实验第4 细菌分离培养

1、（一）实验目的（一）实验目的（二）实验原理（二）实验原理（三）实验器材（三）实验器材（四）实验方法（四）实验方法（五）实验作业（五）实验作业1.1.了解细菌分离和纯化的原理了解细菌分离和纯化的原理 2.2.掌握倒平板的方法和几种常用的分离掌握倒平板的方法和几种常用的分离培养的基本操作技术。培养的基本操作技术。3.3.掌握细菌的无菌操作技术掌握细菌的无菌操作技术4.4.掌握细菌在培养基上的生长表现。掌握细菌在培养基上的生长表现。v细菌动物体内呈混杂状态存在，必须从中进行分离。细菌动物体内呈混杂状态存在，必须从中进行分离。v分离纯化即将待分离样品进行稀释，并使细菌尽量分离纯化即将待分离样品进行稀释

2、，并使细菌尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。v接种即将一种细菌移接到另一灭菌培养基上的过程。接种即将一种细菌移接到另一灭菌培养基上的过程。v从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物生物的过程称为微生物分离分离与与纯化纯化。v平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化，即选择平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化，即选择适合于待分离细菌的生长条件，如营养成分、酸碱度、适合于待分离细菌的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求温度和氧等要求, ,或加入某种抑制剂造成只利于该

3、细或加入某种抑制剂造成只利于该细菌生长，而抑制其他细菌生长的环境，从而淘汰一些菌生长，而抑制其他细菌生长的环境，从而淘汰一些不需要的细菌。不需要的细菌。n微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可获取单个菌落的方法可通过通过稀释涂布平板稀释涂布平板或或平板划线平板划线等技术完成。等技术完成。n将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称

4、之为基上的操作技术称之为接种接种。接种的关键是。接种的关键是要严格要严格的进行无菌操作。的进行无菌操作。n细菌的培养特性包括细菌的生长条件和生长表现，细菌的培养特性包括细菌的生长条件和生长表现，单个细菌或单种细菌在固体培养基表面生长繁殖，单个细菌或单种细菌在固体培养基表面生长繁殖，形成肉眼可见的菌落，各种细菌所形成的菌落特征形成肉眼可见的菌落，各种细菌所形成的菌落特征是不同的，按照各种细菌所形成的菌落特征，可以是不同的，按照各种细菌所形成的菌落特征，可以在鉴别细菌中作为依据。在鉴别细菌中作为依据。 牛肉膏蛋白胨培养基、接种环、酒精牛肉膏蛋白胨培养基、接种环、酒精灯、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、接

5、种灯、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、接种环、无菌培养皿、涂布器、恒温培养箱环、无菌培养皿、涂布器、恒温培养箱等。等。 倒平板划线培养挑单菌落接种移植保存 1. 1.倒平板倒平板 右手持盛培养基的三角瓶置火焰右手持盛培养基的三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然拨出，试管或瓶口保持对着火焰；然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒人培养基约打开一缝，迅速倒人培养基约1515mlml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌匀分布在培养

6、皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。面上，待凝后即为平板。 2 2. .平板划线分离平板划线分离 最常用的平板接种法是划线法。先将最常用的平板接种法是划线法。先将接种环用火焰灭菌，待冷却后挑取检查接种环用火焰灭菌，待冷却后挑取检查材料，涂于平板的上端，随即向下连续材料，涂于平板的上端，随即向下连续平行划线至平板的底部，划线时接种环平行划线至平板的底部，划线时接种环与平板表面所成的角度要小，以免划破与平板表面所成的角度要小，以免划破琼脂。划线要密而不重复，充分利用平琼脂。划线要密而不重复，充分利用平板的表面。划线完毕，先盖好平板，再板的表面。划线完毕，先盖好平板，再将接种环上残留的细菌用火

7、焰灭菌。将接种环上残留的细菌用火焰灭菌。平板划线分离培养结果3.3.斜面接种法斜面接种法v斜面培养基不易污染，常用于培养纯种细菌。也斜面培养基不易污染，常用于培养纯种细菌。也采用划线接种法。右手持接种环，先将接种环灭采用划线接种法。右手持接种环，先将接种环灭菌，待冷后挑取平板上孤立菌落的细菌。菌，待冷后挑取平板上孤立菌落的细菌。v将平板放回原处后，用左手取斜面培养基，用右将平板放回原处后，用左手取斜面培养基，用右手小指和手掌拔去试管棉塞，将试管口通过火焰手小指和手掌拔去试管棉塞，将试管口通过火焰略微加热灭菌，再将接种环插入试管略微加热灭菌，再将接种环插入试管( (勿触碰管勿触碰管壁壁) )，从

8、斜面底部向上连续平行划线。划线完毕，从斜面底部向上连续平行划线。划线完毕，再将试管口通过一下火焰，棉塞灭菌后，塞好，再将试管口通过一下火焰，棉塞灭菌后，塞好棉塞，最后将接种环上的残留细菌用火焰灭菌。棉塞，最后将接种环上的残留细菌用火焰灭菌。v所接种的细菌经培养生长为均质的菌苔。此培养所接种的细菌经培养生长为均质的菌苔。此培养物来自孤立菌落，为纯种，可用于该菌的各种生物来自孤立菌落，为纯种，可用于该菌的各种生物学性状检查。物学性状检查。接种环灭菌法接种环灭菌法细菌培养物的取材细菌培养物的取材 双管移植法双管移植法双管移植法双管移植法 4.4.液体接种法液体接种法 多用于增菌液进行增菌培养，也可多

9、用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，用接种环从斜面上沾取少许菌试验，用接种环从斜面上沾取少许菌苔，将接种环在液体内振摇几次即可苔，将接种环在液体内振摇几次即可。 半固体培养基穿刺接种法半固体培养基穿刺接种法 5.5.培养培养 分离好的平板做好标分离好的平板做好标记，记，倒置倒置于于3737温箱温箱培养培养18182424h h 。 接种好的斜面、液体接种好的斜面、液体、半固体培养基做好、半固体培养基做好标记，放标记，放3737温箱培温箱培养养18182424h h 。 6.6.菌落形态菌落形态 首先一般先观察整个平板培养基上的菌首先

10、一般先观察整个平板培养基上的菌落形态及种类，然后再选有代表性的各落形态及种类，然后再选有代表性的各种孤立菌落做如下的详细观察。种孤立菌落做如下的详细观察。 其项目有其项目有大小、形态、隆起、边缘、表大小、形态、隆起、边缘、表面状况、质地、颜色、透明度面状况、质地、颜色、透明度等等。 大小大小：针尖大、粟粒大等：针尖大、粟粒大等 形状形状：点状、圆形、卵圆形、叶状等。：点状、圆形、卵圆形、叶状等。 边缘边缘：整齐、锯齿状、毛发状等。：整齐、锯齿状、毛发状等。 表面表面：光滑、皱纹、湿润、干燥等。：光滑、皱纹、湿润、干燥等。 隆起度隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。：凸起、扁平、中心凹陷等。 结构结构：均质性、颗粒状等。：均质性、颗粒状等。 色调色调：无色、白色、黄色、褐色等。：无色、白色、黄色、褐色等。 透明度透明度：透明、半透明、不透明等。：透明、半透明、不透明等。菌落形态q 观察菌落时，不要将空气中落入培养基观察菌落时，不要将空气中落入培养基而生长的杂菌误认为目的细菌。而生长的杂菌误认为目的细菌。q 杂菌一般生长于划线痕迹外，或为个别杂菌一般生长于划线痕迹外，或为个别