核酸的分离纯化

1、2021-11-161生物化学教研室 刘洁2021-11-162 核酸的分离与纯化2021-11-164v核酸包括核酸包括DNA、RNA，在细胞中都与蛋白质结合而，在细胞中都与蛋白质结合而存在。存在。vDNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体），叶绿体DNA（cpDNA），质粒），质粒DNA。vRNA 主要存在于细胞质中，如主要存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。等。v非细胞形式存在的病毒和噬菌体（或只含非细胞形式存在的病毒和噬菌体（或只含DNA，或，或只含有只含有RNA）。

2、）。2021-11-165v 分离纯化核酸总的原则分离纯化核酸总的原则 :1、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研、保证一级结构的完整性，完整的一级结构是研究核酸结构和功能的基础；究核酸结构和功能的基础；减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：减少化学、物理、生物因素对核酸的降解：避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏；避免机械剪切力以及高温煮沸；避免机械剪切力以及高温煮沸；抑制抑制DNase或或RNase的活性；的活性；2、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染，保证、排除蛋白质、脂类、糖类等分子的污染，保证核酸样品的纯度。核酸样品的纯度。2021-11-166核酸

3、分离提取的基本步骤核酸分离提取的基本步骤Step 1Step 2Step 3Step 4细胞的破碎：物理方法溶胀和自溶化学方法生物酶降解核酸的纯化核酸的浓缩和沉淀核酸的保存2021-11-167细胞的裂解细胞的裂解v物理法：煮沸、冻融、微波、超声波、匀浆、液物理法：煮沸、冻融、微波、超声波、匀浆、液氮研磨等，这些物理操作可能导致氮研磨等，这些物理操作可能导致DNA链的断裂。链的断裂。v化学法：高盐、表面活性剂化学法：高盐、表面活性剂SDS、热酚法等。、热酚法等。v酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶酶解法：裂解酶、溶菌酶、蛋白酶K等，此方法等，此方法较为温和，可获得大分子量的较为温和，可获得大分子量

4、的DNA。2021-11-168核酸的纯化核酸的纯化v杂质主要包括三部分：蛋白质等大分子污染物；蛋白质等大分子污染物；其它核酸分子；其它核酸分子；分离纯化过程中加入的对后续实验有影分离纯化过程中加入的对后续实验有影响的溶液和试剂。响的溶液和试剂。2021-11-169v分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。分开，同时避免核酸降解。v一般采用方法是：酚一般采用方法是：酚/氯仿抽提。氯仿抽提。 其原理：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质其原理：交替使用酚、氯仿这两种不同的蛋白质变性剂，以增加去除蛋白质的效果。因为酚虽然变性剂，以

5、增加去除蛋白质的效果。因为酚虽然可有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制可有效地变性蛋白质，但它不能完全抑制DNase的活性。氯仿能加速有机相与液相分层。在氯仿的活性。氯仿能加速有机相与液相分层。在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。最后用氯仿抽提是为了去除作过程中产生气泡。最后用氯仿抽提是为了去除核酸溶液中的痕量酚。核酸溶液中的痕量酚。2021-11-1610核酸的沉淀、浓缩核酸的沉淀、浓缩v沉淀是浓缩核酸最常用的方法沉淀是浓缩核酸最常用的方法v优点优点改变核酸的溶解缓冲液种类；改变核酸的溶解缓冲液种类；重新调整核酸的浓度；重

6、新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。去除溶液中某些盐离子与杂质。2021-11-1611沉淀核酸常用的盐和有机溶剂沉淀核酸常用的盐和有机溶剂v盐类：NaAc、 KAc、 NH4AcNaCl 、 KCl、 MgCl2v有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇乙醇、异丙醇、聚乙二醇2021-11-1612核酸的保存核酸的保存vDNA DNA样品溶于样品溶于pH8.0的的TE缓冲液，缓冲液，-20 或或-70保存；保存；vRNA RNA样品溶于三蒸灭菌水中，样品溶于三蒸灭菌水中，-70 保存保存; 长期保存可溶于长期保存可溶于0.1%DEPC水中。水中。*TE缓冲液缓冲液(pH8.0)：Tris-

