骨髓间充质干细胞联合血管内皮祖细胞修复骨质疏松性牙槽骨缺损

1、www.CRTER.org文艺，等. 骨髓间充质干细胞联合血管内皮祖细胞修复骨质疏松性牙槽骨缺损骨髓间充质干细胞联合血管内皮祖细胞修复骨质疏松性牙槽骨缺损文 艺1，杨鸿旭2，刘 倩1，梁 源1，刘竹影1，丁 寅1(1解放军军事口腔医学国家重点实验室，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032；2解放军第四军医大学口腔医院口腔解剖生理学教研室，陕西省西安市 710032)引用本文：文艺，杨鸿旭，刘倩，梁源，刘竹影，丁寅. 骨髓间充质干细胞联合血管内皮祖细胞修复骨质疏松性牙槽骨缺损J.中国组织工程研究，2016，20(19):2748-2755.DOI: 10.3969/j.is

2、sn.2095-4344.2016.19.002 ORCID: 0000-0001-9938-2878(丁寅)文章快速阅读：骨髓间充质干细胞与血管内皮祖细胞复合膜片修复骨质疏松性牙槽骨缺损文艺，女，1989年生，河南省新乡市人，汉族，2016年解放军第四军医大学毕业，硕士，主要从事口腔正畸临床治疗及干细胞成骨方面的研究。通讯作者：丁寅，博士，教授，解放军军事口腔医学国家重点实验室，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)19-02748-08稿件接受：2016-03-31http:/WWW.crt

3、骨质疏松模型分离培养细胞血管内皮祖细胞建立牙槽骨缺损 鉴定 Micro-CT 骨髓间充质干细胞鉴定模型成功制作细胞膜片骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞膜片骨髓间充质干细胞膜片血管内皮祖细胞膜片成骨效果：相对于单一的骨髓间充质干细胞膜片以及血管内皮祖细胞膜片，骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片具有更强的成骨活性以及骨修复能力 3种膜片植入缺损 文题释义：细胞膜片：细胞膜片技术获得的细胞具有丰富的细胞外基质，这些细胞外基质在膜片中构成一个完整的细胞层。与传统获取细胞膜片技术相比，实验制备细胞膜片过程中不使用胰蛋白酶消化，从而保存完整的细胞膜片结构，确保细胞间的联系不被破坏。血管化

4、：在骨缺损修复过程中如果缺乏与宿主血液连接的功能性微脉管系统，工程骨的形成将受到限制。通常建立并保持良好的血液供应是组织生存所必需的。因此，血管内皮祖细胞近年来受到了更多的关注。当组织缺血时，血管内皮祖细胞和细胞因子均动员至损伤区域，继而分化成为成熟的血管内皮细胞，参与新生血管的形成。摘要背景：国内外已有多项研究证实雌激素可以调控血管内皮祖细胞的增殖和迁移能力，同时血管内皮祖细胞也可提高体外培养骨髓间充质干细胞的活性与功能。 目的：评价骨髓间充质干细胞联合血管内皮祖细胞复合膜片修复去势大鼠牙槽骨缺损的能力。方法：将制备好的骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片、骨髓间充质干细胞膜片、血管内皮

5、祖细胞膜片植入去势大鼠牙槽骨缺损处，或不植入作为空白对照。植入后2，4，8周分别取材，通过Micro-CT扫描的方法评价牙槽骨缺损的修复效果。结果与结论：相对于单一的正常骨髓间充质干细胞膜片以及单一的正常血管内皮祖细胞膜片，正常骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片具有更强的成骨活性以及骨修复能力。关键词：干细胞；骨髓干细胞；细胞膜片；骨髓间充质干细胞；血管内皮祖细胞；共培养；骨质疏松；牙槽骨缺损；国家自然科学基金主题词：骨质疏松, 绝经后；牙槽骨质丢失；骨髓；间质干细胞；组织工程基金资助：国家自然科学基金(81170982)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf

6、23385083Bone marrow mesenchymal stem cells combined with endothelial progenitor cells for repair of alveolar bone defect in ovariectomized ratsWen Yi1, Yang Hong-xu2, Liu Qian1, Liang Yuan1, Liu Zhu-ying1, Ding Yin1 (1Department of Orthodontics, School of Stomatology, the Fourth Military Medical Uni

