天然脑活素促细胞增殖及抗细胞衰老作用探究

1、天然脑活素促细胞增殖及抗细胞衰老作用作者：李映红 吴正治 吴伟康 李明张晓丽 陈茵杨敏【摘要】目的：探讨天然脑活素对人胚肺二倍体成纤维细 胞(mrc-5 )增殖能力和复制性衰老的影响及其机理。方法： 光镜下观察mrc-5细胞衰老表型，常规计数细胞代龄、传 代速度，mtt法检测细胞增殖活度，xgal染色法观察细 胞衰老情况，计数衰老细胞百分率。结果：天然脑活素可 维持细胞的非衰老表型，增加mrc-5细胞代龄，天然脑活素孵育mrc-5细胞的细胞增殖能力较空白老龄对照组明 显升高(p < 0.05),细胞的增殖速度显著加快。另外，天然脑活素连续培养的细胞在老龄阶段衰老细胞数显著低于 老龄对照细

2、胞(p < 0.01 )0结论：天然脑活素可升高 mrc-5细胞增殖能力，有效延缓细胞的复制性衰老。【关键词】天然脑活素；人胚肺成纤维细胞；增殖活度； 复制性衰老；延缓(abstract) objective to explore the effects of natural cerebrolysin on cell proliferation activity and replicativesenescenee of human embryonic lung diploid fibroblasts (mrc-5 cells) and its mechanism methods to o

3、bserve the cha nges of sen escent phe no type by light microscope, count the passage ages and velocity, detect the potential of cell proliferation by mtt the changes of cells senescenee of natural cerebrolysineffected mrc-5 cells were studied by x-gal staining method, and the positivecell rates of s

4、enescence cells were detected and an alyzed results natural cerebrolysinmaintainedunaltered cell morphology and in creased life span of mrc-5 by at least 18-21 passages comparing withthe control senium cells, the proliferation potential of mrc-5 cells incubated with natural cerebrolysin was in creas

5、ed obviously (p &lt; 0.05), and the passage velocity was enhanced double of that of the controlsenium cells (p &lt; 0.01). in addition, the positive cell rate of senescenee cells was significantly lower in late passage cells in sequeneed multigeneration culture in natural cerebrolysin than t

6、hose of control senium cells (p &lt; 0.01), and similar to those of young cells con elusion as a result, we con eluded that natural cerebrolysin could no tably promote the proliferation activity of mrc-5 cells and delay the cells replicative senescenee efficiently.(key wordsnatural cerebrolysin;

7、 human embryonic lung diploid fibroblasts; proliferation activity; delay;replicative senescence衰老(senescence )是细胞的重要生命现象之一，绝大多 数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，当其经过一定的倍 增之后，将进入终末增殖状态，称为细胞衰老。一般来讲， 人类胚胎的成纤维细胞在达到衰老时，能够复制50代左右 (population doublings, pds ),由于这种衰老是由分裂传代 而达到的，故又称之为复制性衰老(replicative senescence ) 1o探讨细胞衰老的

8、分子机理是人类认识自我研究的重要组 成部分，从分子水平研究衰老过程中基因及调控变化，已成 为目前衰老机理研究的主要方向，同时研究开发延缓衰老的 药物将为提高人类生存质量提供重要保证，也为衰老相关疾 病的防治提供理论基础和实验依据。天然脑活素为结合临床经验和现代药效学正交实验优化 筛选而成，本研究在以往基础上以人胚肺二倍体成纤维细胞(mrc-5 )为研究对象，观察了天然脑活素对mrc-5细胞表型、细胞代龄、传代速度、细胞生长增殖能力及衰老相关 指标的影响，旨在探讨其延缓mrc-5细胞复制性衰老的作 用及其机理。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株与动物mrc-5细胞是人胚肺成纤维细胞， 由美国

9、atcc细胞库提供（atcc no: ccl-171 ）,并规定 28代及以下为年轻细胞,50代及以上为老年细胞，采用含 10%胎牛血清（fbs ）的emem培养液培养。新西兰家兔，雄性，体重（1.5±0.2 ） kg ,购自广东省医学实验动物中心，经1周的适应性饲养之后进行实验。1.1.2药品及试剂 研究用药天然脑活素由深圳市中西医 结合临床研究所进行生药鉴定并由西安杨森制药厂制备成 临床安全级粉剂，纯度为98%o胎牛血清、emem培养基购自美国gibco公司。mtt购 自sigma公司。半乳糖昔酶细胞化学染色试剂盒购自美 国kpl公司。其他试剂均为国产分析纯级。1.1.3主要仪器

