赤芍总苷的提取纯化与质量检查设计方案

1、赤芍总昔的提取纯化与质量检查设计方案1文献背景赤芍为毛豆科植物芍药 paeonia lactiflora pall.或川赤芍 paeonia veitchiilynch的干燥根，具有清热凉血、散瘀止痛的功效，其主要有效成分为芍药甘、 芍药内酯甘、氧化芍药甘、苯甲酰芍药甘、芍药花甘等单菇甘类化合物，总称赤 芍总甘，可改善机体微循环，抑制血小板凝聚，抗血栓形成，具有广泛的药理活 性1-3,是一种可用于保健食品的中药。1.1 赤芍总昔背景意义在药理学上，赤芍总甘对血液具有抗凝血、抗血栓以及抗内毒素和改善微循 环的作用。并且赤芍总甘对缺血性损伤如心肌缺血同样具有保护作用4,正是这样的良好使用疗效，我们

2、需要对赤芍总昔进行更多的研究， 来保证临床的使用疗 效。1.2 提取研究现状目前报道的赤芍总甘提取工艺文献中，多采用正交试验设计法。即分别称取赤芍药材若干（通常 800g）,以不同的提取液（水、乙醇）分别按正交试验 设计表试验，滤过，合并滤液，量取体积，即得正交试验各试验的提取液。1.3 纯化研究现状目前报道的赤芍总昔纯化工艺文献中，多采用正丁醇萃取法和大孔树脂吸附 法6。即将提取过程中，包括糖类、脂类等许多杂质在内的浸膏提取液，补充蒸 储水至药材的2倍量，作为待纯化样品溶液。纯化方法1 （正丁醇萃取法）：取上述待纯化样品溶液 200ml,取等量石油 醴萃取3次，除去石油醴层，然后用水饱和后的

3、正丁醇萃取 3次，收集正丁醇层， 再用200ml蒸储水洗1次，弃去水层，减压回收正丁醇，所得浸膏于真空干燥器 中干燥。纯化方法2 （大孔树脂吸附法）：d101大孔吸附树脂100g,经95%乙醇浸 泡12h,充分溶胀后装柱，蒸储水洗至无醇味，备用。上述待纯化样品溶液取 200ml,上树脂柱，3倍量蒸储水洗，再用3倍量的乙醇洗脱，收集20%洗脱组 分，减压回收乙醇，剩余浸膏于真空干燥器中干燥。1.4 质量控制赤芍中赤芍总苷质量控制包括性状鉴别（颜色、气味）、薄层鉴别（蓝紫色斑点）、以及对其进行高效液相色谱的含量测定（检测波长为 230nm,理论板数按芍药苷峰计算应不低于3000）以及水分、炽灼残渣

4、，重金属等检测。2 赤芍饮片的质量检查2.1 性状 : 本品应呈圆柱形，稍弯。表面棕褐色，粗糙，有纵沟和皱纹，并有须根痕和横长的皮乳样突起，有的外皮易脱落。质硬而脆，易折断，断面粉白色或粉红色，有的有裂隙。气微香，味微苦、酸涩。2.2 鉴别：取本品粉末0.5g,加乙醇10ml,振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇 2ml 使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录vi b）试验，吸取上述两种溶液各4晨 分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（ 40： 5： 10： 0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷

5、以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。 供试品色谱中， 在与对照品色谱相应的位置上， 显相同的蓝紫色斑点。2.3 含量测定： 照高效液相色谱法（通则0512）测定。2.3.1 色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以甲醇 -0.05mol/l 磷酸二氢钾溶液（ 40：65）为流动相；检测波长为 230nm。理论板数按芍药甘峰计算应不低于3000。2.3.2 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥36 小时的芍药苷对照品适量， 精密称定，加甲醇制成每1ml 含 0.5mg 的溶液，即得。2.3.3 供试品溶液的制备取本品粗粉约0.5g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精