7、versity, Xian 710032, Shaanxi Province, China; 2Department of Oral Anatomy and Physiology and TMD, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China)AbstractBACKGROUND: Numerous studies have demonstrated that estrogen can regulate the proliferation a

8、nd migration of endothelial progenitor cells (EPCs), while EPCs can also promote the function and activity of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro.OBJECTIVE: To evaluate the ability of the BMSCs and EPCs which construct the composite cell sheet in the repair of alveolar bone defect in

9、 ovariectomized rats. METHODS: BMSCs/EPCs composite sheet, EPCs sheet and BMSCs sheet were respectively implanted into the defects of the alveolar bone in ovariectomized rats. Rats with no implantation served as control group. Repaired alveolar bone was assessed by gross examination, histological ob

10、servation and micro-CT scan at 2, 4, 8 weeks after operation.RESULTS AND CONCLUSION: BMSCs/EPCs composite sheet has greater osteogensis activity and bone repair capacity than BMSCs or EPCs sheet alone.Subject headings: Osteoporosis, Postmenopausal; Alveolar Bone Loss; Bone Marrow; Mesenchymal Stem C

11、ells; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81170982Cite this article: Wen Y,Yang HX, Liu Q, Liang Y, Liu ZY, Ding Y. Bone marrow mesenchymal stem cells combined with endothelial progenitor cells for repair of alveolar bone defect in ovariectomized rats. Zh

12、ongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(19):2748-2755.Wen Yi, Master, Department of Orthodontics, School of Stomatology, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, ChinaCorresponding author: Ding Yin, M.D., Professor, Department of Orthodontics, School of Stomatology, the

13、Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China2753ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction骨组织是一种由细胞、纤维以及基质构成的矿化的结缔组织，它包括以下4种细胞：成骨细胞、骨衬细胞、骨细胞以及破骨细胞。骨在机体内发挥着重要的作用，例如支持保护软组织，容纳骨髓等。破骨细胞的吸收以及成骨细胞的骨生成，二者相互协调，使骨可以不断地进行重建1-2。当骨量大量丢失时会造成骨质疏松，导致骨密度降低、骨微结构退化。骨质疏松症在绝经

14、后妇女中发病率较高，常常导致牙槽骨吸收加快，以及牙周组织的再生与修复难度增加3。目前，常用的骨修复手段有以下几种方式：骨移植、人工骨的应用以及组织工程骨。骨移植因其良好的临床效果作为修复骨缺损的首选材料，特别是当发生小范围缺损时应用较多，骨移植包括自体骨移植以及同种异体骨移植。自体骨移植有以下几个问题：如额外地增加了手术创伤与手术时间，移植骨的形态、大小等方面不易满足要求，可供骨源有限等。虽然同种异体骨骨源更加丰富，但可能增加了疾病传播的风险以及免疫排斥的可能。另外同种异体骨只有骨传导而无骨诱导作用，移植后骨折愈合时间可能相对较长。人工骨可以满足对移植骨量的需求，它是一种较为合理的替代物，但是

15、其本身具有以下局限性，例如机械强度不足，骨传导、骨诱导以及骨结合能力较弱，生物降解性能较差。组织工程骨克服了自体、异体骨移植导致的供区损伤、移植免疫排斥和致病性等缺点，是一种理想的骨修复材料4-5。骨的愈合与修复都依赖局部微血管的生成，特别是在大范围缺损或者组织再生能力较差时，通过促进血管形成来提高骨组织的再生与修复能力是非常重要的。血管生成是修复骨缺损的关键步骤，它确保了充足的营养供应，废弃代谢产物的转移以及支持祖细胞的循环。如果在骨组织移植初期无法获得足够的血供，可能导致骨再生过程的中断、骨不愈合或者延迟愈合6-8。血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，

