发酵工程 重点

1、微生物工程 微生物工程是研究微生物生长、繁殖及代谢活动、代谢产物合成及其控制规律的科学。营养缺陷型突变株(auxotrophic mutant):指在微生物生长过程中,因产品合成途径中某种酶缺陷,而不能生成终产物,只能生成中间代谢物,必须添加终产物,微生物才能生长的突变株。调节突变株(adjustable mutant):指菌株因受外界条件影响,而产生不受终产物及其结构类似物反馈抑制或阻遏的突变株,此时终产物能够大量积累。种子扩大培养 种子扩大培养是指将保存在沙土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种的过程。

2、静置培养法 又称厌气培养,即将培养基盛于发酵罐中,在接种后,不通空气进行培养;通气培养法 又称好气性发酵,这种发酵在培养过程中必须通入空气,以维持一定的溶氧水平,菌体才能迅速进行生长发酵;培养基 是指供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的、多种营养物质的混合物;前体 在产物的生物合成过程中,被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著变化的物质消毒 用物理或化学的方法杀死物料、容器器皿内外病原微生物的过程,一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢;灭菌(sterilization):用物理或化学的方法杀死物料或设备中所有有生命的有机体的技术或工艺过程;它既能杀死营养细胞又能杀

3、死细菌芽孢。发酵机制：是指微生物通过其代谢活动,利用基质合成人们所需要的产物的内在规律。初级代谢：初级代谢是指微生物合成它们在生长和繁殖过程中所必须的物质(如糖、氨基酸、脂肪、核苷酸及其聚合物)的过程;所合成的物质称为初级代谢产物。次级代谢：次级代谢是指微生物在生长和繁殖过程中合成对微生物的生长、繁殖无关或功能不明确的化合物的过程;这些化合物称为次级代谢产物。发酵动力学:是研究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律的科学最低培养基:即培养基是由单一碳源葡萄糖与无机盐组成,这时葡萄糖在微生物生长代谢过程中既作为生长代谢过程中所需要的能源,又作为构成菌体材料的培养基。完全培养

4、基:即在培养基内不但含有碳源与无机盐,还含有构成菌体所需要材料的培养基。分批培养:在一个密闭系统内一次性投入有限数量营养物进行培养的方法。连续培养:又称连续发酵,是指以一定速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定,使培养物在近似恒定状态下生长的培养方法。呼吸强度:指单位质量干菌体在单位时间内所吸取的氧量,以QO2表示,单位为(mmolO2/g干菌体·h)耗氧速率:指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量,以表示,单位为(mmolO2/L·h)临界氧浓度：各种微生物对培养液中溶氧浓度的最低要求,称为临界氧浓度绝对过滤:是介质之间的空隙小

5、于被滤除的微生物,当空气流过介质后,空气中的微生物被滤除的过滤方法。DE值 葡萄糖值，糖化液中的还原糖含量(以葡萄糖计算)占干物质的百分率称为DE值。Q10随着温度的升高,灭菌反应速度常数增加的倍数大于营养物质分解反应速度常数增加的倍数。Y G表示用于菌体生长的碳源对菌体的得率常数m微生物的碳源维持常数Ym表示碳源对代谢产物的得率常数YATP称作ATP消耗对菌体的得率-耗氧速率QO2-呼吸强度KLa液相体积氧传递系数kd溶氧系数生长比速微生物工程的特征(1) 发酵过程既是复杂的生物化学反应,又与微生物活细胞息息相关(2) 发酵醪包括固相、液相、汽相,还含有活细胞及菌丝体,(3) 微生物工程可分

