红细胞检验的基本方法

1、红细胞检验的基本方法红细胞检验的基本方法叶云叶云 血液学教研室血液学教研室 叶云叶云 1.1.来源来源 2.2.形态形态 3.3.功能功能红细胞疾病 1.1.缺铁性贫血缺铁性贫血 2.2.巨幼贫巨幼贫 3.3.溶贫溶贫 4.4.其他其他ida blood smear 本章 概况 1.1.有关铁指标、叶酸和维生素有关铁指标、叶酸和维生素b b1212的检验。的检验。 2.2.红细胞膜缺陷、酶缺陷的检验。红细胞膜缺陷、酶缺陷的检验。 3.3.血红蛋白异常的检验。血红蛋白异常的检验。 4.pnh4.pnh的检验。的检验。 5.5.免疫性溶血的检验。免疫性溶血的检验。铁指标检验的几个概念 1.1.血清

2、铁血清铁(serum iron )(serum iron )。 2.2.血清转铁蛋白血清转铁蛋白(serum transferrin(serum transferrin) )。 3.3.血清铁蛋白血清铁蛋白(serum ferritin(serum ferritin) )。 4.4.血清总铁结合力血清总铁结合力(tibc)(tibc)。 5.5.转铁蛋白饱和度。转铁蛋白饱和度。1.原理原理 一、一、 sf sf phph+还原剂还原剂 fefe2+2+ +显色剂显色剂络合物络合物2 2、参考值：、参考值：成年男性成年男性11.611.631.3mol31.3moll l 成年女性成年女性9.0

3、9.030.4mol30.4moll l3 3、临床评价：、临床评价：降低：见于缺铁性贫血（降低：见于缺铁性贫血（idaida）、慢性失血和）、慢性失血和 感染等。感染等。增高：见于肝疾病、铁粒幼细胞贫血、慢性增高：见于肝疾病、铁粒幼细胞贫血、慢性 溶血和反复输血等。溶血和反复输血等。1 1、原理：、原理： 二、二、 （125125i i标记标记sf+sf+待测血待测血sfsf）+ +定量抗体定量抗体 125125i i复合物复合物1+1+复合物复合物2 2 125 125i i标记标记sf+sf+定量抗体定量抗体 125125i i复合物复合物3 3成人男性成人男性1515200g200gl

4、 l， 女性女性1212150g150gl ,l ,小儿低于成人；小儿低于成人；2 2、参考值：、参考值：3 3、临床评价：、临床评价：降低：见于降低：见于idaida早期、失血、慢性贫血等。早期、失血、慢性贫血等。增高：见于肝疾病、血色病、急性感染和恶增高：见于肝疾病、血色病、急性感染和恶 性肿瘤等。性肿瘤等。 三、三、 1 1、原理：、原理：1.1.过量铁标准液过量铁标准液+ +血清血清sfsf2.sf 2.sf phph+还原剂还原剂fefe2+2+ +显色剂显色剂有色络合有色络合物物tibctibc：男性：男性505077mol77moll l 女性女性54 54 77mol77mol

5、l luibcuibc：25.125.151.9mol51.9moll l2 2、参考值：、参考值：3 3、临床评价：、临床评价： 增高：见于增高：见于idaida和红细胞增多症等。和红细胞增多症等。 降低或正常：见于肝疾病、恶性肿瘤、溶降低或正常：见于肝疾病、恶性肿瘤、溶 血性贫血、慢性感染和肾病综合征等。血性贫血、慢性感染和肾病综合征等。1 1、原理：、原理：当体内缺铁时，铁蛋白的利用加快，肠道当体内缺铁时，铁蛋白的利用加快，肠道对铁吸收也增加。口服放射性对铁吸收也增加。口服放射性5959fefe，测定，测定体内体内5959fe fe 放射性量比率的变化，可推算出放射性量比率的变化，可推算

6、出铁吸收率。铁吸收率。2 2、参考值：、参考值：3 3、临床评价：、临床评价：增加：见于增加：见于idaida，可高达，可高达50508080。降低：见于肠道吸收不良综合征。降低：见于肠道吸收不良综合征。正常：见于正常人、再障、巨幼细胞贫血、正常：见于正常人、再障、巨幼细胞贫血、 急性失血等。急性失血等。正常值正常值:26.0:26.035.035.0 四、铁吸收率测定四、铁吸收率测定 五、血清转铁蛋白测定五、血清转铁蛋白测定1 1、原理：、原理：免疫散射比浊法免疫散射比浊法：利用抗人转铁蛋白血清与：利用抗人转铁蛋白血清与待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体复合物，待检测的转铁蛋白结合形成抗原抗体

7、复合物，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，其光吸收和散射浊度增加，与标准曲线比较，可计算出转铁蛋白含量。可计算出转铁蛋白含量。2 2、参考值：、参考值：免疫散射比浊法为免疫散射比浊法为28.628.651.9mol51.9moll l。增高：见于增高：见于idaida和妊娠。和妊娠。降低：常见于肾病综合征、肝硬化、恶性肿降低：常见于肾病综合征、肝硬化、恶性肿 瘤、炎症等。瘤、炎症等。3 3、临床评价、临床评价: :1 1、原理：、原理： 六、血清转铁蛋白受体测定六、血清转铁蛋白受体测定双抗体夹心法双抗体夹心法。1.1.血清中转铁蛋白受体血清中转铁蛋白受体+ +抗体抗体2.2.抗原抗体复合