16、EPCs)是血管内皮细胞(endothelial cell，EC)的前体细胞，可以发育和分化为外周血细胞和血管壁细胞，同时具有特异性归巢的能力，以及增殖、分化、形成新生血管的能力9-12。目前，国内外多项研究已证实雌激素可以调控血管内皮祖细胞的增殖和迁移能力，从骨髓中动员内源性血管内皮祖细胞也许是增加新血管生成的一种可行的方式，同时也可作为缺血性心血管疾病的治疗方法。促炎因子、生长因子、细胞因子、激素均可以动员血管内皮祖细胞13-15，并且血管内皮祖细胞又能提高体外培养骨髓间充质干细胞的功能和活性。在适宜的实验条件下，骨髓间充质干细胞在体外有较强的增殖能力和分化能力，可以分化为骨、软骨以及脂肪

17、组织。同时，骨髓间充质干细胞募集、增殖、分化成为成骨细胞受多种因素调控，包括细胞因子、激素、生长因子等。人们普遍认为内皮细胞与成骨细胞之间的关联可以调节血管形成以及骨形成细胞的分化从而调节骨代谢16-18。相当一部分研究也着眼于内皮细胞对于成骨细胞分化的影响19-20。因此，在体外培养环境中加入血管内皮祖细胞来逆转去势大鼠骨髓间充质干细胞的干细胞特性，提高去势大鼠牙槽骨缺损的修复效果，在理论上是有充分依据的。现已证实在雌激素缺乏的微环境下，骨髓间充质干细胞对于去势大鼠牙槽骨缺损的修复有一定促进作用21-22。但由于去势大鼠缺乏雌激素，降低了骨髓间充质干细胞的骨向分化能力，使骨髓间充质干细胞的凋

18、亡增加，成骨能力受到一定影响23-24。在雌激素缺乏的情况下，用于组织再生的骨髓间充质干细胞的成骨能力降低，若改善局部微环境将会有利于骨髓间充质干细胞分化，从而促进骨再生。实验以提高骨髓间充质干细胞增殖与骨向分化能力及牙周组织缺损修复效果为出发点，将骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞膜片植入去势大鼠牙槽骨缺损内，采用micro-CT扫描等技术观察牙槽骨缺损处成骨情况，为提高牙槽骨缺损修复效果奠定理论基础，并创建骨组织缺损修复的新思路。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 体外实验，体内实验，样本观察。1.2 时间及地点 实验于2014年3至8月在解放军第四军医

19、大学口腔颌面外科实验室完成。1.3 材料 1.3.1 实验动物 健康6周龄SD雌性大鼠48只，体质量180-200 g，由解放军第四军医大学动物中心提供。实验动物的饲养、操作、处置、处死均符合解放军第四军医大学动物伦理委员会标准。其中，6只大鼠用于提取原代骨髓间充质干细胞和血管内皮组细胞，6只大鼠用于鉴定骨质疏松模型，36只大鼠制备骨质疏松后牙槽骨缺损模型。1.3.2 实验试剂及仪器 -MEM培养基(Hyclone, 美国)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；地塞米松、-甘油磷酸钠、抗坏血酸、胰岛素、胰蛋白酶、甲苯胺蓝(Sigma公司)；CD29-PE，CD45-PE，CD90-PE (

20、eBioscience，美国)；CD105-PE，CD34-PE(Abcam，英国)；VEGFR2-PE (Bioss，中国)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；CO2细胞培养孵箱(美国Forma公司)；超净工作台(苏州净化总厂)；低温高速离心机(Sigma，美国)。1.4 实验方法1.4.1 骨髓间充质干细胞与血管内皮祖细胞的分离培养 将6只SD大鼠脱颈处死，乙醇中浸泡30 min后转移至超净工作台。无菌条件下，完整取出大鼠双侧后肢胫骨以及股骨，并剃净周围软组织。使用-MEM培养液反复冲洗股骨及胫骨骨髓腔，将骨髓冲洗液转移至含有7 mL Percoll分离液(1.073 g/mL)的

