05）；肝癌组织中的miR -181、miR - 21含量均高于癌旁正常组织。27-29肝细胞癌的发生与原癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关，研究原癌基因和抑癌基因表达调控的机制预期能够为疾病的诊断和

13、治疗提供新靶点。表观遗传学成为了近年来基因调控机制研究的热点，包括乙酰化、甲基化、miRNA 等均可调控基因的转录和翻译30。其中，miRNA 是一类进化上保守的非编码小分子RNA，在体内广泛表达，能够通过与靶基因3- UTR 结合来参与mRNA 的降解或阻碍mRNA 的翻译31。大量证据显示一些miRNA 在肝癌中表达失调，且发现miRNA 通过一些通路或基因调控癌细胞的增殖、凋亡、转移、侵袭和细胞周期32。8. 型胶原酶研究表明，肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶中，型胶原酶（包括MMPs-2、MMPs-9）主要参与型胶原的降解，而后者是ECM（细胞外基质）的主要成分，所以肿瘤侵袭转移的能力与其

14、产生或诱导产生型胶原酶的能力密切相关。因此MMP-2、MPP-9 被认为是参与肿瘤侵袭、转移过程中最为直接、最为重要的基质金属蛋白酶。乙肝引起的肝癌的过程中，MMPs起到了重要的作用8.1.MMPs 的生物学特性及结构MMPs由肿瘤细胞、内皮细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞、结缔组织细胞等合成与分泌，是迄今为止发现的唯一能分解纤维类胶原的酶，MMPs 是一组具有类似结构和共同生物化学性质的金属依赖性蛋白水解酶超基因家族，是ECM的主要降解酶系统，可以降解几乎所有的ECM 成分。MMPs家族中已被发现的成员近30 种，根据MMPs的作用底物不，分为五类：(1)间质胶原酶类(2)型胶原酶(明胶酶)

15、(3)基质溶解素类(4)膜型MMPs (membrane-type matrix metalloproteinases)类(5)其他MMPs。其结构组成：(1)信号肽疏水区(2)前肽结构域（除了MMP-14，其余前肽结构域N 端含有信号肽）(3)催化结构域(4)铰链区与类红血素结核蛋白区(5) 疏水跨膜结构域 33。8.2.MMP-2、MPP-9与肝癌众所周知，MMPs 家族参与了肿瘤的侵袭、血管的生成和新陈代谢。MMP 抑制剂可以阻滞内皮细胞活化以抑制肿瘤血管生成、侵袭和增殖。MMP-2、MMP-9 之所以被认为是新型抗肿瘤药物靶点，是因为这两种明胶酶是组成基底膜的重要组成成分。Zhou L

16、研究高表达Notch1 和原发性肝癌高侵袭生存率之间的关系时发现，MTT 分析降低Notch1 的水平并不影响肝癌的生长能力，但是降低Notch1 的表达可降低癌细胞的侵袭能力，此过程通过调控MMP-2 和MMP-9来完成34。之前Zhou L等研究表明，抑制Notch 信号途径，可以引起MMP-2/MMP-9 下调抑制肝癌细胞侵袭11。先前也有人研究证明Notch 1途径也与MMP-2、MMP-9 的表达相关。35-36Hoyhyta M35发现肝癌组织中MMP-2 的表达明显高于癌旁组织。Hirovuki36用酶谱分析法检测了30例肝细胞性肝癌中活化型MMP 的情况, 认为肝细胞性肝癌中活

17、化型MMP-2 的表达水平与临床参数的关系：表达水平与肿瘤大小、肿瘤分期、伴肝硬化与否均无相关性；但与肿瘤有无假包膜浸润或血管侵犯有关。肝细胞性肝癌中活化型MMP-2 的表达水平与肿瘤的侵袭能力呈正相关。认为活化型MMP-2可能作为预测肝细胞性肝癌复发的一个指标。近来，有研究检测血清或血浆中MMPs量, 发现血中MMP-2,MMP-9 也与肿瘤浸润及转移有明显相关。MMPs是一类与慢性乙型病毒性肝炎、肝硬化及肝癌的浸润和转移关系十分密切的蛋白水解酶。它们的作用在临床工作中至少具有两个重要的实际意义。其一，是MMPs 可能作为判断肝癌浸润、转移和复发的标志物；可通过MMP 表达量的检测协助肝癌的

18、诊断，判断其转归,从而指导临床治疗措施的选择，实现个体化医疗；其二，有可能以MMPs 的拮抗剂作为治疗或预防肝癌浸润和转移的新方法。由此可见，从分子水平对MMPs进行研究,将为乙肝相关性肝癌的预防、诊断、预测预后及有效治疗，开辟新途径。9.TSGF TSGF是恶性肿瘤及周边毛细血管大量扩增的结果，是一种多肽物质，是恶性肿瘤及周边血管大量扩增的物质基础，并随着肿瘤的形成和增长逐渐释放到外周血液，而TSGF作为血管生长因子，仅对恶性肿瘤的血管增生起作用，而与非肿瘤血管增生无明显关系，具有鉴别癌与非癌的能力，在恶性肿瘤形成早期即可达到检测浓度，因此TSGF可以用于恶性肿瘤的普查和早期诊断。将为乙肝相

19、关性肝癌的预防、诊断、预测预后及有效治疗，开辟新途径。10.GP73GP73是美国学者Kladney等49在研究成年人巨细胞性肝炎(giant cell hepatitis，GCH)病原学时发现的一种相对分子量为73×104的跨膜糖蛋白，属高尔基体型，全长3 042 bp，基因位于9号染色体长臂，定位于高尔基体顺面，内含1个开放阅读框，大小为1 200 bp，可进行400个氨基酸的编码，包括胞外、跨膜和胞内3个区域，胞外段为N一末端，是发挥作用的主要功能区。GP73是高尔基蛋白73(GP73),是近年来新发现的肝癌特异性标志物，国外相关研究发现，肝癌患者血清GP73水平显著高于肝硬化