7、EDTA buffer(100mmol/L Tris-Cl pH8.0,10mmol/L EDTA pH8.0)*DEPC水：水：焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理的水。处理的水。2021-11-1613注意事项注意事项v材料新鲜。尽量简化操作步骤，缩短提取时间，减少有材料新鲜。尽量简化操作步骤，缩短提取时间，减少有害因素对核酸的破坏；害因素对核酸的破坏；v减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸，过碱对磷酸减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸，过碱对磷酸二酯键的破坏，操作多在二酯键的破坏，操作多在pH410条件下进行；条件下进行；v减少物理因素对

8、核酸的降解，主要是机械剪切力和高温。减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力和高温。04的温度环境降低核酸酶的活性与反应速率，减少的温度环境降低核酸酶的活性与反应速率，减少对核酸的生物降解；对核酸的生物降解；v防止核酸的生物降解，主要是指细胞内、外的各种核酸防止核酸的生物降解，主要是指细胞内、外的各种核酸酶。如酶。如DNase需要金属二价离子需要金属二价离子Mg+，Ca+的激活，的激活，使用金属二价离子螯合剂使用金属二价离子螯合剂EDTA柠檬酸盐，基本可以抑柠檬酸盐，基本可以抑制制DNase活性。活性。2021-11-1614核酸的鉴定核酸的鉴定紫外分光光度法紫外分光光度法v原理：核酸分子中

9、的碱基具有共轭双键结构，可原理：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，最大吸收波长为以吸收紫外线，最大吸收波长为260nm，利用这，利用这一特性可定量溶液中的核酸浓度。一特性可定量溶液中的核酸浓度。v结论：结论：1.000A 260nm = 50g/ml ds-DNA1.000A 260nm = 40g/ml ss-RNA1.000A 260nm = 33g/ml ss-DNA2021-11-1615紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤1.吸取一定量的吸取一定量的DNA样品或样品或RNA样品，加水至特定体积后样品，加水至特定体积后（3ml），转入

10、分光光度计的石英比色杯中。），转入分光光度计的石英比色杯中。2.分光光度计先用一定量的水校正零点。分光光度计先用一定量的水校正零点。3.测定待测样品在测定待测样品在260nm和和280nm的吸光度值。的吸光度值。4.计算浓度。计算浓度。 ds-DNA (g/l) = A260核酸稀释倍数核酸稀释倍数50/1000 ss-RNA (g/l) = A260核酸稀释倍数核酸稀释倍数40/10005.分析纯度。分析纯度。2021-11-1616测定结果分析测定结果分析1、测、测DNA：纯的纯的DNA样品样品A260/A280应为应为1.81) A260/A280大于大于1.9时，表明有时，表明有RNA

11、污染。污染。2) 小于小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；时，表明样品中存在蛋白质或酚污染；注：注： 可能可能出现既含蛋白质又含出现既含蛋白质又含RNA的的DNA溶液比溶液比值为值为1.8的情况。的情况。2021-11-16172、测、测RNA：纯的纯的RNA样品其样品其A260A280应介应介于于1.82.0之间之间1）若）若RNA样品样品A260/A280比值太小，说明有蛋比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；白质或酚的污染；2）比值大于）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染；时，可能被异硫氰酸胍等污染；2021-11-1618溴乙锭荧光法溴乙锭荧光法v原理：原理：DNA、RNA在

12、荧光染料溴乙锭在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱嵌入碱基平面之间后，基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，溶液作标准对照，可比较出被测可比较出被测DNA溶液浓度。该法灵敏度可达溶液浓度。该法灵敏度可达15ng，适合低浓度核酸溶液的定量分析。，适合低浓度核酸溶液的定量分析。v注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。2021-11-16191. 溶胀：双蒸水低渗溶胀红细胞及白细

13、胞膜，释溶胀：双蒸水低渗溶胀红细胞及白细胞膜，释放出血红蛋白及细胞核。放出血红蛋白及细胞核。2. 破核膜：破核膜：STE裂解液、裂解液、SDS、蛋白酶、蛋白酶K等破坏等破坏核膜，使蛋白质变性并降解，核蛋白体被破坏。核膜，使蛋白质变性并降解，核蛋白体被破坏。 3. 抽提：酚抽提：酚/氯仿作用使蛋白质与氯仿作用使蛋白质与DNA分离。分离。4. 离心后离心后DNA存在于上层水相中。在高盐环境下，存在于上层水相中。在高盐环境下，用乙醇沉淀收集用乙醇沉淀收集DNA。外周血白细胞外周血白细胞DNA的提取的提取2021-11-1620操作步骤操作步骤 1.取新鲜抗凝血取新鲜抗凝血3ml， 离心离心3000