21、离心管中，2 000 r/min离心20 min，吸取中间单个核细胞层，转移至含有3 mL PBS离心管中，以1 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入-MEM培养液吹打均匀后接种于25 cm2培养瓶中，放置于37 ，体积分数为5%CO2饱和湿度条件的孵箱培养48 h，贴壁细胞即为骨髓间充质干细胞。经成骨诱导后茜素红染色可见红色钙结节生成，成脂诱导后油红O染色可见大小不一的透亮红色脂滴形成，验证骨髓间充质干细胞具有多项分化的能力。收集培养瓶中上清液至离心管，1 000 r/min离心 10 min，弃上清液，加入EGM-2 Bulletkit培养基，重悬后接种于25 cm2培养瓶中

22、，放置于37 ，体积分数为5%CO2饱和湿度条件的孵箱培养，可得血管内皮祖细胞。骨髓间充质干细胞以及血管内皮祖细胞每3 d更换1次培养液，并在镜下观察，待培养瓶底壁细胞长至70%-80%时，弃去培养液，PBS洗涤2遍，以0.25%胰酶消化传代，逐渐纯化细胞。1.4.2 正常骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片的制备 将第2代骨髓间充质干细胞以及原代血管内皮祖细胞用胰蛋白酶消化5 min，1 000 r/min离心10 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的-MEM培养液重新吹打均匀。细胞计数后，每种细胞按每孔1.5×105个接种于6孔板内(每孔共3.0×105个细胞)

23、，培养24 h后，更换培养液为成膜诱导液(含体积分数为10%胎牛血清，50 mg/L维生素C的-MEM培养液，注意避光保存)。每3 d换液1次，10 d左右细胞膜片制备成功。1.4.3 正常骨髓间充质干细胞膜片的制备 将第2代骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化5 min，1 000 r/min离心10 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的-MEM培养液重新吹打均匀。细胞计数后，以每孔3.0×105个细胞接种于6孔板内。培养24 h后，更换培养液为成膜诱导液(含体积分数为10%胎牛血清，50 mg/L维生素C的-MEM培养液，注意避光保存)。每3 d换液1次，10 d左右细胞膜片制备成

24、功。1.4.4 血管内皮祖细胞膜片的制备 将原代血管内皮祖细胞用胰蛋白酶消化5 min，1 000 r/min离心10 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的-MEM培养液重新吹打均匀。细胞计数后，以每孔3.0×105个细胞接种于6孔板内。培养24 h后，更换培养液为成膜诱导液(含体积分数为10%胎牛血清，50 mg/L维生素C的-MEM培养液，注意避光保存)。每3 d换液1次，10 d左右细胞膜片制备成功。1.4.5 细胞膜片检测 倒置显微镜下观察细胞形态。将获得的3种细胞膜片经40 g/L多聚甲醛固定24 h，常规脱水、包埋、切片后，进行碱性磷酸酶染色，镜下观察细胞膜片的组织学

25、结构。1.4.6 骨质疏松症大鼠模型的建立与鉴定 取6只健康6周龄雌性SD大鼠分2组(n=3)：实验组大鼠做骨质疏松模型双侧卵巢摘除手术，对照组大鼠做假手术空白对照。以1%戊巴比妥钠按3.5 mL/kg剂量行腹腔内注射麻醉，实验组在无菌条件下经双侧腰背部切口切除双侧卵巢，逐层缝合。对照组做完腰背部切口，暴露卵巢后不切除，然后逐层缝合。术后连续3 d腹腔内注射抗生素防止感染，并注意保暖。3个月后，在无菌操作下完整取出实验组与对照组大鼠双侧后肢胫骨，剃净周围软组织，进行Micro-CT扫描，比较二者骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁间隙、骨体积分数，骨表面积/组织体积的比值等指标，经鉴定骨质疏松模型建

26、立成功。1.4.7 骨质疏松后牙槽骨缺损模型的制备及细胞膜片的植入 在骨质疏松症大鼠模型鉴定成功基础上，将36只健康6周龄雌性SD大鼠饲养到12周龄后，随机分为4组，每组9只。所有大鼠做双侧卵巢摘除的骨质疏松症模型后，给予1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在上颌第一磨牙近中舌侧，使用牙科手机慢速、间歇地预备长×宽×深约4 mm×3 mm×3 mm大小的缺损。骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞组：去势大鼠上颌牙槽骨缺损处内植入正常大鼠骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合细胞膜片。骨髓间充质干细胞组：去势大鼠上颌牙槽骨缺损处内植入正常大鼠骨髓间充质干细胞膜片。血管内

