14分子标记辅助选择育种

1、第十四章第十四章 分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种 作物育种：创造变异，作物育种：创造变异，选择选择优良变异优良变异 传统育种选择方法：根据植株的传统育种选择方法：根据植株的表现型表现型选择选择 缺点：依靠育种家经验；育种年限长；受环缺点：依靠育种家经验；育种年限长；受环境条件影响大（如抗病、抗虫等）境条件影响大（如抗病、抗虫等） 通过通过与目标性状的基因连锁的与目标性状的基因连锁的、易于识别易于识别的的性状作为性状作为标记标记，对目标性状进行，对目标性状进行间接选择间接选择（相关选择）（相关选择）第一节分子标记辅助选择的意义第一节分子标记辅助选择的意义 遗传标记：遗传标记：可遗传的、

2、特殊的、易于识别的表现形式可遗传的、特殊的、易于识别的表现形式 遗传标记类型：形态标记、细胞学标记、生化标记、遗传标记类型：形态标记、细胞学标记、生化标记、分子标记分子标记 分子标记：分子标记：直接反应基因组间直接反应基因组间dna差异的遗传标记差异的遗传标记 分子标记辅助选择：分子标记辅助选择：通过与目标性状的基因紧密连锁通过与目标性状的基因紧密连锁的分子标记来判断控制目标性状的基因是否存在的分子标记来判断控制目标性状的基因是否存在 优点：优点：不需要考虑作物生长条件和环境条件；减少基不需要考虑作物生长条件和环境条件；减少基因互作干扰；快速垒集目标基因，加快育种进程；减因互作干扰；快速垒集目

3、标基因，加快育种进程；减少群体种植规模等少群体种植规模等简称简称rflp标记标记第二节分子标记的类型及原理第二节分子标记的类型及原理一、分子标记的类型一、分子标记的类型1、以、以dna-dna杂交为基础的杂交为基础的dna标记技术标记技术（in situ hybridization）限制性片段长度多态性标记限制性片段长度多态性标记（restriction fragment length polymorphisms）可变数目串联重复序列标记可变数目串联重复序列标记（variable number of tandem repeats）简称简称vntr标记标记原位杂交原位杂交简称简称ish2、基于、

4、基于pcr的的dna标记标记1）单引物）单引物pcr标记标记2）双引物选择性扩增的）双引物选择性扩增的pcr标记标记3）通过克隆、测序来构建特殊双引物的）通过克隆、测序来构建特殊双引物的pcr标记。标记。 限制性酶切片段的选择性扩增限制性酶切片段的选择性扩增3、基于、基于pcr与限制性内切酶技术相结合的与限制性内切酶技术相结合的dna标记标记分为两类分为两类pcr扩增片段的限制性酶切扩增片段的限制性酶切如如aflp如如capssingle nucleotide polymorphism，4、基于单核苷多态性的、基于单核苷多态性的dna标记标记单核苷酸多态性单核苷酸多态性简称简称snp用限制性内

5、切酶酶切不同个体的基因组用限制性内切酶酶切不同个体的基因组dna后，含后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。二、主要分子标记二、主要分子标记1、rflp（restriction fragment length po1ymorpams）限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性1980，bostein碱基替换、插入、缺失或重碱基替换、插入、缺失或重复造成某种限制性内切酶复造成某种限制性内切酶（restriction enzymes ）酶切）酶切位点的增加或丧失以及内切位点的增加或丧失以及内切酶酶切位点间酶酶切位点间dna片段变化片段变化基因组基因

6、组dna序列上的变化序列上的变化（1）rflp标记的原理标记的原理（2）rflp标记的分析步骤标记的分析步骤（3）rflp标记的特点标记的特点优点优点数目几乎无限数目几乎无限共显性共显性可以利用现有探针，具有可以利用现有探针，具有种族特异性种族特异性rflp标记标记遍及全基因组遍及全基因组重复性好重复性好缺点缺点成本较高成本较高;需要需要许多克隆探针许多克隆探针；一个探针只能产生一个探针只能产生一个多态位点一个多态位点；所需所需dna量大量大(515g)；易造成环境污染易造成环境污染随机排列的寡聚脱氧随机排列的寡聚脱氧核苷酸核苷酸单链引物（单链引物（ 10个核苷酸）。个核苷酸）。通过通过pcr