14、rpm5 min，弃上清，留沉淀。，弃上清，留沉淀。2.加加5倍体积倍体积ddH2O ，充分振荡，室温静置，充分振荡，室温静置5min，离心，离心6000rpm7 min，留，留沉淀。（重复两次）沉淀。（重复两次）3.生理盐水生理盐水3ml，平衡沉淀物，室温静置，平衡沉淀物，室温静置5min，离心，离心6 000rpm7 min，洗涤，洗涤沉淀两次。转移入沉淀两次。转移入1.5ml EP管中。管中。4.加入加入450l STE裂解液裂解液和和50l10%SDS，充分混匀，再加入，充分混匀，再加入10mg/ml蛋白酶蛋白酶K 10l，混匀，混匀，55水浴水浴1h。5.加入加入Tris-饱和酚饱和

15、酚500l，颠倒混匀，颠倒混匀10min。6.离心离心10 000rpm6 min ，转移，转移上层水相上层水相于一新于一新EP管中。管中。 7.加入等体积（加入等体积（1:1）酚和氯仿酚和氯仿各各500 l， 缓慢颠倒混匀缓慢颠倒混匀10min ，离心，离心4 000 rpm5min，取上清。，取上清。8.加入加入1/10体积体积3mol/LNaAc（pH5.2），2-3倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇，充分混匀，充分混匀，DNA呈絮状沉淀呈絮状沉淀。9.离心离心12 000 rpm10 min，弃上清，加，弃上清，加1ml75%乙醇乙醇，振荡，振荡1min洗涤洗涤DNA。10.离心离心12 0

16、00 rpm5 min，弃上清，室温干燥。，弃上清，室温干燥。11.加入加入50l TE缓冲液缓冲液溶解溶解DNA。溶溶胀胀细细胞胞酚酚仿仿抽抽提提乙乙醇醇沉沉淀淀保存保存破核膜破核膜变性蛋白变性蛋白2021-11-1621Water phase (DNA)Water phase(DNA)proteins precipitatechloroform /isoamyl alcohol (lipids)STEP 62021-11-1622核酸的鉴定与分析核酸的鉴定与分析核酸的定性、定量分析1核酸凝胶电泳2核酸杂交技术3多聚酶链反应技术4DNA测序52021-11-1623DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼

17、脂糖凝胶电泳 vDNA分子带负电荷，在电场中受到分子带负电荷，在电场中受到电荷效应电荷效应、分分子筛效应子筛效应向向正极正极移动过程中移动过程中, 因因DNA分子的大小分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异。及构象差别而呈现迁移位置上的差异。v对于线形对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。量的对数值成反比。v电泳时加溴化乙锭（电泳时加溴化乙锭（EB），其与），其与DNA结合形成结合形成一种荧光络合物，在一种荧光络合物，在254365 nm紫外线照射下紫外线照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA。 202

18、1-11-1624v质粒质粒(Plasmid) 是染色体外小型（是染色体外小型（1-200kb1-200kb）的）的共价、闭合、环状的双链共价、闭合、环状的双链DNADNA分子，能自主复分子，能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。制并能稳定遗传的遗传因子。pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)v质粒作为携带外源基因质粒作为携带外源基因在细菌中克隆或表

19、达的在细菌中克隆或表达的重要载体，在基因工程重要载体，在基因工程中具有极其广泛的应用中具有极其广泛的应用价值。价值。2021-11-1625v质粒的提纯方法较多：质粒的提纯方法较多： 碱裂解法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS最常用的提取质粒的方法最常用的提取质粒的方法 煮沸法煮沸法: 沸水煮沸沸水煮沸40秒秒只用于小于只用于小于15kb的小质粒的小质粒DNA制备制备 SDS法：法：10%SDS适用于大于适用于大于15kb的大质粒的大质粒DNA制备制备 试剂盒：简便、快速、抽提效率高试剂盒：简便、快速、抽提效率高2021-11-1626质粒抽提试剂盒质粒抽提试剂盒 v采用了一种新型的

20、离子交换柱。在特定条件下，采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。无需酚氯仿抽提，无需酒精现质粒的快速纯化。无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，沉淀，1212个样品只需不足个样品只需不足3030分钟即可完成。分钟即可完成。2021-11-1627RNA的分离与纯化的分离与纯化vRNA是分子生物学的主要研究对象。其分离纯化是分子生物学的主要研究对象。其分离纯化主要包括总主要包括总RNA与与mRNA的分离与纯化。的分离