27、皮祖细胞组：去势大鼠上颌牙槽骨缺损处植入正常大鼠血管内皮祖细胞膜片。空白对照组：去势大鼠上颌牙槽骨缺损处内不植入细胞膜片。植入后，将黏膜缝合，避免植入物漏出。术后连续3 d给予腹腔内注射抗生素，并注意保暖。1.4.8 Micro-CT扫描 术后2，4，8周脱颈处死大鼠(每时间点3只大鼠)，取其上颌骨，置于40 g/L多聚甲醛固定，行Micro-CT扫描，观察牙槽骨缺损处成骨情况。1.5 主要观察指标 植入细胞膜片不同时间去势大鼠牙槽骨缺损处修复情况。1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量数据以±s表示，采用配对t 检验比较成对样本，采用方差分析和SNK-q

28、 检验比较多组间的统计差异， P < 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results 2.1 骨髓间充质干细胞以及血管内皮祖细胞形态 第2代骨髓间充质干细胞呈现不规则形态，大多呈多边形或菱形(图1A)。血管内皮祖细胞原代培养48 h后，少量细胞贴壁，多数为小的圆形细胞。随着培养时间延长，细胞体积增大，呈梭形。培养至第9天时，可见部分细胞为菱形(图1B)。2.2 细胞膜片的制备 正常骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片，正常血管内皮祖细胞膜片以及正常骨髓间充质干细胞膜片进行碱性磷酸酶染色，倒置显微镜下可见明显的黑色钙盐沉积(图2)。2.3 骨质疏松症大鼠模型的建立 雌性大鼠双侧卵

29、巢摘除3个月后，分别脱颈处死实验组和对照组大鼠，取其双侧胫骨，利用Micro-CT检测(图3)，检测范围为自胫骨骨骺线至其远端1 mm处区域。实验组骨体积分数、骨小梁厚度以及骨小梁数目均较对照组明显降低，骨小梁排列稀疏。因此，SD雌性大鼠切除卵巢3个月后呈明显的骨质疏松状态，验证造模成功。2.4 去势大鼠牙槽骨修复效果 于2，4，8周处死各组大鼠，取其上颌牙槽骨进行Micro-CT检测，分析牙槽骨缺损处骨体积分数。结果显示在去势大鼠牙槽骨缺损中植入正常骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片的修复效果优于只植入单一的正常骨髓间充质干细胞膜片以及单一的正常血管内皮祖细胞膜片(图4)。3 讨论 D

30、iscussion目前各种问题所导致的骨缺损是临床上的难题，修复因创伤和疾病导致的大范围缺损是整形外科以及颌面外科的一个主要难题。传统修复骨缺损的方式包括自体骨移植以及同种异体骨移植，但是它们都有一些局限性和并发症，比如供区并发症以及免疫反应。组织工程的兴起也是针对丧失或缺损的器官或组织重建的一种更好的选择，避免了传统方法移植中的问题。现阶段面临的问题是生物材料应满足骨组织基质的机械强度与生物学环境，并可以支持恢复骨组织功能时所必需的形成血管的能力25-27。骨髓间充质干细胞作为组织工程骨的理想种子细胞，具有易于分离培养、体外扩增较快、成骨分化潜能、取材方便，来源充足、稳定的生物相容性等显著特

31、点28。1987年Friedenstein等29发现在塑料培养皿中培养的贴壁骨髓单个细胞在一定条件下可以分化为多种类型细胞，且经20-30个培养周期仍可以保持多向分化的能力，这种多能细胞能够分化为多种中胚层来源的间质细胞，故称为间充质干细胞，或间质祖细胞。骨髓间充质干细胞一直成为组织工程修复骨缺损的热点。在众多环境因素问题中，导致骨缺损未能较好修复的主要原因是血管化的问题没有较好解决。血管内皮祖细胞是由Asahara等30-31在1997年第一次在人外周血中发现一类可以自我更新，同时又证实它可定向分化为成熟内皮细胞的前体细胞群，之后又有大量证据支持血管内皮祖细胞的存在、起源以及在形成新生血管中