6、为发酵和提纯两个部分(4) 微生物产物大部分为热敏性物质,因此应避免过热及添加保护剂等。(5) 微生物工程应采取:实验室小型试验中间试验规模大型生产规模的工艺过程。 发酵方法(按不同分类方法分类):按对氧的需要分:厌氧发酵和有氧发酵按培养基物理性状分:液体发酵和固体发酵按微生物生长方式分:分批发酵和连续发酵按培养方式分:表面发酵和深层发酵发酵工艺基本过程发酵原料的预处理 菌种斜面培养 种子扩大培养 微生物发酵和控制 发酵产物的分离提取或菌体利用:菌种保藏的目的保证菌种在长时间尽可能保持原有菌株优良的生产性能、提高菌种的存活率,减少菌种的变异,以及不被杂菌污染以利于生产上长期使用。保藏原理根据菌

7、种的生理、生化特点,人为地创造条件,使菌种的代谢活动处于不活泼状态。防止菌种衰退的措施 提供良好的环境条件,满足微生物生长的需要。 用优良的保藏方法,使微生物长期处于休眠的环境。 定期纯化菌种,保证纯种发酵。菌种复壮的方法纯种分离改变培养条件,以达到复壮的目的。 淘汰已衰退的个体种子扩大培养的任务获得纯而壮的、活力旺盛的、接种量足够的培养物,为每次发酵罐的投料,提供相当数量的代谢旺盛的种子。影响种子质量的主要因素培养基、 种龄与接种量 、温度、 pH值 、通气和搅拌 、泡沫、 染菌的控制、 种子级数的确定培养基的类型和用途(1)按营养物质的来源分(组成培养基) 自然培养基 、合成培养基 、 半

8、合成培养基 (2)按培养基制成的形式分: 固体培养基、半固体培养基 、液体培养基(3)按培养基的主要成分或使用目的分: 基础培养基(MM)、选择性培养基 、鉴别培养基 、完全培养基(CM)(4)按生产工艺要求分(生产培养基): 孢子培养基 、种子培养基 、发酵培养基 培养基的用途筛选菌种、保藏菌种、检验杂菌、培养种子、发酵生产等影响葡萄糖酸解反应速度常数的因素有哪些k为反应速度常数;k= ·cA··k值愈高,表示反应速度愈快。为酸催化剂活性常数;cA为酸的摩尔浓度;为多糖水解常数,以棉花=1为标准;为温度对水解速度的影响常数,由实验测定葡萄糖复合反应的影响因素淀粉

9、浓度 、酸及其浓度、时间葡萄糖的分解反应影响因素反应时间、pH生物合成前体物质的作用1、避免合成途径的反馈抑制作用;2、控制生产菌合成方向,获得较高产率。 促进剂和抑制剂提高产物产量的原因改变了细胞膜的渗透性,增加了氧的传递速度,改变了菌体对氧的有效利用。灭菌方法干热灭菌法、湿热灭菌法、射线灭菌法、化学试剂灭菌法、介质过滤除菌灭菌的要求既要达到灭菌目的,又要使培养基中培养基成分的破坏尽可能减少到最低限度。采用高温快速灭菌的方法,既可达到灭菌的目的,又可减少营养物质的破坏,通常为121,2030min; 加热灭菌Pasteurization的原理根据微生物在温度超过最高温度时,细胞中原生质体和酶

10、的基本成分蛋白质发生不可逆的凝固变性,使微生物在很短时间内死亡这一特性进行的。对数残留定律微生物活菌数的减少速率(或称死亡速率)与任一瞬间残存的菌数成正比反应速度常数k值是判断微生物热死难易程度的指标,k值愈小,越大,微生物越耐热影响培养基灭菌的其他因素培养基成分、培养基pH、培养基颗粒的大小、泡沫分批灭菌与连续灭菌的选用（理解）当培养基中含有较多固体颗粒或较多泡沫时,以分批灭菌较好,因为在这种情况下,连续灭菌不彻底;对于容积小的发酵罐,连续灭菌的优点不明显,采用分批灭菌比较方便;对于大型液体发酵,培养基固体颗粒少,泡沫少时采用连续灭菌较好。糖酵解途径的几个关键调控酶及其调控;1、 己糖激酶与