21、与纯化。vRNA分离与纯化的关键是：分离与纯化的关键是：防止防止RNase对对 RNA的降解。的降解。去除外源性去除外源性RNase的影响，的影响， 创造一个无创造一个无RNase的环境；的环境；抑制内源性抑制内源性RNase的活性；的活性；18s28s5s、5.8s等等2021-11-1628总总RNA的分离的分离Trizol试剂试剂v Trizol是一种用于细胞或组织总是一种用于细胞或组织总RNA抽提的试剂。抽提的试剂。v Trizol可以保持样品中可以保持样品中RNA的完整性，即可以有效抑制的完整性，即可以有效抑制RNA的的降解。降解。 抽提所得抽提所得RNA无无DNA和蛋白污染。一般所

22、得和蛋白污染。一般所得RNA溶于溶于DEPC水后的水后的A260/280值为值为1.6-1.8。v 抽提两个样品约需一小时。每一百万细胞用抽提两个样品约需一小时。每一百万细胞用Trizol抽提可得抽提可得5-15g RNA；每毫克组织用；每毫克组织用Trizol抽提可得抽提可得1-10g RNA。产。产量因细胞和组织不同而异。量因细胞和组织不同而异。v Trizol抽提所得抽提所得RNA可直接用于可直接用于Northern，点杂交，纯化，点杂交，纯化mRNA，cDNA克隆，克隆，RT-PCR等；也可以用于基因表达芯片分等；也可以用于基因表达芯片分析、高通量测序析、高通量测序(deep sequ

23、encing)等对等对RNA质量要求较高的质量要求较高的情况。情况。2021-11-1629操作步骤操作步骤1. 组织匀浆：先将组织剪切成小块，放入普通玻璃匀浆器内。每50mg-80mg组织加入1ml Trizol，匀浆。对于RNA完整性要求比较高的情况，推荐先液氮冷冻组织块，然后在低温下用研钵研碎组织，随后再加入Trizol进行总RNA抽提。2. 室温放置5分钟，使样品充分裂解。3. 每毫升 Trizol加入0.2ml氯仿，vortex混匀或猛烈晃动15秒，室温放置2-3分钟。4. 12,000g 4离心15分钟，然后吸取含总RNA的上层无色水相至一新的离心管中，每毫升Trizol约可吸取0

24、.5-0.55ml。5. 按每毫升最初的Trizol加入0.5ml异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟。6. 12,000g 4离心10分钟，在管底可见RNA沉淀，弃上清。7. 每毫升最初的Trizol加入1ml 75%乙醇(DEPC水配制)，vortex或颠倒混匀。8. 7,500g 4离心5分钟，弃上清。再用离心机甩一下（5,000rpm, 离心1秒），小心吸尽液体。9. 待RNA略干后，加入20l DEPC水溶解，-70冻存。2021-11-1630基因克隆技术2021-11-1632基本概念v克隆（克隆（clone）：）：来自同一始祖的相同副本或拷来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

25、贝的集合。v克隆化（克隆化（cloning）：）：获取同一拷贝过程。即无获取同一拷贝过程。即无性繁殖。性繁殖。v基因克隆（基因克隆（gene cloning）：）：按照人的意愿，在按照人的意愿，在体外将目的基因和载体体外将目的基因和载体DNA连接成重组连接成重组DNA，然后通过一定的手段倒入宿主细胞，使其在细胞然后通过一定的手段倒入宿主细胞，使其在细胞内复制、扩增，获得该目的基因的大量拷贝。又内复制、扩增，获得该目的基因的大量拷贝。又称为称为DNA克隆、分子克隆。克隆、分子克隆。v基因克隆技术是分子生物学的核心技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术2021-11-1634基本技术路线基本技术路

26、线1. 目的基因的获取目的基因的获取2. 克隆载体的选择与构建克隆载体的选择与构建3. 外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接4. 重组重组DNA导入受体菌导入受体菌5. 重组体的筛选重组体的筛选6. 克隆基因的表达克隆基因的表达2021-11-16352021-11-1636化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因2021-11-1637从基因组从基因组DNA文库获取目的基因文库获取目的基因genomic DNA library简称简称G-文库，指存在于文库，指存在于转化细胞内由克隆转化细胞内由克隆 体所体所携带的所有基因组携带的所有基因组DNA的集合的集合限制性内切酶限制性内切酶基因