32、的作用。事实上，血管内皮祖细胞可以增殖、迁移以及分化为成熟的内皮细胞。血管内皮祖细胞在参与血管新生过程中包括动员、迁移、黏附、分化多个步骤。血管内皮祖细胞从骨髓动员至外周循环是血管生成的关键一步。当组织缺血时，血管内皮祖细胞和细胞因子均动员至缺损区域，继而分化成为成熟的血管内皮细胞，参与新生血管的形成32-33。骨髓间充质干细胞较容易分离，有多功能分化潜力，并保留“归巢”特点，使得它们在骨组织修复以及治疗相关疾病中成为第一选择。已证实骨髓间充质干细胞广泛存在于骨髓和松质骨，在骨代谢中发挥重要作用32。许多研究已经证实骨髓间充质干细胞经诱导可以分化为成骨细胞，并分泌多种成骨活性因子。在体内它们也

33、具备修复骨和软组织损伤的潜能33。实验采取雌性SD大鼠制作骨质疏松模型，卵巢摘除术后12周，Micro-CT扫描可见大鼠骨体积分数、骨小梁厚度以及骨小梁数目均较对照组明显降低，同时骨小梁排列稀疏，因此验证SD雌性大鼠切除卵巢12周后呈明显的骨质疏松状态。1993年，日本学者Nagase等34-36首次报道将温度敏感性聚合物应用到细胞培养上，创新地发明了细胞膜片技术，其具体方法是将N-异丙基丙烯酰胺凝胶涂布于普通培养皿底壁制备成温培养皿，这种培养皿表面具有疏水性，细胞于37 培养条件下黏附于表面并增殖。在低于32 时，培养皿表面变得极度亲水，该材料自发膨胀形成一层水化层，使原本易于黏附于疏水性表

34、面的细胞难以继续黏附，于是以膜状结构从培养皿底分离，可收集到完整的细胞膜片。实验采用抗坏血酸制备成膜诱导液用于制备骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片、骨髓间充质干细胞膜片以及血管内皮祖细胞膜片。培养10 d左右，于6孔板内便可见乳白色半透明的细胞膜片，6孔板边缘发生卷曲，可以用眼科镊直接揭起，获得完整的细胞膜片，膜片具有一定的机械强度，可以将其卷曲，折叠。将细胞膜片固定后切片，行碱性磷酸酶染色，显示3种膜片均有黑色钙盐沉积形成，提示均有成骨能力，且骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片形成的黑色钙盐沉积多于骨髓间充质干细胞膜片以及血管内皮祖细胞膜片，显示骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞

35、复合膜片具有更强的成骨能力。将骨髓间充质干细胞与血管内皮祖细胞直接共培养制备复合细胞膜片，可以最大限度保持完整的细胞外基质、维护种子细胞的生物学特性、维持细胞间的正常连接、提高组织修复的效果。Kobayashi等37学者将内皮祖细胞接种于复合成纤维细胞膜片，堆积多张复合膜片构建类似“三明治”结构，移植至小鼠心肌梗死模型，效果比单纯成纤维膜片能更有效地修复缺血性心肌。Matsumoto等38分离获取外周循环血中的血管内皮祖细胞和骨祖细胞进行骨缺损修复，实验发现两种细胞促进血管形成和骨形成，从而增强骨修复作用，结果证实内皮祖细胞在骨修复过程中的重要性。Yu等39研究发现复合了内皮祖细胞的组织工程骨

36、，可通过有效的血管化促进成骨，同时防止骨坏死的发生。去势大鼠骨代谢的失调与绝经后骨质疏松相似，但是比人类出现骨质疏松更快。在双侧摘除卵巢后，骨转换增多，在术后的1个月达到最高，大约持续到术后100 d，之后骨转移达到正常水平。去势大鼠骨髓间充质干细胞很多性质和质量上的指标发生变化，比如增殖能力、成骨分化能力都减弱，端粒长度减小，对外来刺激的应答能力减弱。碱性磷酸酶染色、油红O染色、PCR分析进一步证实双侧切除卵巢确实影响了骨髓间充质干细胞的成骨成脂的分化。实验将骨髓间充质干细胞以及血管内皮祖细胞以直接共培养形成细胞膜片的形式，植入去势大鼠牙槽骨缺损中，可以最大限度保持细胞外基质的完整性，保证细