6、密加入甲醇25ml,称定重量，浸泡4 小时，超声处理20 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.3.4 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10gl注入液相色谱仪，测定，即得。本品含芍药甘（c23h28。11）不得少于1.8%。参考文献： 2015版中国药典3 赤芍总苷的提取工艺3.1 指标成分的选择及含量测定赤芍中所含丰富的苷类成分总称赤芍总苷， 为赤芍的主要活性部位， 其中以芍药苷的含量最高，选择芍药苷作为含量测定的指标成分。3.1.1 hplc色谱条件的优化选择色谱柱的选择：考察 hypersil ods(150mm*4.6mm,5 pm)和

7、 hypersilbds(200mm*4.6mm,5 ；m)流动相选择：流动相考察甲醇-水系统、甲醇-0.05%磷酸溶液系统、乙腈-水及乙腈-0.05%磷酸溶液系统。流速选择：流速考察0.6ml/min、 0.8ml/min 、 1.0ml/min3.1.2 对照品溶液的制备精密称取芍药苷对照品 10.63mg， 置 25ml 量瓶中， 加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液(每lml含芍药昔对照品425.2小。3.1.3 标准曲线的制备分别精密量取对照品贮备液溶液(425.2仙/ml)0.5ml、1.0ml > 2.0ml、3.0ml、4.1 ml、 5.0ml 置 10ml

8、容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取上述不同浓度对照品溶液各10屋注入液相色谱仪，按前述色谱条件分别测定其峰面积。以对照品浓度x 为横坐标，峰面积积分值y 为纵坐标，绘制标准曲线。4.2 .4 供试品溶液的制备及测定取提取液，稀释至一定体积，滤过，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10晨注入液相色谱仪，测定，由外标一点法计算即得芍药苷含量。3.2 提取溶媒的筛选：赤芍中所含苷类成分极性较大， 在水、 乙醇等亲水性溶剂中溶解度较好。 本实验以芍药苷的含量为评价指标，考察水和不同浓度的乙醇对芍药苷的提取效率，筛选赤芍药材的最佳提取溶媒。见表1：表1不同提取溶媒芍药昔含量提取

9、溶媒水50%乙醇70%乙醇溶媒用量（倍）666提取次数（次）222提取时间（h）1.51.51.5芍药昔含量（%）3.3 正交试验设计优化提取工艺3.3.1 因素水平设置溶剂法提取中影响提取效率的因素主要有溶媒用量、提取时间及提取次数等。根据实际情况，设置醇用量、提取时间及提取次数为3个考察因素，因素水平设置见表2。表2因素-水平表因素-水平a溶媒（倍）b提取时间c提取次数（h）（次）1411261.523.3.2 实验安排及结果考察影响提取效能的主要因素乙醇用量、提取时间、提取次数及相应水平， 选取正交表l9（34）作正交试验，所选因素一水平见表 2。称取川赤芍药材约50g, 按l9（34）

10、正交试验表按排试验，以芍药甘含量（芍药昔含量=提取液中芍药音质量/ 称取的药材量*100%）为评价指标。试验方案见表 3表3 3l9(34)正交试验表表头abcd芍药甘含量(%)1234111112122231333421235223162312731328321393321iiiiiiss3.3.3 验证试验以优化工艺条件重复试验3次，验证试验结果见表4表4验证试验结果试验 试验号投料量固形物固形物rsd 芍药甘 芍药甘 rsd方呆k kg)得率平均得率含量 平均含量(%)(%)(%)(%)(%)(%)124赤芍总昔(tpg的纯化工艺的优化4.1 上样液预处理赤芍醇提液减压浓缩至无醇味，加水