11、磷酸果糖激酶是别构调控酶,它们受能荷的控制; ATP、柠檬酸、脂肪酸能加强抑制效应,而AMP、ADP、Mg2+或无机磷可消除抑制,增强酶活性;2、 丙酮酸激酶是一个别构调控酶,Mg2+、K+及1,6二磷酸果糖活化此酶,而长链脂肪酸、乙酰CoA和Ala能抑制该酶活性;糖酵解中间产物的不同去路;1、 （有氧）丙酮酸进入线粒体，在TCA循环中脱氢 NADH+H+2、 受乳酸脱氢酶作用，被还原为乳酸;3、 受丙酮酸脱羧酶作用，再在乙醇脱氢酶作用下，生成乙醇;4、 生成乙酰CoA柠檬酸发酵必须具备哪些条件;合成条件:(1)菌体有活性很强的柠檬酸合成酶;(2)有足够的底物来源(要有活性很强的丙酮酸脱羧酶和

12、催化CO2固定的酶)(3)顺乌头酸水合酶阻遏失活或很微弱。柠檬酸积累的生物调节;1、第一个调节位点-磷酸果糖激酶(PFK);2、第二个调节位点-柠檬酸合成酶;3、第三个调节位点-异柠檬酸脱氢酶:4、第四个调节位点-顺乌头酸水合酶: 发酵动力学的研究内容; 菌体生长速率、基质消耗速率和产物生成速率微生物生长的四个阶段;(1) 延滞期 (2) 对数生长期 (3)稳定期 (4)衰亡期好气性发酵对无菌空气的要求; 发酵过程不致于染菌,过滤后空气无菌度达到N=103;空气过滤除菌的类型,介质过滤除菌的机制;介质过滤除菌包括深层过滤和绝对过滤两种。介质过滤除菌的机制：惯性碰撞滞留作用、阻截滞留作用、布朗扩

13、散作用、重力沉降作用、静电吸附作用在五种除菌机制中,当气流速度大于临界速度时,以惯性碰撞滞留作用为主;当气流速度小于临界速度时,以阻截滞留作用、布朗扩散作用、重力沉降作用、静电吸附作用为主。氧的传递途径与传质阻力;1、供氧途径及传质阻力气膜阻力1/k1 气液界面阻力1/k2 液膜阻力1/k3 液流阻力1/k4其中液膜阻力1/k3是限制因素,是供氧方面最主要的阻力2、 耗氧方面的阻力细胞周围液膜阻力1/k5 菌丝丛内的扩散阻力1/k6 细胞膜的阻力1/k7 细胞内反应阻力1/k8其中菌丝丛内的扩散阻力1/k6与细胞膜的阻力1/k7影响显著,是耗氧方面最主要的阻力易溶气体H很小,KGkG,说明主要

14、传质阻力是气膜阻力,因此属于气膜控制,如二氧化碳溶于水;难溶气体H很大,KL kL,说明主要传质阻力是液膜阻力,因此属于液膜控制,如氧气溶于水;影响氧传递速率的主要因素;主要有溶氧系数KLa值和推动力c*cL。搅拌转速、叶径对溶氧和混合程度的影响;d增大,n减小, Q搅增大, H搅减小,对液体混合有利,对溶氧不利;d减小,n增大, Q搅减小, H搅增大,对液体混合不利,对溶氧有利;空气流量小时,采用小叶径,高转速较好;空气流量大时，采用大叶径,低转速较好;空气流量大,动力又充足，采用小叶径,高转速较好影响发酵温度的因素;生物热、搅拌热 、蒸发热 、辐射热泡沫形成的必要条件;1)气液两相共存;

15、(2)有表面张力大的物质存在机械消泡的机理;利用机械强烈的振动、压力的变化,促使气泡破裂,或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。补料的原则及依据;原则:控制微生物的中间代谢,使之向着有利于产物积累的方向发展; 依据:根据培养基中碳源种类、氮源种类、用量和消耗速度,镜检菌的形态和发酵液的pH值来决定补料的多少和时间,少量多次补料。染菌原因分析染菌的主要原因:种子带菌,培养基或设备灭菌不彻底,空气过滤除菌不彻底而带菌 ,设备渗漏,中间补料染菌,接种操作不当、取样操作问题等;噬菌体感染后挽救的措施抗性菌株法、并罐法、轮换菌种法、罐内灭噬菌体法、化学药物抑制法发酵必须具备的条件(问答）(1)需进行