8、物抗原抗体复合物+ +酶抗体；酶抗体；3.3.加入底物和显色剂，其颜色的深浅与转铁加入底物和显色剂，其颜色的深浅与转铁蛋白受体的量成正比。蛋白受体的量成正比。2 2、参考值：、参考值：以不同浓度标准品的吸光度值绘制标准曲线，以不同浓度标准品的吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线查出未知标本的转铁蛋白受体通过标准曲线查出未知标本的转铁蛋白受体水平。水平。3 3、临床评价：、临床评价：升高：常见于缺铁性贫血和溶血性贫血。升高：常见于缺铁性贫血和溶血性贫血。降低：见于再障、慢性病贫血、肾功能衰竭等。降低：见于再障、慢性病贫血、肾功能衰竭等。用于临床观察骨髓增生状况和治疗反应。用于临床观察骨髓增生状况和

9、治疗反应。小低贫的初步诊断1.hgb（g/l） 男性120 女性1102.hct 0.35 男性0.40 女性3.rbc （1012/l） 男性4.0 女性3.5 4.mcv(fl) 80 fl=10-15l5.mch (pg)27 pg=10 12g6.mchc 0.32血清铁指标检验的应用 小细胞低色素性贫血的鉴别小细胞低色素性贫血的鉴别 铁铁 总铁结合力总铁结合力 铁饱和度铁饱和度 铁蛋白铁蛋白缺铁贫缺铁贫 减低减低 增高增高 减低减低 减低减低 地贫地贫 正常正常 正常正常 正常正常 正正/ /高高慢感贫慢感贫 减低减低 正正/ /低低 减低减低 增高增高铁粒贫铁粒贫 增高增高 减低减

10、低 增高增高 增高增高体积不同红细胞的形态第二节第二节 叶酸和维生素叶酸和维生素b12 b12 的检验的检验一、血清和红细胞叶酸测定一、血清和红细胞叶酸测定二、血清维生素二、血清维生素b12b12测定测定三、血清维生素三、血清维生素b12b12吸收试验吸收试验四、血清内因子阻断抗体测定四、血清内因子阻断抗体测定1 1、原理：、原理： 一、血清和红细胞叶酸测定一、血清和红细胞叶酸测定叶酸测定（叶酸测定（measurement of folacin）riaria，核素核素+ +叶酸叶酸放射碘叶酸化合物。放射碘叶酸化合物。2 2、参考值：、参考值：血清叶酸：成年男性血清叶酸：成年男性8.618.61

11、23.8nmol23.8nmoll l 女性女性7.937.9320.4nmol20.4nmoll l红细胞叶酸：成人红细胞叶酸：成人3403401020nmol1020nmoll l红细胞红细胞3 3、临床评价：、临床评价：红细胞与血清中的叶酸浓度相差几十倍，当红细胞与血清中的叶酸浓度相差几十倍，当未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对未发生巨幼细胞贫血时，红细胞叶酸测定对判断叶酸缺乏尤其有价值。判断叶酸缺乏尤其有价值。叶酸减低：巨幼细胞贫血，红细胞过度增生叶酸减低：巨幼细胞贫血，红细胞过度增生 （如溶贫、骨髓增生性疾病等）。（如溶贫、骨髓增生性疾病等）。1 1、原理、原理： 二、血清维生素

12、二、血清维生素b b1212测定测定riaria法，用抗氧化剂和氰化钾在碱性环法，用抗氧化剂和氰化钾在碱性环境下（境下（phph1212）, ,将人血清中的维生素将人血清中的维生素b b1212从从载体蛋白中释放出来。加入载体蛋白中释放出来。加入5757co co 标记的维生标记的维生素素b b1212, ,与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生与固定在微晶纤维颗粒上纯化的维生素素b b1212结合物竞争结合，检测其放射活性，其结合物竞争结合，检测其放射活性，其量与受检血清的维生素量与受检血清的维生素b b1212含量成反比，与标含量成反比，与标准管作对照，换算出维生素准管作对照，换算出维生素b b

13、1212含量。含量。2 2、参考值：、参考值：成人成人148148660pmol660pmoll l3 3、临床评价、临床评价：降低：降低：增高：增高：白血病患者白血病患者真性红细胞增多症真性红细胞增多症恶性肿瘤和肝细胞损伤恶性肿瘤和肝细胞损伤巨幼细胞贫血。巨幼细胞贫血。1 1、原理：、原理： 三、血清维生素三、血清维生素b b1212吸收试验吸收试验给受检者口服放射性核素给受检者口服放射性核素5757coco标记的维生素标记的维生素b b12120.50.5g，2 2小时后肌注未标记的维生素小时后肌注未标记的维生素b b1212 1mg1mg，收集，收集2424小时尿测定小时尿测定5757c

14、oco排出量。排出量。2 2、参考值：、参考值： 正常人正常人7 73 3、临床评价：、临床评价：巨幼细胞贫血巨幼细胞贫血7 7恶性贫血恶性贫血5 51 1、原理：、原理： 四、血清内因子阻断抗体测定四、血清内因子阻断抗体测定用用5757coco标记的维生素标记的维生素b12b12与血清中的内因子结与血清中的内因子结合，形成合，形成5757coco标记的维生素标记的维生素b12b12内因子复合内因子复合物；当存在内因子抗体时物；当存在内因子抗体时, ,形成的复合物的形成的复合物的量减少。检测其放射活性，与阳性对照管进量减少。检测其放射活性，与阳性对照管进行比较，可得知内因子抗体的存在。行比较，

