项目12病原性真菌的检测

1、项目12：病原性真菌的检测【目的要求】了解真菌接种、培养的一般程序；掌握单细胞真菌和多细胞真菌的菌丝、孢子的形态特点；掌握真菌不染色标本直接检查方法。【实验内容】一、真菌的菌落观察（示教）观察真菌菌落的形态特点及颜色有助于病原性真菌的鉴定。一般观察真菌的菌落必需将真菌培养于沙保弱氏培养基（俗称大培养），经数日致十数日的培养后才可看到典型菌落。【材 料】1临床标本（可疑真菌感染）：毛发或皮屑 2真菌菌种：新生隐球菌，白假丝酵母菌，絮状表皮癣菌。3沙保弱氏葡萄糖斜面培养基（含青、链霉素）4其它：70%酒精 、无菌生理盐水 、平皿等。【方 法】1临床标本用70%酒精浸泡数分钟，杀死表面杂菌，以无菌生

2、理盐水洗涤。2将处理过的临床标本和实验室保存菌种分别接种于23只含有青、链霉素的沙保弱氏葡萄糖斜面培养基上，对临床标本直接将数根毛发或数块皮屑接种。真菌菌种则用灭菌接种环按斜面培养基接种法接种。 3置2228培养23w或37培养箱中培养37d。 4一周观察12次，临床标本连续培养3w无菌落生长者可报告阴性，如长出菌落，应逐日观察菌落形态及颜色变化。 【结果观察】真菌的菌落从形态上可分三大类：酵母菌落、酵母样（型）菌落及丝状菌落。1.酵母菌落（观察新生隐球菌培养物）：菌落为圆形、较白色，边缘整齐表面光滑、湿润，假菌丝不伸入到培养基内，和表皮葡萄球菌菌落相似。 2.酵母样（型）菌落（观察白假丝酵母

3、菌）：表面和酵母菌落相似，但生成的假菌丝伸入培养基内。 3.丝状菌落：观察各种皮肤丝状菌斜面培养物,菌落表面大都有气生菌丝,肉眼观察呈绒毛状、粉状、棉花样等，故称丝状菌落，色泽多种多样，红色毛菌呈紫红色，铁锈色毛菌呈铁锈色或棕色等，菌落底层有营养菌丝伸入培养基内。二、真菌的形态观察 【原 理】单细胞真菌形态观察：酵母菌是不运动的单细胞真核微生物,其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖。本实验用美兰染液水浸片观察白色念珠菌和酵母菌的形态和出芽生殖方式。由于美兰是一种无毒性染料，它的氧化型呈蓝色，还原型呈无色。用美兰对酵母的活细胞染色时，由于其新陈代谢，细胞具有较强

4、的还原能力，因此可将氧化型的美兰转化为还原型的美兰，而衰老细胞或死细胞其还原能力弱或无，因此，仍呈淡蓝色或蓝色。故可借此可对酵母菌的活细胞和死细胞进行鉴别。多细胞真菌是由菌丝和孢子构成的。其中菌丝相互交织成团，形成复杂的菌丝体，俗称霉菌。菌丝按其功能不同可分为营养菌丝、气中菌丝和生殖菌丝三种。孢子由生殖菌丝产生，分无性孢子和有性孢子二种。霉菌的菌丝体和孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。直接制片观察法：是将真菌的培养物置于美兰染色液中，制成霉菌制片观察。1菌丝的形态 梳状菌丝：菌丝一侧有多数短的分枝，间距不等，形如梳子，故名梳状菌丝常见于许兰氏毛菌。螺旋状菌丝：某些菌丝呈螺旋状弯曲，常

5、见于石膏样小孢子菌和许兰氏毛菌。 球拍样菌丝：在菌丝分节处一端膨大，如网球拍样，常见于小孢子菌（microsporum）及表皮癣菌(epidermophyton)。结节状菌丝：菌丝缠绕成结节样，常见于奥杜盎小孢子菌等。鹿角状菌丝：菌丝末端膨大成鹿角状，多见于许兰氏毛菌。假菌丝：酵母菌（如：白假丝酵母菌）的菌体细胞延长分枝后并不脱落，形成类似菌丝的结构。2孢子的形态芽生孢子（blastospore）：从母细胞发芽而产生，如新生隐球菌（墨汁染色）。厚膜孢子(chlamydospore)：是从菌丝产生的一种大而圆形的孢子，于毛癣菌（trichophyton）及小孢子菌中常见。小分生孢子（micloc

6、onidia）:孢子为单细胞性孢子，常直接或由小侧枝连接而生长于菌丝的侧面。毛癣菌中常可见到小分生孢子群集中在分枝菌丝末端，呈葡萄状。也有圆形小分生孢子位于菌丝的旁侧。 大分生孢子（macroconidia）：是一种多细胞性孢子，常为梭形或棒形，多数大分生孢子具有数个横隔，每个横隔即为一个细胞。如絮状表皮癣菌的大分生孢子为粗棍型或卵圆形，末端较粗而钝圆，单一或簇生于菌丝端，大小孢子菌则为梭形大分生孢子。 关节孢子（althrospore）：由菌丝细胞分化成几个长方形的节段而成，胞壁也稍厚些，在陈旧培养物中常可出现。【材 料】1 菌种：脚癣病人皮屑、白色念珠菌、酵母菌、黑曲霉培养物2 染色液：0

7、.1%的美兰染液3 封固液：10%NaOH【方 法】1不染色标本的检查： （l）标本制作：取少量标本于载玻片上，滴加一滴封固液，上覆盖玻片，将载玻片放在火焰上方微加热，使组织或角质溶解，但切勿过热以免产生气泡或烤干也可将盖片稍加按压，使溶解的组织分散并使其透明，吸去周围溢液避免沾污盖玻片。 （2）检查先用低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查菌丝、孢子的特征。镜检时用稍弱的光线使视野稍暗为宜、低倍镜下菌丝呈折光性较强、绿色纤维分枝丝状体；高倍镜下，菌丝呈分隔或呈节孢子，有时菌丝末端有较粗短的关节孢子。2单细胞真菌的美兰浸片观察（1）在载玻片的中央加一滴0.1%美兰染色液,然后按无菌操作用接种环挑取少量白色念珠菌或酵母菌的菌苔放在染液中,混合均匀。（2）用镊子取一块盖玻片，先将盖玻片的一边与染液接触，然后缓慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上。（3）将制片静置3min后镜检，分别用低倍镜和高倍镜观察其形态和出芽情况，并绘图记录结果。3多细胞真菌的直接制片观察（1）在载玻片的中央加一滴0.1%美兰染色液,然后按无菌操作用接种环挑取菌落边缘处少