16、发酵原料(培养基组成)的选择及预处理(2)要有某种适宜的微生物,需进行微生物菌种的选育及扩大培养。 (3)要有进行微生物发酵的设备。(4)要有保证或控制微生物进行代谢的各种条件(包括温度、溶氧浓度及适宜酸碱度)。(5)要有将菌体或代谢产物提取出来,精制成产品的方法和设备。(6)需进行发酵废物的回收和利用。宏观分类（问答）(1) 以微生物菌体细胞为产物的发酵工业(2) 以微生物酶(含蛋白质)为产品的发酵工业(3) 以微生物代谢产物(含初级代谢和次级代谢产物)为产品的发酵工业 (4) 利用微生物酶修饰作用的微生物转化发酵工业(5) 微生物废水处理和其它(清洁工程)发酵工业对菌种有何要求（问答）1、

17、菌种能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和大量合成目的产物;2、菌种能在要求不高、易控制的培养条件下迅速生长和发酵,以缩短发酵周期;3、根据代谢调控要求,选择高产的野生菌株、营养缺陷型突变株或调节突变株4、菌株抗噬菌体能力强,以防止感染噬菌体而造成“倒灌”现象的发生。5、菌种纯,不易变异退化,以保证发酵生产和产品质量的稳定性。6、菌种不是病原菌,不产生任何有害的生物活性物质和毒素,以保证产品的安全。发酵工业对种子的要求（问答）(1)个体与群体生理性状稳定;(2)活力强,移种至发酵罐后,能够迅速生长;(3)无杂菌污染;(4)目的产物产量高。发酵培养基的选择要求（问答）1、必须提供合成微生物细胞和发

18、酵产物所需要的基本成分:营养应适当丰富和完整,菌体生长迅速且健壮;2、必须提高单位营养物质合成代谢产物的数量:在整个代谢过程中,pH应适当而稳定,糖、氮代谢能符合高单位罐批的要求,能充分发挥生产菌种合成代谢产物的能力。3、必须有利于提高产物的合成速度,缩短发酵周期。4、必须尽量减少副产物和三废物质的形成,便于产品的分离纯化。5、原料价格便宜,质量稳定,取材容易。6、原料应尽可能减少对通气搅拌的影响,以利于提高氧的利用率,降低能量损耗。促进剂和抑制剂的作用（问答）(1)起生长因子的作用; (2)推迟菌体的自溶;(3)抑制了合成某些其他产物的途径而使向所需产物的途径转化;(4)降低了产生菌的呼吸,

19、使之有利于合成;(5)改变发酵液的物理性质,改善了通气效果;(6)与产物形成复盐,降低了发酵液中产物浓度,避免了反馈抑制,有利于促进产物合成。发酵过程特点(问答);(1)发酵过程是微生物复杂群体的生命活动。(2)发酵反应体系中有细胞的生长,基质的消耗和产物的生成,它们有各自的最佳反应条件;(3)发酵反应有多种代谢途径;(4)微生物反应过程中,细胞形态、组成要经历生长、繁殖、维持、死亡等若干阶段,不同菌龄的细胞有不同的活性; (5)发酵体系是多相体系,包括气相、液相和固相;(6)发酵体系是多组分的:培养基中有多种营养成分,多种代谢产物,细胞内也具有不同生理功能的大、中、小分子化合物;(7)发酵过