15、可得知内因子抗体的存在。2 2、参考值：、参考值：阴性：正常人，比值阴性：正常人，比值1.001.000.100.10阳性：比值阳性：比值阳性对照血清比值阳性对照血清比值0.100.103 3、临床评价：、临床评价：内因子阻断抗体阳性：多见于由维生素内因子阻断抗体阳性：多见于由维生素b12 b12 缺乏引起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等。缺乏引起的巨幼细胞贫血、恶性贫血等。第三节第三节 溶血的检验溶血的检验一、红细胞寿命测定一、红细胞寿命测定二、血浆游离血红蛋白检测二、血浆游离血红蛋白检测四、血浆高铁血红素白蛋白检测四、血浆高铁血红素白蛋白检测三、血清结合珠蛋白检测三、血清结合珠蛋白检测五、尿含铁

16、血黄素试验五、尿含铁血黄素试验六、尿卟啉检测六、尿卟啉检测1 1、原理、原理： 一、红细胞寿命测定一、红细胞寿命测定红细胞寿命测定（红细胞寿命测定（erythrocyte life span determination）是将放射性核素（）是将放射性核素（5151crcr）标记）标记的红细胞注入血循环后，逐日观察其消失率，的红细胞注入血循环后，逐日观察其消失率，记录成活曲线，计算出红细胞寿命。记录成活曲线，计算出红细胞寿命。2 2、参考值：、参考值：半寿期为半寿期为25253232天天3 3、临床评价：、临床评价：红细胞寿命缩短：红细胞寿命缩短：（1 1）溶血性贫血，约为）溶血性贫血，约为141

17、4天。天。（2 2）再生障碍性贫血，约为）再生障碍性贫血，约为15152929天。天。溶血的检验1.1.血浆血浆(plasma)(plasma)：血液中除去红细胞、白：血液中除去红细胞、白细胞、血小板的无形成分，含有除钙离细胞、血小板的无形成分，含有除钙离子外其他所有凝血因子。子外其他所有凝血因子。2.2.血清血清(serum)(serum)：血液自然凝固后分离出来：血液自然凝固后分离出来的淡黄色液体，缺少某些凝血因子的淡黄色液体，缺少某些凝血因子( (、因子) )。 四、血浆高铁血红素白蛋白检测四、血浆高铁血红素白蛋白检测高铁血红素白蛋白高铁血红素白蛋白+ +硫化铵硫化铵 铵血色原铵血色原用

18、光谱仪在绿光区用光谱仪在绿光区558nm 558nm 处有一最佳吸收区带。处有一最佳吸收区带。2 2、参考值：、参考值：正常人呈阴性正常人呈阴性血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增血管内溶血时，血浆中游离血红蛋白大量增加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。加，血浆中可检测出高铁血红素白蛋白。3 3、临床评价：、临床评价：1 1、原理、原理1 1、原理、原理 五、五、血清结合珠蛋白(hp)测定1.待侧血清待侧血清+hb液液hp-hb复合物复合物+未结合未结合hb。2.电泳分离出电泳分离出hp-hb复合物。复合物。2 2、参考值：、参考值：电泳法电泳法 0.51.6g/l3 3、临床评价：、临床评

19、价：1.减低：常见于各种溶血，尤其是血管内溶减低：常见于各种溶血，尤其是血管内溶血。排除严重肝病及传单。血。排除严重肝病及传单。2.增高：感染、增高：感染、sle、创伤、恶肿、妊娠等。、创伤、恶肿、妊娠等。1.1.原理原理 六、尿卟啉检测六、尿卟啉检测尿中卟啉类物质在酸性条件下，经乙醚提取，尿中卟啉类物质在酸性条件下，经乙醚提取，于于405nm405nm处显红色荧光，从而可对尿卟啉进处显红色荧光，从而可对尿卟啉进行定性检测。行定性检测。2 2、参考值：、参考值：正常人呈阴性正常人呈阴性3 3、临床评价：、临床评价：增加：先天性红细胞生成性卟啉病、迟发性增加：先天性红细胞生成性卟啉病、迟发性皮肤

20、型卟啉病、肝红细胞生成型卟啉病等。皮肤型卟啉病、肝红细胞生成型卟啉病等。对缺铁性贫血、铅中毒、铁粒幼细胞贫血和对缺铁性贫血、铅中毒、铁粒幼细胞贫血和珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有一定价值。珠蛋白生成障碍性贫血等的诊断有一定价值。1 1、原理：、原理： 五、五、尿含铁血黄素试验尿含铁血黄素试验又称又称rous试验。当血红蛋白通过肾滤过时，试验。当血红蛋白通过肾滤过时，部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮部分铁离子以含铁血黄素的形式沉积于上皮细胞，并随尿液排出。尿中含铁血黄素是不细胞，并随尿液排出。尿中含铁血黄素是不稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚稳定的铁蛋白聚合体，其中的高铁离子与亚铁氰