11、适量分散溶解、过滤定容，制成每毫升含0.2g生药(0.2g ml-1)的溶液,备用。4.2 大孔吸附树脂型号筛选取ab-8型和d-101型大孔吸附树脂各20ml,装于树脂柱中(径高比为1:8), 取样液40ml上样。先用3bv蒸储水，再用5bv 20%乙醇洗脱，合并乙醇洗脱 液，测定，结果见表5。从芍药音吸附解析率和残液中芍药昔含量综合考虑，选 择树脂种类。表5树脂动态吸附实验结果吸附-残液中含量树脂型号(mg)(%)(%)d101207.31ab-8207.314.3 上样浓度考察取ab- 8型大孔吸附树脂3份，每份20ml,装柱(径高比为1:8),分别取含 生药浓度为0.1g ml-1、0

12、.2g ml-1、0.3g ml-1样品液上样，吸附流速为1.0ml min-1。然后用3bv水洗脱，再以5bv 20%乙醇洗脱，按4.3色谱条件进行测定醇洗脱液中芍药昔含量，结果见表 6表6上样浓度考察结果上样浓度（g - ml-1）0.10.20.3芍药甘洗脱量（mg）洗脱率（%）4.4 泄漏曲线考察取ab- 8型大孔吸附树脂20ml,装于树脂柱中（径高比1:8）,取样品液60ml 上样，吸附流速为1.0ml min-1。收集流出液，每5ml为一流分。按如下色谱条 件测定，绘制泄漏曲线，确定最大上样量。色谱条件：diamonsil c18色谱柱（250ma4.6mm,5nm）乙月青为流动相

13、 a, 水为流动相b,按表7进行梯度洗脱；流速1.0ml min-1;柱温25c；检测波长 230nm。表7流动相梯度洗脱时间表时间/min流动相a/%流动相b/%01486209552514864.5 吸附流速的考察取ab- 8型大孔吸附树脂3份，每份20ml,装柱（径高比为1:8）,取样液60ml 上样，吸附流速分别为1.0ml min-1、2.0ml min-1、3.0ml min-1。进行动态吸 附后，先用3bv水洗脱，再用5bv 20%乙醇洗脱，按4.3色谱条件进行测定， 结果见表8吸附流速（ml min-1）123芍药甘洗脱量（mg）洗脱率（%）4.6 树脂径高比考察取直径依次为1

14、.4cm、1.5cm、1.6cm的树脂柱3根，分别加入ab- 8型大孔 吸附树脂各20ml,装柱（径高比为1:6、1:8、1:10）,取样液60ml上样，吸附流 速为1.0ml min-10然后用3bv水洗脱，再以5bv 20%乙醇洗脱，收集乙醇洗 脱液，按4.3色谱条件进行测定，结果见表9。表9树脂径高比考察结果树脂径高比1:61:81:10芍药甘洗脱量（mg）洗脱率（%）4.7 水洗除杂体积考察取ab- 8型大孔吸附树脂四份，每份20ml,装柱（径高比1:8）,取样品液60ml 上样，吸附流速分别为1.0ml min-1,进行动态吸附后，分别用1bv、2bv、3bv 和4bv水洗，测定水洗

15、脱液中芍药昔的含量，计算损失率，结果见表 10。表10水洗除杂体积考察结果水洗脱体积（bv）1234水洗液中芍药甘累积含量（mg）芍药昔累积损失率（）4.8 洗脱溶剂考察取ab- 8型大孔吸附树脂4份，每份20ml,装于树脂柱中（径高比为1 ： 8）, 60ml样品液上样，吸附流速分别为1.0ml min-1。然后先以3bv水洗脱，再分 别用20%、40%、60%和80%乙醇洗脱，按4.3色谱条件进行测定醇洗脱液中芍 药昔含量，结果见表11。表11洗脱溶剂考察结果洗脱剂乙醇（）20406080芍药甘洗脱量（mg）洗脱率（%）4.9 洗脱曲线取ab- 8型大孔吸附树脂20ml,装于树脂柱中（径高