37、胞间的正常连接，维护骨髓间充质干细胞以及血管内皮祖细胞的生物学特性，从而提高组织修复的效果40-41。综上所述，实验利用简单有效的细胞膜片技术，在雌激素缺乏的微环境下，将骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞膜片植入去势大鼠牙槽骨缺损处内进行修复，结果证实复合细胞膜片修复效果优于单一的细胞膜片。骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片成骨的同时，血管内皮祖细胞可以通过促进血管形成，从而提高骨缺损修复的效果，为今后临床应用奠定基础。致谢：感谢杨鸿旭硕士和解放军第四军医大学颌面外科与创伤实验室。作者贡献：实验设计为第一作者，实验实施为第一、二作者，实验评估为第一作者及通讯作者，资料收集为第一、二、三、四

38、作者。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：实验过程中对动物的处置符合2009 年Ethicalissues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：通讯作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1

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49、omal cells. Biomed Eng Online. 2009;8:34.2755ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH图2 骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片、骨髓间充质干细胞膜片以及血管内皮祖细胞膜片碱性磷酸酶染色Figure 2 Alkaline phosphatase staining of bone marrow mesenchymal stem cells/endothelial progenitor cells composite sheet, bone marrow mesenchymal stem cell sheet

50、 and endothelial progenitor cell sheet图注：图中A，B，C分别为骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片、骨髓间充质干细胞膜片以及血管内皮祖细胞膜片，经碱性磷酸酶染色后于倒置显微镜下观察，箭头所示为黑色钙盐沉积(×200，bar=50 m)；D，E，F为A，B，C对应的放大图(×400，bar=25 m)。 A图1 体外培养第2代骨髓间充质干细胞和原代血管内皮祖细胞形态Figure 1 Morphology of passage 2 bone marrow mesenchymal cells and primary endothelia

51、l progenitor cells in vitro图注：图中A为第2代骨髓间充质干细胞，多为多边形或菱形(×200，bar=50 m)；B为原代血管内皮祖细胞培养至第9天，形态由刚开始的圆形逐渐变为多角形或纺锤形(×200，bar=50 m)；C和D为A，B对应的放大图(×400，bar=25 m)。BCDA00.050543210骨小梁数量(1/mm)00.050P < 0.01P < 0.05骨小梁厚度(mm)骨体积分数0.20P < 0.05骨小梁间隙(mm)对照组 实验组对

52、照组 实验组对照组 实验组对照组 实验组图3 去势3个月实验组和对照组胫骨近端骨小梁参数的对比Figure 3 Changes in trabecular structural parameters assessed by micro-CT in the proximal tibia of ovariectomized rats 3 months after ovariectomy compared with the control group空白对照组骨髓间充质干细胞膜片血管内皮祖细胞膜片骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片CBA空白对照组骨髓间充质干细胞膜片血管内皮祖细胞膜片骨髓间充质

53、干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片空白对照组骨髓间充质干细胞膜片血管内皮祖细胞膜片骨髓间充质干细胞/血管内皮祖细胞复合膜片aaaa骨体积分数0.10骨体积分数aa骨体积分数a8周aaaa2周aa0.300.20ab4周图4 细胞膜片植入后2，4，8周上颌牙槽骨感兴趣区骨结构参数的比较Figure 4 Comparison of bone structure parameters in the region of interest between experimental and control groups at 2, 4, 8 weeks a

54、fter cell sheet implantation图注：图中A，B，C为细胞膜片植入后2，4，8周。aP < 0.05，bP < 0.01(n=3)。20 Bianchi G, Banfi A, Mastrogiacomo M, et al. Ex vivo enrichment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2. Exp Cell Res. 2003;287(1): 98-105.21 Li DJ, Ge DX, Wu WC, et al. Osteogenic potential o

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