21、化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝铁氰化钾作用，在酸性环境下产生普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内色的亚铁氰化铁沉淀。尿沉渣肾小管细胞内外可见直径外可见直径1 13 3m的蓝色颗粒。的蓝色颗粒。2 2、参考值：、参考值：正常人呈阴性正常人呈阴性3 3、临床评价：、临床评价：阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排阳性提示慢性血管内溶血，尿中有铁排出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性出。无论有无血红蛋白尿，只要存在慢性血管内溶血如血管内溶血如pnhpnh，本试验结果即呈阳性，本试验结果即呈阳性，并可持续数周。并可持续数周。溶血初期，虽然有血红蛋白尿，此时本溶血初期，虽然有血红蛋白尿，此时本

22、试验可呈阴性反应。试验可呈阴性反应。第四节第四节 红细胞膜缺陷的检验红细胞膜缺陷的检验一、红细胞渗透脆性试验一、红细胞渗透脆性试验二、自身溶血试验及其纠正试验二、自身溶血试验及其纠正试验三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定四、酸化甘油溶血试验四、酸化甘油溶血试验五、高渗冷溶血试验五、高渗冷溶血试验六、红细胞膜蛋白电泳分析六、红细胞膜蛋白电泳分析1.1.原理原理 一、红细胞渗透脆性试验一、红细胞渗透脆性试验渗透脆性试验（渗透脆性试验（osmotic fragility test）检测红细）检测红细胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。红细胞胞对不同浓度低渗盐溶液的抵抗力。红细胞

23、在低渗盐溶液中，当水渗透其内部达一定程在低渗盐溶液中，当水渗透其内部达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。度时，红细胞发生膨胀破裂。2 2、参考值、参考值：简易半定量法：简易半定量法开始溶血：开始溶血：75.275.282.1mmol82.1mmoll l（4.44.44.8g4.8gl l）naclnacl 完全溶血：完全溶血：47.947.954.7mmol54.7mmoll l（2.82.83.2g3.2gl l）naclnacl3 3、临床评价：、临床评价：脆性增加：遗传性球形红细胞增多症、椭圆脆性增加：遗传性球形红细胞增多症、椭圆形红细胞增多症和部分自身免疫性溶血性贫形红细胞增多症和部分

24、自身免疫性溶血性贫血。血。脆性降低：珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋脆性降低：珠蛋白生成障碍性贫血、血红蛋白白c c、d d、e e病，低色素性贫血、肝疾病等。病，低色素性贫血、肝疾病等。1 1、原理：、原理： 二、自身溶血试验及其纠正试验二、自身溶血试验及其纠正试验红细胞在红细胞在3737孵育孵育4848小时，其间由于膜异常小时，其间由于膜异常引起钠内流倾向明显增加，引起钠内流倾向明显增加，atpatp消耗过多；消耗过多；或糖酵解途径酶缺乏所引起或糖酵解途径酶缺乏所引起atpatp生成不足等生成不足等原因可导致溶血，称为自身溶血试验。在孵原因可导致溶血，称为自身溶血试验。在孵育时，加入葡萄糖或育

25、时，加入葡萄糖或atpatp作为纠正物，观察作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。2 2、参考值：、参考值：正常人红细胞孵育正常人红细胞孵育4848小时小时, ,不加纠正物的溶血不加纠正物的溶血率率3.53.5，加葡萄糖的溶血率，加葡萄糖的溶血率1.01.0，加，加atpatp纠正物的溶血率纠正物的溶血率0.80.8。3 3、临床评价：、临床评价：遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，遗传性球形红细胞增多症自身溶血率增加，加入葡萄糖或加入葡萄糖或atpatp后明显纠正。后明显纠正。g g6 6pdpd缺乏症等戊糖旁路代谢缺陷的病缺乏症等戊糖旁路

26、代谢缺陷的病人自身溶血率增加，能被葡萄糖纠正。人自身溶血率增加，能被葡萄糖纠正。丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡萄糖产生丙酮酸激酶缺乏症时不能利用葡萄糖产生atp ,atp ,其自身溶血率明显增加，加葡萄糖不其自身溶血率明显增加，加葡萄糖不能纠正，加能纠正，加atpatp可纠正。可纠正。获得性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试获得性溶血性贫血或自身免疫性溶血时试验结果常各有不同，对诊断意义不大。验结果常各有不同，对诊断意义不大。本试验不够敏感和特异，仅对遗传性球形本试验不够敏感和特异，仅对遗传性球形红细胞增多症有较大诊断价值红细胞增多症有较大诊断价值. . 二、自身溶血试验及其纠正试验二、自身溶血试验

27、及其纠正试验1 1、原理：、原理： 三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定三、红细胞膜三磷酸腺苷活性测定nanak katpatp酶、酶、caca2 2mgmg2 2atpatp酶和酶和mgmg2 2atp atp 酶都是红细胞膜上的酶都是红细胞膜上的atpatp酶。为测定酶酶。为测定酶的活性可分别测定酶作用于的活性可分别测定酶作用于atpatp的水解产物无的水解产物无机磷含量，若在基质中只加入机磷含量，若在基质中只加入caca2 2mgmg2 2atpatp酶可测定酶可测定caca2 2mgmg2 2atpatp酶的活性，若酶的活性，若在基质中加入在基质中加入nana、k k、mgmg2 2和和at

28、patp，测定的，测定的为为nanak katpatp酶和酶和mgmg2 2atpatp酶的共同含酶的共同含量，再在基质中加入量，再在基质中加入nanak katpatp酶的抑制酶的抑制剂，测定结果仅为剂，测定结果仅为mgmg2 2atpatp酶活性，两者的酶活性，两者的差为差为nanak katpatp酶活性。酶活性。2 2、参考值、参考值: :红细胞膜红细胞膜nanak katpatp酶：（酶：（2.932.930.670.67）mumu10109 9红细胞红细胞caca2 2mgmg2 2atpatp酶：酶：0.40.42.5mol2.5moll l1 1mg mg 膜蛋白膜蛋白h h1