20、患者39，最近Allan等40在体外将传染了野生型OPN基因的乳腺癌细胞种植于裸鼠体内后发现，其淋巴管浸润、淋巴结转移及肺转移明显增加。OPN是一种具有多种生物学功能的黏蛋白，大量研究发现OPN与肿瘤的发生、发展、浸润及肿瘤的血管生成关系密切，在肿瘤的复发与转移中起重要作用。本研究显示OPN在PHC浸润、转移患者中表达明显升高。有研究表明OPN高表达的PHC患者生存期明显缩短14，因此OPN可以作为PHC诊断、预后判断的标志物，可作为血清肿瘤标志物组合的补充。11.骨桥蛋白(osteopontin，OPN)目前认为骨桥蛋白(osteopontin，OPN)在多种肿瘤的发生、侵袭、转移等过程中起

21、重要作用。OPN最早是在骨骼中发现的一种唾液蛋白，随后发现在多种组织如肾、脑、牙、软骨的上皮细胞和巨噬细胞、血管平滑肌细胞中均有表达。OPN是一种能与黏附分子如CD。和某些整合素结合的分泌性磷酸糖蛋白，南261301个氨基酸构成，相对分子质量为(4475)×10，含有一个精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(ArgGlyAsp，RGD)氨基酸序列，是整合素的受体，通常是Ot、-、B 3亚型。人类的OPN基凶SPPl位于染色体4q21一q25上，是一个独立编码基因，含7个外显子和7个内含子。在OPN基因启动子区域中包含一个TATA盒、一个反向的CCAAT盒、一个GC盒及多种转录因子的结合位点。从克

22、隆出的OPN基因全长eDNA来看，其mRNA长度为1616 hp，编码序列区(coding sequence region，CDS)为903 bp，编码300个氨基酸，其中CDS区是重要的功能区。近年来研究发现，OPN与肝癌的发生、侵袭、转移和预后关系密Hua等58在对肝癌组织和正常组织进行基因表达差异性研究时发现，OPN在肝癌组织中表达量升高超过了10倍，对51份标本进行免疫组织化学检测后发现有5l的肝癌组织表达OPN，更有意义的是在正常肝组织中均未检测到OPN。一项研究对比了血浆OPN与AFP在丙型肝炎相关性肝癌中的诊断价值，得出结论：肝癌组血浆OPN水平较肝硬化组和正常组明显升高，OPN

23、水平与肝功能无关，在诊断早、中、晚期肝癌时敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和受试者T作特征曲线下面积均优于AFP，OPN有望成为肝癌的早期诊断指标阔。OPN与肝癌的转移和复发有密切联系。研究发现，OPN能够促进肿瘤分泌蛋白酶分解周围基质，有利于肿瘤转移，同时还和肿瘤新生血管形成密切相关。有研究发现59-60，70肝癌组织OPN过表达，体外实验中通过小RNA干扰特异性抑制OPN表达后，肿瘤细胞侵袭能力明显下降，集落形成受抑制。研究发现OPN在体外能够显著增强SMMC一7721肝癌细胞株的侵袭能力，基质金属蛋白酶2(matrix metallopmteinase 2，MMP一2)和尿激酶型纤

24、溶酶原激活因子(urokinasetype plasminogen activator，uPA)表达也显著增高，提示OPN可能通过增加MMP一2和uPA的表达促进了肝癌的转移，这可能为OPN促进肝癌侵袭转移的机制之一。尽管多项实验证明，OPN与肝癌的转移与复发密切相关，但在肝癌转移中OPN表达升高的具体机制仍不明确，另一项研究发现，在肝癌组织中表达上调的转录因子中，c-myh能够与OPN启动子结合增加其转录活性，体外实验中运用小RNA干扰技术靶向抑制rmyb后OPN表达也受到了抑制，HCCLM6细胞株迁移和侵袭能力明显减弱。研究提示，OPN与肝癌的血管生成有关，肝癌组织生成新血管需要OPN参与

25、，可能与MMP一2和uPA的激活有关OPN可用于判断肝癌预后，高水平OPN提示肝癌侵犯血管，预后不良。临床观察发现，OPN是肝癌血管侵犯的独立影响因素【61】，术后血浆OPN升高提示肝癌转移。OPN在肝癌中相对特异性表达，大量实验已经证明其在肝癌的发生、诊断、转移和预后判断中扮演着重要角色。肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一，其发病隐秘，当患者出现临床症状时已经是晚期。即使能够手术切除，患者的预 后仍极差，并伴有较高的复发率综上所述，肿瘤标志物的检测对恶性肿瘤的诊断价值已受到临床的广泛重视，但单项检测却有敏感胜不高、特异性不强、有时出现漏诊的现象，作为一种无创性诊断，同步检测多项标志物可提高阳性诊断

26、率，并能早期及时诊断，因此应该有效地利用已知的PHC肿瘤标志物联合检查，以提高早期诊断率，同时还要不断地探索研究新的肿瘤标志物。因此，寻找新的预测指标和肝癌分子靶点已成为全球科学家研究的热点，也是被科学家们认为是评估肝癌患者治疗效果和生存率的关键途径之一。参考文献1Soresi M，Magliarisi C。CampagnaP，etalUsefulness of alpha toprotein in the diagnosis of hepatocellular carcinomaAnticanceres，2003，23(2)：174717532Gupta S，Bent S，Kohlwes J

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