20、程中细胞代谢是非线性的,其过程用非线性方程(Monod方程)描述;空气净化流程选择的依据及要求？(问答);依据:必须提高过滤除菌效率;净化要求:1、减少进口空气的含菌数;2、设计和安装合理的空气过滤器,选用除菌效率高的过滤介质;3、降低进入空气过滤器的空气相对湿度,保证介质在干燥状态下工作,提高过滤除菌效率搅拌提高溶氧系数的原因是什么？(问答)A、搅拌使液体作涡流运动,延长了气泡运动路线;能把大的空气气泡打成微小气泡,既增加了气液接触面积,又使气泡上升速度慢,延长了接触时间;B、搅拌使菌体分散,避免结团,有利于固液传递中接触面积的增加;使发酵液作湍流流动,从而减少气泡周围和菌体表面的液膜厚度,

21、减少液膜阻力,增大KLa 值,有利于氧的传递;温度对微生物生长和发酵过程的影响(问答); 1、 温度影响微生物体内各种酶催化反应的速度和蛋白质的性质,因此温度不但决定其是否生长发育,而且决定微生物生长发育旺盛与否;各种微生物各有其生长发育所需的温度。2、 温度影响菌体生长速度:一方面,在其最适温度范围内,生长代谢随温度升高加快,产物生成量增加;另一方面,温度过高,菌体易于衰老,产物生成量减少;故温度不宜太高,需要有一个最适温度1、 温度通过影响发酵液中溶解氧浓度和发酵液粘度,从而影响基质的分解和吸收速率, 影响生物合成方向,不同温度可生成不同的产物2、同一菌种生长和积累代谢产物的最适温度往往也

22、不同。pH对菌生长和产物生成的影响(问答)。(1)不同种类的微生物对pH的要求不同(2)控制pH值不但可以保证微生物良好的生长,而且可以防止杂菌的污染。(3)同一种微生物,由于pH值不同,可能生成不同的发酵产物,而且pH对发酵液或代谢产物产生影响,会影响产物的稳定性。(4)发酵过程中, pH值过高、过低都会影响微生物的生长繁殖以及代谢产物的积累,而且微生物生长的最适pH值和发酵的最适pH值不一定相同;如何防止杂菌污染？(问答)1、 杜绝种子染菌。最后一级种子培养好以后必须先冷冻保压,取样做纯种试验,确证种子无杂菌污染,才能向发酵培养基中接种。2、消灭设备和管道死角。发酵罐每使用一次要彻底洗刷一

23、次,消除死角;3、防止设备渗漏:设备应经常检查、更新4、培养基和设备灭菌必须彻底:5、加强空气净化,防止空气带菌:(1)减少进口空气的含菌数;(2)加强对空气的除油、除水,提高介质过滤效率;(3)合理设计空气过滤器如何防止噬菌体污染？(问答)1、加强生产环境净化2、严禁活菌体排放3、认真进行种子罐、发酵罐及管道的灭菌,经常进行设备检查,严防感染噬菌体;4、无菌室应尽量减少与外界接触,加强无菌室消毒和安全卫生;5、加强空气净化系统的管理,防止噬菌体从空气中进入;6、准备不同类型菌株,以便轮换使用;7、筛选抗噬菌体菌株,并经常检查抗性,防止再度感染噬菌体;8、用药物使噬菌体失活,但不影响生产菌生长

24、及发酵;阐述柠檬酸发酵的代谢调控机制; (问答)培养基中的葡萄糖类物质进入细胞质以后,经糖酵解途径生成丙酮酸,其中1,6二磷酸果糖激酶是调控酶; 丙酮酸进入线粒体氧化脱羧生成乙酰CoA,部分羧化生成草酰乙酸,二者缩合生成柠檬酸,进入TCA循环;线粒体内顺乌头酸水合酶受柠檬酸诱导,一部分柠檬酸生成异柠檬酸,另一部分柠檬酸经细胞质(细胞质内顺乌头酸水合酶阻遏,柠檬酸不能分解)到达细胞外;线粒体内对NADP+专一的异柠檬酸脱氢酶受柠檬酸抑制后异柠檬酸不能分解而进入细胞质内,对NAD+专一的异柠檬酸脱氢酶受柠檬酸激活,催化异柠檬酸水解生成 -酮戊二酸, -酮戊二酸进入线粒体,经TCA循环生成草酰乙酸,