29、 13 3、临床评价：、临床评价：遗传性球形红细胞增多症：遗传性球形红细胞增多症：nanak katpatp酶活酶活性增加，性增加，caca2 2mgmg2 2atpatp酶活性减低。酶活性减低。蚕豆病：蚕豆病：caca2 2mgmg2 2atpatp酶活性降低。酶活性降低。许多药物作用于红细胞时，许多药物作用于红细胞时，nanak katpatp酶和酶和caca2 2mgmg2 2atpatp酶活性改变。酶活性改变。 四、酸化甘油溶血试验四、酸化甘油溶血试验当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲液时，当甘油存在于低渗溶液氯化钠磷酸缓冲液时，可阻止其中的水快速进入红细胞内，使溶血过可阻止其中的水快

30、速进入红细胞内，使溶血过程缓慢。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜程缓慢。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质减少。当红细胞膜蛋白及膜脂质有缺时，脂质减少。当红细胞膜蛋白及膜脂质有缺时，它们在它们在ph6.85ph6.85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至5050的时间（的时间（aglt50aglt50）明显缩短。）明显缩短。2 2、参考值：、参考值： 正常人正常人aglt50aglt50290s290s3 3、临床评价：、临床评价：遗传性球形红细胞增多症遗传性球形红细胞增多症aglt50aglt50明

31、显缩短明显缩短（2525150s150s）。自身免疫性溶血性贫血、肾）。自身免疫性溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等功能衰竭、妊娠等aglt50aglt50也可缩短。也可缩短。1 1、原理、原理 五、高渗冷溶血试验五、高渗冷溶血试验在高渗状态下，温度骤然变化影响红细胞膜脂在高渗状态下，温度骤然变化影响红细胞膜脂质的流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白质的流动性，并可能累及膜磷脂与膜骨架蛋白结合位点，红细胞容易破裂而发生溶血。当膜结合位点，红细胞容易破裂而发生溶血。当膜蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低，溶血率蛋白缺陷致膜表面积与体积比值降低，溶血率明显增加。而膜表面积与体积比值增加，溶血明显增加。而

32、膜表面积与体积比值增加，溶血率降低。高渗冷溶血试验（率降低。高渗冷溶血试验（hyperosmotic cold hemolysis test）即测定红细胞在不同浓度的高）即测定红细胞在不同浓度的高渗缓冲液中，从渗缓冲液中，从3737水浴立即置于水浴立即置于00水浴一水浴一定时间的最大溶血率。定时间的最大溶血率。2 2、参考值：、参考值：9mmol9mmoll l或或12mmol12mmoll l蔗糖蔗糖最大溶血率最大溶血率66.566.574.174.17mmol7mmoll l蔗糖蔗糖最大溶血率最大溶血率0.10.116.916.93 3、临床评价：、临床评价：遗传性球形红细胞增多症明显增加

33、。遗传性球形红细胞增多症明显增加。珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白珠蛋白生成障碍性贫血和异常血红蛋白病明显降低。病明显降低。自身免疫性溶血性贫血基本正常。自身免疫性溶血性贫血基本正常。1 1、原理：、原理： 六、红细胞膜蛋白电泳分析六、红细胞膜蛋白电泳分析1 1、原理：、原理：将制备的红细胞膜样品进行将制备的红细胞膜样品进行sdssdspage(sds-page(sds-聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶) )电泳，根据样品中各蛋白相电泳，根据样品中各蛋白相对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白对分子质量的不同，分离得到红细胞膜蛋白的电泳图谱，从而可见各膜蛋白组分百分率。的电泳图谱，从而可见各膜蛋

34、白组分百分率。2 2、参考值：、参考值：各种膜蛋白组分百分率变化较大，多以正常红各种膜蛋白组分百分率变化较大，多以正常红细胞膜蛋白电泳图谱作比较；或以带细胞膜蛋白电泳图谱作比较；或以带3 3蛋白为蛋白为基准，各膜蛋白含量以与带基准，各膜蛋白含量以与带3 3蛋白的比例表示。蛋白的比例表示。3 3、临床评价：、临床评价：许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常。各许多溶血性疾病常见红细胞膜蛋白异常。各种膜缺陷疾病如遗传性球形红细胞增多症有种膜缺陷疾病如遗传性球形红细胞增多症有收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红收缩蛋白等含量减低或结构异常。某些血红蛋白病骨架蛋白等可明显异常。蛋白病骨架蛋白等可明显异常

35、。第五节第五节 红细胞酶缺陷的检验红细胞酶缺陷的检验一、高铁血红蛋白还原试验一、高铁血红蛋白还原试验二、变性珠蛋白小体生成试验二、变性珠蛋白小体生成试验三、葡萄糖三、葡萄糖6 6磷酸脱氢酶荧光斑点试磷酸脱氢酶荧光斑点试 验和活性测定验和活性测定四、丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定四、丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定五、谷胱甘肽还原酶缺陷检测五、谷胱甘肽还原酶缺陷检测1 1、原理：、原理： 一、高铁血红蛋白还原试验一、高铁血红蛋白还原试验在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红在血液中加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白变成高铁血红蛋白，正常红细胞的蛋白变成高铁血红蛋白，正常红细胞的g g6 6