7、扩增染色体组扩增染色体组dna所获得的长度不同的多所获得的长度不同的多态性态性dna片段。片段。2、rapd（random amplification polymorphism dna）随机扩增多态性随机扩增多态性dna1990,williams特异性取决于引物与模板特异性取决于引物与模板dna结合的特异性。结合的特异性。pcr，聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）mullis等等(1985)pcr反应：变性、复性、延伸。反应：变性、复性、延伸。rapd与经典的与经典的pcr反应的区别反应的区别引物引物反应条件反应条件扩增产物扩增产物（2）rapd

8、标记的特点标记的特点优点优点1）可检测未知序列的基因组）可检测未知序列的基因组dna2）引物无种族特异性）引物无种族特异性3）rapd技术简单技术简单4）单个引物可产生几个多态位点）单个引物可产生几个多态位点5）通过克隆测序可转化成）通过克隆测序可转化成scarscar（sequence characterized amplification region）特异序列扩增区域标记特异序列扩增区域标记缺点缺点1）再现性差）再现性差2）显性遗传）显性遗传3）存在共迁移问题）存在共迁移问题3、aflp（amplified fragment length polymorphisms）扩增片段长度多态性扩

9、增片段长度多态性1993， zabeau marc和和vos pieter是对限制性酶切片段的选择性扩增是对限制性酶切片段的选择性扩增（1）aflp标记的原理标记的原理基因组的基因组的dna进行双酶切进行双酶切人工接头连接人工接头连接pcr反应的引物反应的引物凝胶电泳凝胶电泳aflp扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组扩增数量由酶切频率较低的限制酶在基因组中的酶切位点数量决定。中的酶切位点数量决定。 限制性酶限制性酶酶切频率较高的限制性酶（酶切频率较高的限制性酶（frequent cutter），），酶切频率较低的限制性酶（酶切频率较低的限制性酶（rare cutter）产生产生易于扩增易于

10、扩增基因组基因组dna限制限制扩增模板扩增模板dna片段的数量片段的数量3）选择扩增）选择扩增aflp分析的基本步骤分析的基本步骤1）限制性核酸酶双酶切基因组）限制性核酸酶双酶切基因组dna2）dna片段两端连接上特定的接头片段两端连接上特定的接头(oligonucleotide adapters)6） 自显影自显影4）聚丙烯酰胺凝胶电泳）聚丙烯酰胺凝胶电泳5）凝胶转移，干胶处理）凝胶转移，干胶处理荧光标记、荧光标记、银染银染（2）aflp标记的特点标记的特点优点优点 1）数目和种类很多数目和种类很多 2）一次）一次pcr反应可反应可检测多个遗传位点检测多个遗传位点3）aflp分析分析模板用量

11、少模板用量少4）分辨率高分辨率高5）假阳性低假阳性低，可靠性高可靠性高6）aflp标记多数为标记多数为显性显性缺点缺点分析成本高分析成本高dna的纯度及内切酶质量要求也比较高的纯度及内切酶质量要求也比较高甲基化敏感酶易产生假假阳性甲基化敏感酶易产生假假阳性(variable number tandem repeat)4、ssr（simple sequence repeat）1987，nakamura生物基因组内有一种短的生物基因组内有一种短的重复次数不同重复次数不同的核心序列的核心序列可变数目串联重复序列可变数目串联重复序列简称简称vntr小卫星（小卫星（minisatellites）微卫星（

12、微卫星（microsatellites）简单重复序列简单重复序列，又称，又称微卫星微卫星dna一类由一类由16个碱基组成的基序（个碱基组成的基序（motif）串联重复而成）串联重复而成的的dna序列序列如（如（ca）n、（、（at）n、（、（cc）n、（、（gata）nn代表重复次数，其大小在代表重复次数，其大小在1060之间之间微卫星微卫星dna两端的序列是相对保守的单拷贝序列两端的序列是相对保守的单拷贝序列（1）ssr标记的原理标记的原理根据微卫星根据微卫星dna两端的单拷贝序列设计一对特异引两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用物，利用pcr技术，扩增每个位点的微卫星技术，扩增每个位点的

13、微卫星dna序列，序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。通过电泳分析核心序列的长度多态性。2）检测一个单一的多等位基因位点。）检测一个单一的多等位基因位点。（2）ssr标记的特点标记的特点1）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高）数量几乎无限，检测出多态性的频率极高3）多数为共显性标记）多数为共显性标记使用使用ssr技术的前提是需要知道重复序列两翼技术的前提是需要知道重复序列两翼的的dna序列。序列。4）重复性高，稳定可靠）重复性高，稳定可靠5）需）需dna样品量少，对样品量少，对dna质量要求亦不苛刻质量要求亦不苛刻引 物 设 计 采 用引 物 设 计 采 用 2 4 个 核 苷 酸 序