10、bio-rad 680型酶联免疫检测仪 (usa ), leica dm16000b 型图象分析系统(germany ),sanyo mccm5ac型二氧化碳培养箱（japan 1.2方法1.2.1实验分组 共分5组，年轻对照组；空白老龄对照 组；天然脑活素低剂量组；天然脑活素中剂量组；天然脑活 素高剂量组，年轻对照组和空白老龄对照组以含10%正常 空白血清的emem培养，天然脑活素低、中、高剂量组分 别以含2.5%, 5%. 10%天然脑活素含药血清的emem培养液培养，血清含量不足10%的用正常空白血清补充。1.2.2实验含药血清的制备含药血清的制备：将雄性新西兰家兔随机分为天然脑活素灌胃

11、组、空白对照灌胃组，每组6只，根据成人治疗量换算为家兔用量灌胃。每个家兔每天灌药量相当于上述配成的成药液2-3 ml o连续灌胃1个月，末次给药后2h内后行颈动脉采血，离心分离血清，无 菌过滤，56°c灭活补体，即为含药血清，10 ml分装后709保存备用。正常对照空白血清的制取是在灌胃相同体积的生理盐水及相同的时间后，用同样方式提取分离保存。1.2.3细胞培养人胚肺二倍体成纤维细胞mrc-5采用加入双抗的含10%胎牛血清（fbs ）的emem培养液培 养，在饱和湿度、37°c、5% co2常规培养条件下培养， 当细胞融合度约90%时，按照1:3或1:4传代。1.2.4细胞

12、计数和细胞形态学检查从第30代起，天然脑 活素低、中、高剂量组、及空白老龄对照组细胞分别以含2.5%、5%、10%天然脑活素含药血清及10%正常空白血 清emem培养液代替含10% fbs的emem培养液继续培养传代。光镜下跟踪观察细胞形态大小、胞浆折光性、 浆内颗粒大小和密度以及细胞排列情况。细胞总传代次数按zlog 2 （ d/do/r ）计算，d、do分 别为收获和接种时的细胞密度，r为细胞贴壁率；细胞平 均传代速度按公式（传代次数28 ） /周数计算，细胞传代后如3周内不能融合，定义为细胞复制性衰老终末。1.2.5细胞增殖活度的检测mtt法测定将第52代mrc-5细胞以每孔1.0x10

13、4/ml的密度接种于96孔板, 200 l/孔，常规培养20 h ,待细胞贴壁后，更换不同含药血清培养液200 l/孔，分别于培养48 h后，加入0.5%mtt溶液50 l ,置37°c , 5 % co2条件下4 h ,出现 蓝色结晶后，弃上清，pbs洗1-2次，加入dmso 150 l /孔，室温轻柔震摇2-3 min以充分溶解结晶，用酶标仪于 490 nm 测 a ( od )值。1.2.6衰老细胞数的检测 将各组mrc-5细胞接种于盖 玻片上，经干预处理后，pbs洗1次，用40 g/l多聚醛固定细胞45 min ,用x半乳糖昔酶（x-gal ）染液（含20mmol/l x-g

14、al 40 mmol/l 醋酸磷酸钠(ph 6.0 5 mmol/l铁氧化钾、5 mmol/l亚铁亀化钾、150 mmol/l氯化钠、2 mmol/l氯化镁）,37°c保温48 h ,然后用双蒸水冲洗2 次，再固定4 min （固定液：体积分数为70%乙醇、福尔 马林、冰醋酸按20:2:1比例混合），流水轻轻冲洗，梯度乙 醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。细胞胞浆染成青绿色 的为衰老的阳性细胞，每张片子镜下计数400个细胞，确 定x-gal染色阳性衰老细胞数的百分比。1.3统计学处理实验结果以数据和图表表示，测定值以均数士标准差（x±s ） 表示，采用spss 8.0软件包

15、分析，两组比较采用student t检验，多组间均数比较用单因素方差分析，以p &lt; 0.0 5 为存在统计学显著性差异。2结果2.1天然脑活素对细胞表型的影响由图1可见，年轻组细胞呈梭性或长梭形，核仁清晰， 胞浆折光性强，细胞融合速度快，细胞排列整齐有序；复制 性衰老细胞形态变异，胞体扁平宽大不规则，核仁不明显， 细胞排列凌乱无序，胞浆内颗粒累积，出现空泡，细胞融合 速度减慢；天然脑活素处理组细胞老龄化程度不明显，细胞 形态变化不大，而与年轻细胞相似。将已经出现衰老表型的 老龄细胞转入含天然脑活素的emem中继续培养24-72 h,细胞的衰老表型出现一定程度的改善，但未见完全逆转