36、pdpd催化戊糖旁路使催化戊糖旁路使nadpnadp变成变成nadphnadph，其脱的氢，其脱的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白（fefe3 3）还原成亚铁血红蛋白（）还原成亚铁血红蛋白（fefe2 2），通过），通过比色可观察还原的多少。当比色可观察还原的多少。当g g6 6pdpd缺乏时，缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。高铁血红蛋白还原率下降。2 2、参考值：、参考值：正常人高铁血红蛋白还原率正常人高铁血红蛋白还原率7575（脐带血（脐带血77 77 ）3 3、临床评价：、临床评价：g g6 6pdpd缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。缺乏

37、时，高铁血红蛋白还原率下降。中间缺乏（杂合子）为中间缺乏（杂合子）为31317474，严重缺，严重缺乏（半合子或纯合子）乏（半合子或纯合子）3030。 二、变性珠蛋白小体生成试验二、变性珠蛋白小体生成试验1 1、原理：、原理：正常人含正常人含5 5个及以上珠蛋白小体的红细胞，个及以上珠蛋白小体的红细胞，一般一般3030。g g6 6pdpd缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于37 37 孵孵2 24 4小时，用煌焦油蓝染色观察红细胞小时，用煌焦油蓝染色观察红细胞中珠蛋白小体的生成情况，计算含中珠蛋白小体的生成情况，计算含5 5个及以个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率。上珠蛋

38、白小体的红细胞的百分率。2 2、参考值：、参考值：3 3、临床评价：、临床评价：g g6 6pdpd缺乏症常高于缺乏症常高于4545，故可作为，故可作为g g6 6pdpd缺乏的筛检试验。但还原型谷胱甘肽缺缺乏的筛检试验。但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为胞百分率为75758484，hbhhbh病和化学物质中病和化学物质中毒时也增高。毒时也增高。1 1、原理：、原理： 三、葡萄糖三、葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试磷酸脱氢酶荧光斑点试 验和活性测定验和活性测定在在g-6-pdg-6-pd和和nadpnadp存在下，存在下

39、，g-6-pdg-6-pd能使能使nadpnadp还原成还原成nadphnadph，后者在紫外线照射下会发出荧，后者在紫外线照射下会发出荧光。光。nadphnadph的吸收峰在波长的吸收峰在波长340nm340nm处，可通过处，可通过单位时间生成的单位时间生成的nadphnadph的量来测定的量来测定g-6-pdg-6-pd活性。活性。2 2、参考值与临床意义：、参考值与临床意义：正常人有很强的荧光正常人有很强的荧光。 g-6-pdg-6-pd缺陷者荧缺陷者荧光很弱或无荧光；杂合子或某些光很弱或无荧光；杂合子或某些g-6-pdg-6-pd变变异者则可能有轻到中度荧光。正常人酶活异者则可能有轻到

40、中度荧光。正常人酶活性为（性为（12.112.12.092.09）u/ghbu/ghb。1 1、原理：、原理： 四、丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定四、丙酮酸激酶荧光斑点试验和活性测定在二磷酸腺苷（在二磷酸腺苷（adpadp）存在的条件下丙酮酸）存在的条件下丙酮酸激酶（激酶（pyruvate kinase ，pk）催化磷酸烯）催化磷酸烯醇丙酮酸（醇丙酮酸（peppep）转化成丙酮酸，在辅酶）转化成丙酮酸，在辅酶还原型（还原型（nadhnadh）存在的情况下丙酮酸被）存在的情况下丙酮酸被ldh ldh 转化为乳酸，若标记荧光于转化为乳酸，若标记荧光于nadhnadh上，此时有上，此时有荧光的荧光

41、的nadhnadh变为无荧光的变为无荧光的nadnad。2 2、参考值：、参考值：正常人丙酮酸激酶活性斑点在正常人丙酮酸激酶活性斑点在2525分钟内消分钟内消失。酶活性（失。酶活性（15.015.01.991.99）u ughbghb 。3 3、临床意义：、临床意义：荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光25256060分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光荧光6060分钟不消失。分钟不消失。1 1、原理、原理： 五、谷胱甘肽还原酶缺陷检测五、谷胱甘肽还原

42、酶缺陷检测谷胱甘肽还原酶（谷胱甘肽还原酶（grgr）催化反应中）催化反应中nadphnadph转变转变为为nadpnadp，荧光消失，通过在，荧光消失，通过在365nm365nm处观察荧处观察荧光斑点消失的时间（光斑点消失的时间（grgr荧光斑点试验）反映荧光斑点试验）反映谷胱甘肽还原酶的活性，或直接测定吸光度谷胱甘肽还原酶的活性，或直接测定吸光度的变化（的变化（grgr活性定量试验）计算活性定量试验）计算grgr的活性的活性。2 2、参考值：、参考值：grgr荧光斑点试验：正常人荧光斑点荧光斑点试验：正常人荧光斑点15min15min内消失内消失grgr活性定量：（活性定量：（7.177.1