27、组DNA基因重组基因重组转化细菌转化细菌体外包装体外包装2021-11-1638从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因v cDNA文库文库（cDNA libraries ） 简称简称c文库，指用细胞文库，指用细胞总总mRNA经逆转录方式经逆转录方式制备全套双链制备全套双链cDNA后，后，建立的基因文库。建立的基因文库。基因重组基因重组反转录酶反转录酶mRNAmRNAcDNAcDNAdsDNAdsDNA2021-11-1639从基因文库钓取目的基因从基因文库钓取目的基因DNA librariesDNA libraries2021-11-1641v 载体（载体（vector）指能携带目的基因

28、进入宿主细胞，并）指能携带目的基因进入宿主细胞，并能进行自我复制的完整能进行自我复制的完整DNA分子。又称克隆载体。其分子。又称克隆载体。其中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。中为表达出蛋白质设计的载体又称表达载体。 质粒质粒DNAv 克隆载体克隆载体 噬菌体噬菌体DNA 病毒病毒DNA 2021-11-1642载体的选择标准：载体的选择标准：v能自主复制；能自主复制；v具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；的筛选和鉴定；v有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；有多个单一酶切位点

29、，称为多克隆位点；v分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。2021-11-1643质粒载体的一般结构质粒载体的一般结构2021-11-1644普通型载体pBR322的结构图pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori(4.36 kb)(4.36 kb)2021-11-1645载体pUC19的结构图pUC192686 bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI (413)BamHI (418)EcoRI (397)HindIII (448)PstI

30、 (440)SmaI (415)XmaI (413)ApaLI (178)ApaLI (1121)ApaLI (2367)2021-11-1646噬菌体（phage）DNAv可通过转染方式将其可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的常用的为人工构建的噬菌噬菌体载体。体载体。v依重组方式不同分为两类：依重组方式不同分为两类： gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列（置换型，系列（置换型，适用基因组克隆）适用基因组克隆）2021-11-1647其他l 柯斯质粒（柯斯质粒（cosmidcosmid）l 酵母人工染色体载

31、体酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome, YACyeast artificial chromosome, YAC）l 细菌人工染色体细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BACbacterial artificial chromosome, BAC）l 动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体改造的载体（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）（如腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒）2021-11-1648酵母人工染色体（YAC）2021-11-1649v限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（Restriction en

32、zymes，RE） 从细菌中分离提纯的核酸内切从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别并切开核酸序列酶，可以识别并切开核酸序列特定位点特定位点分子手术刀分子手术刀vT4 DNAT4 DNA连接酶连接酶(T4 DNA ligase)分子胶水分子胶水2021-11-1650识别位点识别位点5 protruding ends3 protruding endsCohesive/sticky ends5-CCCGGG-33-GGGCCC-55-CCC-OH3-GGG- pp -GGG-3OH-CCC-5+SmaIblunt ends2021-11-1651连接策略连接策略v1. 粘端粘端DNA间的连接间的

33、连接 (1) 同一限制性内切酶切割位点连接同一限制性内切酶切割位点连接 (2) 不同限制性内切酶切割位点连接不同限制性内切酶切割位点连接v2. 平端平端DNA间的连接间的连接v3. 同聚物加尾同聚物加尾连接连接v4. 人工接头人工接头连接连接2021-11-16522021-11-1653宿主菌或受体细胞宿主菌或受体细胞大肠杆菌大肠杆菌 昆虫细胞昆虫细胞感受态细胞感受态细胞（competent cell）方式方式: : 转化转化（transformation）转染（转染（ transfection ）感染（感染（ infection ）酵母酵母哺乳动物细胞哺乳动物细胞2021-11-1654l导入大肠杆菌导入大肠杆菌1. 氯化钙转化法氯化钙转化法2. 电击法电击法3. 体外包装感染体外包装感染法法l导入哺乳动物细胞导入哺乳动物细胞1. 显微注射法显微注射法2. 电穿孔法电穿孔法3. DNA-磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀4. DEAE-葡聚糖转染法葡聚糖转染法5. 病毒感染法病毒感染法6. 脂质体介导法脂质体介导法7. 细胞融合法细胞融合法8. 原生质体融合法原生质体融合法9. 微细胞介导法微细胞介导法2021-11-16