16、。2.2天然脑活素对mrc-5细胞代龄和传代速度的影响含天然脑活素血清的培养基连续培养mrc-5细胞，与用 含同体积空白对照血清的培养基培养的mrc-5细胞进行 对比，结果发现天然脑活素低、中、高剂量组细胞的代龄显 著高于空白老龄对照组细胞。天然脑活素培养的细胞传代速 度亦明显快于老龄对照细胞（见表1 l2.3天然脑活素对细胞增殖活度（mtt值）的影响分别用空白对照血清和天然脑活素血清培养第50代mrc-5细胞48 h后，应用mtt法检测细胞的增殖能力。 结果发现天然脑活素培养的细胞增殖活度明显高于空白老 龄对照组细胞(p &lt; 0.05 ),且随浓度增加而升高；与年轻 细胞无显著

17、性差异(p &gt; 0.05 ) o提示，天然脑活素可 促进mrc-5细胞的生长增殖(见表2 l2.4天然脑活素对mrc-5细胞衰老细胞数目的影响天然脑活素作用于衰老成纤维细胞一定时间，固定后用x-gal染色检测其p-半乳糖昔酶活性。sa-p-半乳糖昔酶染色阳性细胞的胞浆染为青绿色，空白老龄对照组细胞sa-3-半乳糖昔酶染色阳性细胞数远远高于年轻组细胞，而天然脑活素处理细胞组阳性细胞数较空白老龄对照组显著 降低(p&it; 0.01 )见表2。提示，天然脑活素可下调mrc-5 细胞sa-p-半乳糖昔酶的表达，抑制细胞衰老，延长细胞寿4 口卩o3讨论绝大多数正常人类细胞在体外组

18、织培养的序列传代过程 中，逐渐丧失其增殖传代的能力，最终达到一种不可逆的增 殖停滞状态，并可保持代谢活力的稳定，能够维持数月甚至 数年。这种似乎是无限期的增殖停滞状态被命名为衰老 (senescence ),而细胞达到衰老状态时的传代次数称为寿 限1 , 20衰老是由细胞所经历的传代次数决定的，而与时 间无关。体外细胞的衰老与体内组织的衰老有直接的相关性3,4人二倍体成纤维细胞(human diploid fibroblasts, hdfs )一般没有端粒酶活性，所以当端粒dna长度丢失达到临界 长度时，染色体变形急剧增加，染色体间发生融合，细胞 不再增殖，从而导致细胞衰老、死亡5,故常常被作

19、为衰老 研究的理想模型。衰老细胞除了不能复制传代之外，还表现 出一系列生理学、形态学和多种分子生物学的改变，如形态 大小不规则，胞浆内颗粒性物质累积，细胞排列散乱，培养基中多见细胞碎片，细胞失去融合能力、缝隙连接减少等6-8 o笔者以在体外只能进行有限次数分裂的人胚肺成纤维细 胞（mrc-5 ）制备复制性衰老细胞模型，研究天然脑活素延 缓衰老的作用及机理。实验发现，天然脑活素培养的细胞在 老年阶段未见上述衰老表型，将已出现衰老样改变的细胞转 入天然脑活素培养基中继续培养，细胞的衰老表型出现一定 程度的改善，但尚未见完全逆转，上述结果提示：天然脑活 素能够维持mrc-5的非衰老表型。细胞寿命常以

20、体外培养时细胞传代次数表示。本研究结果 显示，低剂量、中剂量、高剂量天然脑活素的emem培养 的mrc-5细胞平均传代次数，显著高于老龄对照细胞；天 然脑活素培养的mrc-5细胞传代速度也快于老龄对照细 胞。提示天然脑活素可显著增加细胞寿命，其可能促进了细胞的增殖速度，这一结论被mtt实验进一步证实。天然脑活素作用于正常衰老型成纤维细胞，通过测定衰老 细胞的百分比，与老龄对照组细胞相比衰老细胞数目明显减 少，衰老细胞百分比显著降低，提示天然脑活素可延缓衰老 细胞的群体死亡的发生，从而延长细胞的体外寿命。总之，本研究通过对细胞形态学、细胞寿命、细胞增殖活 度、衰老细胞百分比等指标的研究，初步证实

21、天然脑活素可 通过促进细胞增殖速度，进而延缓mrc-5细胞的复制性衰老,为中药延缓衰老开辟了新的研究途径。关于天然脑活素 及衰老主导基因的表达的影响，本室正在进一步研究中。对端粒酶活性、细胞端区缩短速率、基因损伤与修复能力以【参考文献】1 miller ra. the aging immune system: primer and prospectus j seience, 1996, 273:70-742haflick l. the limited in vitro lifetime diploid cell strains j exp cell res, 1965, 37:614-6163 goldstein, s. repicative senescence:the human fibroblast comes of age j science. 1990, 249:1129-11334faragher rg, kipling d. how might