43、71.091.09）u ughbghb谷胱甘肽还原酶缺乏时，谷胱甘肽还原酶缺乏时，grgr荧光斑点试验荧光斑点试验15 15 分钟以后还有荧光存在，分钟以后还有荧光存在，grgr活性定量试验活活性定量试验活性低于性低于7.17u7.17ughbghb 。3 3、临床评价：、临床评价：第六节第六节 血红蛋白异常的检验血红蛋白异常的检验一、红细胞包涵体试验一、红细胞包涵体试验二、血红蛋白电泳检测二、血红蛋白电泳检测三、抗碱血红蛋白检测三、抗碱血红蛋白检测四、四、hbfhbf酸洗脱法检测酸洗脱法检测五、异丙醇沉淀试验五、异丙醇沉淀试验六、热变性试验六、热变性试验七、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测七、聚丙烯酰

44、胺凝胶电泳检测1 1、原理：、原理： 一、红细胞包涵体试验一、红细胞包涵体试验红细胞包涵体试验（红细胞包涵体试验（heinzbody forming test） 是将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定是将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。2 2、参考值：、参考值：正常人（正常人（1 1）3 3、临床评价：、临床评价：不稳定血红蛋白病：孵育不稳定血红蛋白病：孵育1 13 3小时多数红细小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体。体。g g6 6pdpd缺乏或红细胞还原酶缺乏及化缺乏或红

45、细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。hbhhbh病：孵育病：孵育1 1小时就可出现包涵体，也叫小时就可出现包涵体，也叫hbhhbh包涵体。包涵体。1 1、原理：、原理： 二、血红蛋白电泳检测二、血红蛋白电泳检测血红蛋白电泳（血红蛋白电泳（hemoglobin electrophoresis） 是根据不同的血红蛋白所带电荷不同、相对分是根据不同的血红蛋白所带电荷不同、相对分子质量不同，其泳动方向和速度不同，经一定子质量不同，其泳动方向和速度不同，经一定电压和时间的电泳，可分离出各自的区带，同电压和时间的电泳，可分离出各自的区带，同时对电泳

46、出的各区带进行电泳扫描，可进行各时对电泳出的各区带进行电泳扫描，可进行各种血红蛋白的定量分析。种血红蛋白的定量分析。血红蛋白电泳图谱血红蛋白电泳图谱2 2、参考值：、参考值：（1 1）ph8.6tebph8.6teb缓冲液醋酸纤维膜电泳。正常血缓冲液醋酸纤维膜电泳。正常血红蛋白电泳区带：红蛋白电泳区带：hbahba9595、hbfhbf2 2、hbahba2 2为为1.01.03.13.1。3 3、临床评价：、临床评价：通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带。如较，可发现异常血红蛋白区带。如hbhhbh、hbehbe、hbbatrsh

47、bbatrs、hbshbs、hbdhbd和和hbchbc等异常血等异常血红蛋白异常。红蛋白异常。hbahba2 2增多，见于增多，见于珠蛋白生成障碍性贫血，珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指标。为杂合子的重要实验室诊断指标。hbehbe病病时也在时也在hbahba2 2区带位置处增加，但含量很大区带位置处增加，但含量很大（在（在1010以上）。以上）。hbahba2 2轻度增加亦可见于轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病。肝病、肿瘤和某些血液病。1 1、原理：、原理： 三、抗碱血红蛋白检测三、抗碱血红蛋白检测将待检的溶血液与一定量的将待检的溶血液与一定量的naohnaoh溶液混

48、合，溶液混合，作用作用1 1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应。胎儿血红蛋白（应。胎儿血红蛋白（hbfhbf）抗碱变性作用强，）抗碱变性作用强，没有变性存在于上清液中，没有变性存在于上清液中，hbahba变性沉淀，取变性沉淀，取上清液于上清液于540nm540nm处测定吸光度，检测出处测定吸光度，检测出hbfhbf的的浓度。此试验也称为碱变性试验，浓度。此试验也称为碱变性试验，2 2、参考值：、参考值：成人成人2 2；新生儿；新生儿4040 三、抗碱血红蛋白检测三、抗碱血红蛋白检测3 3、临床评价：、临床评价：hbfhbf绝对增多：珠蛋白生成障碍性贫血，重绝

49、对增多：珠蛋白生成障碍性贫血，重型者达型者达30309090，中间型常为，中间型常为5 53030，轻型小于轻型小于5 5。遗传性胎儿血红蛋白持续综。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，可高达合征患者，可高达100100。hbfhbf相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、相对增多可见于骨髓纤维化、白血病、浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血、浆细胞瘤等恶性疾病及再生障碍性贫血、pnhpnh、卟啉病等。、卟啉病等。hbfhbf生理性增多见于孕妇和新生儿。生理性增多见于孕妇和新生儿。1 1、原理：、原理： 四、四、hbfhbf酸洗脱法检测酸洗脱法检测hbfhbf具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比具有抗碱和抗

50、酸作用，其抗酸能力比hbahba强。强。将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含hbfhbf的红细的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含hbahba的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色。的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色。2 2、参考值：、参考值：正常血片中含正常血片中含hbfhbf的着色红细胞：的着色红细胞：成人成人0.010.01（1 1）新生儿新生儿0.550.550.850.85（55558585）以后渐渐下降，以后渐渐下降，2 2岁后幼儿岁后幼儿0.020.02（2 2）孕妇可有轻度增加。孕妇可有轻度增加。3 3、临床评价：、