16、比为1:8）, 60ml样品液 上样，吸附流速分别为1.0ml min-1。然后先以3bv水洗脱，再用20%乙醇洗 脱，每10ml收集一份，洗脱液减压至干，以10ml甲醇复溶，按4.3色谱条件进 行测定醇洗脱液中芍药昔含量，绘制洗脱曲线，确定洗脱剂用量。5赤芍中赤芍昔提取物的质量控制5.1 性状：棕褐色粉末，气微香，味微苦、酸涩。5.2 鉴别：取本品粉末0.2g,加乙醇10ml,振摇5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣 加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取芍药昔对照品，加乙醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502）试验，吸取上述两种溶液各451分别点于同一硅胶 g薄

17、层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40: 5: 10: 0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相 同的蓝紫色斑点。5.3 含量测定：照高效液相色谱法(通则0512)测定。5.3.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05mol/l磷酸二氢钾溶液(40:65)为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药甘峰计算应不低于 3000。5.3.2 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥器中干燥 36小时的芍药昔对照品适量，精密称定， 加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。5.3.3

18、供试品溶液的制备取本品粉末约0.2g,精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25ml,称定 重量，浸泡4小时，超声处理20分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的 重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。5.3.4 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10gl注入液相色谱仪，测定，即 得。将提取物中芍药昔含量换算成药材中芍药昔含量， 对比药典，检查提取纯化 工艺是否合适。2015版中国药典中规定赤芍药材中含芍药甘(c23h28o11)不得少于1.8%。5.3.5 系统适用性试验线性关系考察吸取上述对照品溶液1.0ml、1.5mk 2.0ml、2.5ml、3.0ml,分别置25ml量瓶内，加

19、甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取 10仙注入液相色谱仪 分析。以进样量(小。为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行线性回 归，结果见表12:表12线性关系考察结果芍药昔对照品(ug)峰面积12精密度试验 精密量取已知浓度的芍药昔对照品溶液10口按液相色谱条件，进样测定6次，结果见表13:表13精密度试验结果峰面积值平均值rsd(%)123456稳定性试验 取本品，制备供试品溶液，测定芍药甘于 0、2、4、6、8、10小时 内峰面积，结果见表14:表14稳定性试验结果时间(小时)峰面积值平均峰面积值rsd(%)0246810重复性试验 取本品，一式6份，制备供试品溶液，测定样品中芍药昔含

20、量，结果见表15:表15重复性试验结果样品量(g)芍药昔含量平均含量rsd(%)123456加样回收率试验 取已知含量芍药甘的本品6份，每份约10mg精密称定，分 别按样品中芍药昔含量精密加入芍药昔对照品，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，精密量取续滤液10此 经hpls析，测定芍药昔含量，计算回收率， 结果见表16:表16加样回收率试验结果取样量(g)样品中芍芍药昔对芍药昔测回收率平均回收rsd(%)药昔量照品加入得量(mg)(%)率(mg)量(mg)5.4 水分按中国药典2015年版四部通则0832的第二法项下操作，取本品粉末约 1g,平铺于恒重的扁形称量瓶中，厚度5mm精密称定，打开瓶

21、盖100105c, 烘5小时，盖好，移至干燥器中冷却 30分钟，精密称定，同样温度下在烘1小 时移至干燥器中冷却30分钟，精密称定。直至连续两次称定重量之差 5mg为 止。按减失重量和称样量计算供试样品中水分含量（ 的见表17。表17水分含量样品编号水分含量/%平均含量/%1235.5 炽灼残渣按中国药典2015年版四部通则0841进行炽灼残渣的检测，取本品粉末 约1g,置已炽灼至恒重的培竭中，精密称定，缓缓织灼至完全炭化，放冷至室 温；力口硫酸0.5ml使湿润，低温加热至硫酸蒸汽除尽后，在 500600c炽灼使 完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500600c炽灼至恒重。表18炽灼残渣样品编号炽灼残渣