14、列 为个 核 苷 酸 序 列 为 基 序基 序（motifs），以其不同重复次数再加上几个非），以其不同重复次数再加上几个非重复的重复的锚定碱基锚定碱基inter-simple sequence repeat polymorphic dnaissr标记标记相邻相邻ssr区域内的引物去扩增中间的单拷贝序列区域内的引物去扩增中间的单拷贝序列共显性遗传共显性遗传5、scar（sequence characterized amplification region）特异序列扩增区域标记特异序列扩增区域标记一般步骤一般步骤rapd分析分析克隆片段两端测序克隆片段两端测序设计长为设计长为1824bp的引物的

15、引物pcr扩增检测扩增检测高的重复高的重复性性优点优点6、caps（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged site）切割扩增多态序列标签位点技术切割扩增多态序列标签位点技术又称又称pcr-rflp基本步骤基本步骤特定引物特定引物pcr扩增扩增pcr扩增产物限制性内切酶酶切扩增产物限制性内切酶酶切酶切产物凝胶电泳检测酶切产物凝胶电泳检测caps标记的优点标记的优点引物与限制酶组合非常多引物与限制酶组合非常多 caps标记呈共显性标记呈共显性所需所需dna量极少量极少结果稳定可靠结果稳定可靠操作简便、快捷操作简便、快捷指基因组中长度为

16、指基因组中长度为200500bp，且核苷酸顺序已知，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，可采用的单拷贝序列，可采用pcr技术将其专一扩增出来。技术将其专一扩增出来。7、sts（sequence-tagged sites）序列标签位点序列标签位点简称简称序标位序标位yac或或cosmid插入末端序列插入末端序列引物来源引物来源rflp单拷贝的探针序列单拷贝的探针序列微卫星序列微卫星序列表达基因序列表达基因序列很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介。 8、表达序列标签表达序列标签（

17、expressed sequence tags ，ests ）表达基因的部分序列表达基因的部分序列共显性遗传共显性遗传突出优点突出优点扩增基因开发阅读框（扩增基因开发阅读框（open reading frames, orfs）。）。引物引物17-18个碱基，包括个碱基，包括13-14个碱基的核心区域（个碱基的核心区域（5的的10-11个碱基为填充区，随后正向为个碱基为填充区，随后正向为ccgg，反向为，反向为aatt），核），核心区域后为心区域后为3个选择碱基。个选择碱基。9、srap（sequence-related amplified polymorphism）相关序列扩增多态性相关序列扩

18、增多态性srap的特点的特点优点优点1）每一反应可得大量多态位点）每一反应可得大量多态位点2）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；）不需克隆任何序列，引物可用于不同生物；3）便利、简单；）便利、简单；4）重复性好；）重复性好；5）pcr产物可直接测序。产物可直接测序。基因组中每隔基因组中每隔1000个碱基就存在一单碱基差异。个碱基就存在一单碱基差异。一般通过对一般通过对pcr产物、基产物、基因组文库、表达序列标签因组文库、表达序列标签（est）文库测序而获得）文库测序而获得10、snp（simple nucleotide polymorphisms）单核苷酸多态性单核苷酸多态性等位基因遗传密

19、码的单碱基差异。等位基因遗传密码的单碱基差异。特点：数量大特点：数量大a chromosome map of tomato第三节第三节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选重要农艺性状基因连锁标记的筛选一、遗传图谱的构建一、遗传图谱的构建1、作图群体的建立、作图群体的建立（1）亲本的选配）亲本的选配亲本选择的原则亲本选择的原则亲本间的亲本间的dna多态性丰富；多态性丰富；亲本纯度高；亲本纯度高；杂交后代可育。杂交后代可育。（2）群体的类型）群体的类型f1p1p2f2f2群体群体bc1群体群体ril群体是杂交后代经过多代群体是杂交后代经过多代自交而产生的一种作图群体，自交而产生的一种作图群体，通常从通

20、常从f2代开始，采用单粒的代开始，采用单粒的方法建立。常自交方法建立。常自交6-7代。代。重组近交系群体重组近交系群体（recombinant inbred lines ，ril ）dh群体群体单倍体经过染色体加倍形成的二倍体单倍体经过染色体加倍形成的二倍体一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差一组遗传背景相同或相近，只在个别区段存在差异的株系异的株系近等基因系群体近等基因系群体（near-isogeneic linesnil）拟测交（拟测交（pseudo-testcross）群体）群体复合杂交群体（复合杂交群体（ cp群体）群体）（3）群体的大小）群体的大小构建分子标记骨架连锁图可用小群