51、临床评价：着色细胞增加：珠蛋白合成障碍性贫血着色细胞增加：珠蛋白合成障碍性贫血重型患者大多数红细胞染成红色；重型患者大多数红细胞染成红色；轻型患者可见少数染成红色的细胞；轻型患者可见少数染成红色的细胞；遗传性胎儿血红蛋白持续综合征红细胞均为红色遗传性胎儿血红蛋白持续综合征红细胞均为红色。1 1、原理：、原理： 五、异丙醇沉淀试验五、异丙醇沉淀试验不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解，不稳定血红蛋白较正常血红蛋白更容易裂解，在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白更快地沉的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白更快地沉淀。通过观察血红蛋白

52、液在异丙醇中的沉淀淀。通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检。现象对不稳定血红蛋白进行筛检。2 2、参考值：、参考值：正常人血红蛋白液为阴性（正常人血红蛋白液为阴性（3030分钟内不沉淀）分钟内不沉淀）3 3、临床评价：、临床评价：不稳定血红蛋白存在时，常于不稳定血红蛋白存在时，常于5 5分钟时出现沉分钟时出现沉淀，淀，2020分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有较多较多hbfhbf、hbhhbh、hbehbe时也可出现阳性结果。时也可出现阳性结果。1 1、原理：、原理： 六、热变性试验六、热变性试验热变性试验（热变性试验（heat in

53、stability test）是根据不稳）是根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白液在观察血红蛋白液在5050时是否出现沉淀，对不时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。稳定血红蛋白进行筛检。2 2、参考值：、参考值：正常人热沉淀的血红蛋白正常人热沉淀的血红蛋白1 13 3、临床评价：、临床评价：血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白存在。白存在。1 1、原理、原理 七、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测七、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测尿素或对氯汞苯甲酸能破坏血红蛋白的空间尿素或对氯汞苯甲酸能破坏血红蛋白的空间结

54、构，血红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚结构，血红蛋白的珠蛋白可被裂解成肽链亚单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出各单位，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出各肽链区带。肽链区带。2 2、参考值：、参考值：正常血红蛋白正常血红蛋白hbahba裂解后出现裂解后出现、hbahba、hba2hba2和和四条带。四条带。3 3、临床评价：、临床评价：本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现，本试验若有异常血红蛋白肽链的区带出现，表示有异常血红蛋白存在。对珠蛋白生成障表示有异常血红蛋白存在。对珠蛋白生成障碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值。碍性贫血的诊断和鉴别有参考价值。1 1、原理：、原理： 八、尿素裂解试验八、尿素裂

55、解试验尿素将血红蛋白分子的珠蛋白解离成多肽链，尿素将血红蛋白分子的珠蛋白解离成多肽链，进行醋酸纤维膜电泳分析其肽链区带。进行醋酸纤维膜电泳分析其肽链区带。2 2、参考值：、参考值：正常人正常人hbahba裂解为两条肽链，在裂解为两条肽链，在ph8.5ph8.5醋酸纤醋酸纤维膜电泳时，向阳极泳动的为维膜电泳时，向阳极泳动的为链，向阴极链，向阴极泳动的为泳动的为链。链。3 3、临床评价：、临床评价：异常血红蛋白存在时，出现异常血红蛋白存在时，出现、链区带以链区带以外的异常区带。外的异常区带。1 1、原理：、原理： 九、高压电泳检测九、高压电泳检测通过高压电泳对异常肽链裂解的肽段进行分离，通过高压电

56、泳对异常肽链裂解的肽段进行分离，再应用纸层析法使各肽段展开，得肽段斑点图再应用纸层析法使各肽段展开，得肽段斑点图（指纹图），对其进行分析可更准确地诊断血（指纹图），对其进行分析可更准确地诊断血红蛋白病和研究异常血红蛋白结构。红蛋白病和研究异常血红蛋白结构。2 2、参考值：、参考值：正常人有正常指纹图谱正常人有正常指纹图谱3 3、临床评价：、临床评价：异常血红蛋白存在时，出现异常肽段的斑点，异常血红蛋白存在时，出现异常肽段的斑点，将异常肽段水解后可进行氨基酸序列分析，将异常肽段水解后可进行氨基酸序列分析，确定异常血红蛋白的结构。确定异常血红蛋白的结构。1 1、原理：、原理： 十、血红蛋白基因十、

57、血红蛋白基因pcrpcr技术检测技术检测应用聚合酶链反应（应用聚合酶链反应（pcrpcr）技术检测血红蛋）技术检测血红蛋白基因序列，一般白基因序列，一般pcrpcr产物用产物用dnadna印迹法、酶印迹法、酶切法或直接测序等方法进行检测。可检测出切法或直接测序等方法进行检测。可检测出异常血红蛋白基因的存在，是纯合子还是杂异常血红蛋白基因的存在，是纯合子还是杂合子，基因缺陷的部位等。合子，基因缺陷的部位等。2 2、临床评价：、临床评价：血红蛋白异常基因的检测，可在分子水平上血红蛋白异常基因的检测，可在分子水平上进行血红蛋白病的诊断和研究。进行血红蛋白病的诊断和研究。第七节第七节 pnhpnh的检验的检验一、酸化血清溶血试验一、酸化血清溶血试验二、蔗糖溶血试验二、蔗糖溶血试验三、蛇毒因子溶血试验三、蛇毒因子溶血试验 一、酸化血清溶血试验一、酸化血清溶血试验1 1、原理、原理2 2、参考值：、参考值： 正常人：阴性正常人：阴性3 3、临床评价：、临床评价：本试验阳性主要见于本试验阳性主要见于pnhpnh，某些自身免疫性血，某些自