25、提供柠檬酸合成的原料来源;谷氨酸族氨基酸生物合成途径及其发酵机制;1、EMP途径和HMP途径与谷氨酸发酵的关系:EMP途径和HMP途径为谷氨酸合成提供原料草酰乙酸和乙酰CoA 。2、TCA、DCA循环、CO2固定与谷氨酸发酵的关系TCA循环:TCA循环中酮戊二酸脱氢酶的欠缺,使TCA循环阻塞,酮戊二酸积累,在NH4+作用下,受谷氨酸脱氢酶作用发生氨基还原化生成谷氨酸。DCA循环：一方面,生物素欠缺,异柠檬酸分解酶丧失,使DCA循环关闭,不能提供原料,因此生物素不可缺少;另一方面,生物素浓度过高,异柠檬酸分解酶活性增强,使DCA循环增强,不利于谷氨酸的积累,因此生物素浓度不宜过高;再次控制生物素

26、适量,可使菌体细胞拉长,提高了细胞膜的通透性,减少了反馈抑制,有利于谷氨酸积累。CO2固定:为谷氨酸的合成提供原料。草酰乙酸的补充是通过CO2固定反应完成的。3、 NH3的导入氧由于能和NADPH+H+反应生成水,从而抑制酮戊二酸生成谷氨酸,而NH4+能够与酮戊二酸反应,故可激活生成谷氨酸。4、细胞膜通透性控制(1)控制生物素的添加量(2)添加饱和脂肪酸(3)添加表面活性剂(4)添加青霉素5、菌种选育模型(1)选育生物素缺陷型菌株2)选育油酸缺陷型菌株(3)选育甘油缺陷型菌株(4)选育温度敏感突变株(5)其他突变株1、 控制旁路代谢2、降低反馈作用物的浓度3、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用4、

27、控制细胞渗透性5、促进ATP的积累以利于氨基酸的生物合成嘌呤核苷酸及嘧啶核苷酸全合成途径中的关键酶及其调控;嘌呤：A、 第一个关键酶:磷酸核糖焦磷酸(PRPP)转酰胺酶,催化磷酸核糖焦磷酸生成5-磷酸核糖胺;抑制剂:a.GMP、GDP、 GTP、IMP等6羟基嘌呤核苷酸类物质; b.AMP、ADP、ATP等6氨基嘌呤核苷酸类物质;B、第二个关键酶: IMP脱氢酶受GMP反馈抑制和阻遏,受A、G抑制; GMP还原酶受ATP反馈抑制,但ATP可作为XMP GMP反应的供能体; SAMP合成酶受AMP反馈抑制和阻遏,受A、G抑制; AMP脱氨酶受GTP抑制,但GTP可作为SAMP AMP反应的供能体

28、;C、组氨酸抑制ATPPRATP 1-(5'-磷酸核糖基)-三磷酸腺苷,从而阻碍AICAR( 5-氨基-4-氨甲酰咪唑核甘酸)的生成;D、细胞膜透性调节嘧啶：第一个关键酶:氨基甲酰磷酸合成酶,受UMP 、UDP、UTP反馈抑制,受精氨酸和尿嘧啶的反馈阻遏,鸟氨酸的激活,IMP、XMP、GMP等对该酶有促进作用; 第二个关键酶:天冬氨酸转氨甲酰酶,受CTP、 UMP、UDP、UTP抑制,ATP 、dATP激活; 第三个关键酶:胞苷酸合成酶,受CTP反馈抑制;空气过滤器的设计;分析如何利用谷氨酸棒状杆菌通过发酵过程代谢调控，实现赖氨酸的积累 (问答)从发酵动力学角度解释微生物发酵碳元素平衡(问答);湿热灭菌方法的计算厌氧发酵制作酸奶时,德氏乳杆菌的比生长速率为0.5 h-1,种子液中德氏乳杆菌含量80亿个/毫升,接种量为10%,试求该酸奶发酵完成时(菌含量80亿个/毫升)所需的时间。发酵罐通气速率的计算。微生