21、体构建分子标记骨架连锁图可用小群体150单株或家系。单株或家系。连锁图谱构建的理论是染色体的交换和重组。连锁图谱构建的理论是染色体的交换和重组。aabbabababababababba重组率可用来表示遗传图距，重组率可用来表示遗传图距，重组型配子的最大比例为重组型配子的最大比例为50% ，变化，变化0-50%。图距单位用厘摩（图距单位用厘摩（centi-mergan, cm） 表示，表示，1cm的大小大致符合的大小大致符合1%的重组率。的重组率。2、图谱构建的理论基础、图谱构建的理论基础两位点存在连锁两位点存在连锁(r0.5)的概率与不连锁的概率的概率与不连锁的概率(r=0.5)比比 为确定两

22、位点之间存在连锁，一般要求似然比大于为确定两位点之间存在连锁，一般要求似然比大于1000，即，即lod3；而否定连锁的存在，则要求似然比小于；而否定连锁的存在，则要求似然比小于100，即，即lod2。图谱制作的统计学原理图谱制作的统计学原理两点测验两点测验l(r)/ l(0.5)概率之比可用似然比统计量来表示概率之比可用似然比统计量来表示似然函数似然函数l()多点测验多点测验检测作图群体的个体（株系）的分子标记基因型检测作图群体的个体（株系）的分子标记基因型p1 p2 f11 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 b h

23、a a h h a h b a a h h h a b h a b a h h1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 123、标记基因型检测、标记基因型检测4、图谱构建软件、图谱构建软件利用利用dna标记数据，通过作图软件构建连锁图谱。标记数据，通过作图软件构建连锁图谱。mapmker/exe3.0map manger qtx20joinmap陆地棉（渝棉陆地棉（渝棉1号号t586）f2:7群体群体1、质量性状的基因定位、质量性状的基因定位二、二、 基因定位基因定位（1）近等基因系分析）近等基因系分析 （2）分离群体分组混合分析）分离群体分组混合分析 1 11170 12135 131

24、480 14215 15710 cms育性恢复基因的分子标记育性恢复基因的分子标记控制数量性状的基因控制数量性状的基因051015202530142.0 142.0 145.0 148.0 151.0 154.0 157.0 160.0 163.0 169.0height (mm)frequency2、 数量性状的基因定位数量性状的基因定位数量性状的基因座数量性状的基因座（quantitative trait loci , qtl ）检验同一标记不同基因型间数量性状均值的差异检验同一标记不同基因型间数量性状均值的差异（1） qtl定位方法定位方法1）基于标记的分析方法）基于标记的分析方法均值差

25、检测法均值差检测法若差异显著，则表明标记与若差异显著，则表明标记与qtl连锁。连锁。bnl1453/200y0.0muss099/210t6.3bnl3650/360t(c6)13.0t1(c6)20.2bnl4108/170t(c6)21.6nau0874/180t22.5muss122/200t23.2muss501/230t25.9nau1218/150t(c6)32.7tmb1369/210y43.5bnl2578/200y55.2jespr252/100t59.1nau0938/400y63.7nau1151/210t(c6,c12)68.7tmb0853/250t85.4bnl25

26、69/170y(c6)89.3cir203/220t(c6)91.5tmb0154/290t(c6)93.2tmb1538/200t96.204lint05lint05hlint04length05length05hlength04uniformity05uniformity05huniformity04strength05strength05insectchr6陆地棉（渝棉陆地棉（渝棉1号号t586）f2:7群体群体qtl定位定位2）基于性状的分析方法）基于性状的分析方法分离群体分群分析法分离群体分群分析法选择性基因型分析法选择性基因型分析法3、qtl定位软件定位软件mapmaker/qtl

27、1.0map manager qtxqtl cartographermapqtlwindows cartographer4、qtl精细定位精细定位1）单个）单个qtl的精细定位的精细定位连续用连续用渝棉渝棉1号号回交回交分子标记辅助选择分子标记辅助选择渝棉渝棉1号号t586t586渝棉渝棉1号号群体大于群体大于1000可靠性取决于标记与目标基因的连锁程度。可靠性取决于标记与目标基因的连锁程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。率。第四节第四节

28、 分子标记辅助选择（分子标记辅助选择（mas）育种）育种一、分子标记辅助选择的遗传基础一、分子标记辅助选择的遗传基础1、前景选择、前景选择对目标基因的选择称为前景选择对目标基因的选择称为前景选择(foreground selection)hospital & charcosset (1997)提出提出供体受体 rr rr rr (1-r)2r(1-r) rmrmrmrmr目标基因与目标基因与dna标记间的遗传距离位标记间的遗传距离位p亲本中亲本中dna标记的带型标记的带型f 杂种中杂种中dna标记的带型标记的带型在在f 分离群体中分子标记类型分离群体中分子标记类型即即mm,mm,mmm

29、m类型的分子标记所代表的目标基类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率因型及其频率利利用用mas的的遗遗传传基基础础（以（以rflp为为例）例） m抗性标记抗性标记 r抗性基因抗性基因m感病标记感病标记 r感病基因感病基因 选择的正确率随重组率的增加而迅速下降。重组值越小，其错选率越低。 如果要求至少选到一株目标基因型的概率为p，则必须选择具有标记基因型mm的植株至少为： nlog（1-p）/log（1-p） 式中p（1r）2 对基因组中其他部分（即遗传背景）对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为背景选择（选择，称为背景选择（background selections）。背景选择的对象几乎

30、包）。背景选择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵涉到括了整个基因组，因此，这里牵涉到一个全基因组选择的问题，在分离群一个全基因组选择的问题，在分离群体中，由于在上一代形成配子时同源体中，由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换，因此每条染染色体之间会发生交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装色体都可能是由双亲染色体重新组装的杂合体。的杂合体。 2、背景选择、背景选择二、分子标记辅助选择的优越性二、分子标记辅助选择的优越性1.1.克服性状表现型鉴定的困难克服性状表现型鉴定的困难2.2.允许早期选择允许早期选择3.3.控制单一性状的多个（等位）基因的利控制单一性状的多个（等位

31、）基因的利用用4.4.允许同时选择多个性状允许同时选择多个性状5.5.可进行性状非破坏性评价和选择可进行性状非破坏性评价和选择6.6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种效率高育种效率三三. 分子标记辅助选择应具备的主要条件分子标记辅助选择应具备的主要条件 a：与目标基因紧密连锁的分子标记与目标基因紧密连锁的分子标记 b: 简便快捷的标记检测方法简便快捷的标记检测方法how to use a genetic marker for marker-assisted selectionweaver carrier sire+ww+m1m2m1m2m3m3w=we

32、aver +=normal 目标基因的标记筛选（目标基因的标记筛选（gene tagging）是）是进行分子标记辅助选择（进行分子标记辅助选择（mas）育种的基）育种的基础。用于础。用于masmas育种的分子标记须具备三个育种的分子标记须具备三个条件：条件：分子标记与目标基因紧密连锁分子标记与目标基因紧密连锁标记实用性强，重复性好，而且能够经标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。济简便地检测大量个体。不同遗传背景选择有效。不同遗传背景选择有效。作物作物masmas育种须具备的条件育种须具备的条件 u分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cm,最好1

33、cm或更小。u具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用pcr技术。u筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。u具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。四、四、masmas育种方法育种方法（一）回交育种（一）回交育种（二）（二）sls-mas（三）（三）mas聚合育种聚合育种受体亲本受体亲本 供体亲本供体亲本a(无优质基因无优质基因) (含优质基因含优质基因a)受体亲本受体亲本 供体亲本供体亲本b(无优质基因无优质基因) (含优质基因含优质基因b) f1(含优质基因含优质基因a) f1(含优质基因含优质基因b)复杂杂种复杂杂种(分离群体分离群

34、体)受体亲本受体亲本 供体亲本供体亲本c(无优质基因无优质基因) (含优质基因含优质基因c)中选杂种个体中选杂种个体 f1 (含优质基因含优质基因a和和b) (含优质基因含优质基因c)复杂杂种复杂杂种(分离群体分离群体)中选杂种个体中选杂种个体 受体亲本受体亲本(含优质基因含优质基因a、b和和c) 新育成的优质品种新育成的优质品种 (受体亲本遗传背景受体亲本遗传背景+优质基因优质基因a、b和和c)回交回交12代，标记辅助选择代，标记辅助选择自交自交标记辅助选择标记辅助选择标记辅助选择标记辅助选择五、提高分子标记的筛选效率（一）多重（一）多重pcrpcr方法方法（二）用相斥相分子标记进行育种选择（二