真菌杀灭试验

1、真菌杀灭试验2. 1. 1.9. 1 目的在实验室内测定消毒剂杀灭悬液中或载体上真菌繁殖体或真菌抱子所需 剂量，以验证对真菌及其抱子实用消毒剂量。2. 1. 1.9.2试验器材(1) 麦芽浸膏琼脂(MEA :见附录儿(2) 沙堡琼脂培养基：见附录Ao(3) 试验菌及其菌悬液或菌片的制备白色念珠菌ATCC 10231和黑曲霉菌ATCC 1 6404或抱子悬液与菌片按2. 1. 1.9.3 (1)和 2. 1. 1. 9. 3 (2)所示方法制备。此外，根据消毒剂特定用途和特殊需要，可选用其它真菌或抱 子悬液与菌片。(4) 中和剂(根据2. 1. 1.5所示方法鉴定合格者)。(5) 磷酸盐缓冲液(

2、PBS, 0. 03 mol/L , pH7.2)。(6) 消毒剂稀释用硬水:见附录Ao(7) 有机干扰物质：见附录A。(8) 刻度吸管(0. 1ml、1 . 0ml、5. 0ml)。(9) 恒温水浴箱。(10) 喷雾装置(用于喷雾消毒试验)。(11 )电动混合器。(12)计时装置。2. 1. 1. 9. 3真菌悬液制备（1）白色念珠菌悬液的制备1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.0ml " 10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37C培养18h24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于

3、沙堡琼脂培养基平板上， 于37C培养18h24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于沙堡 琼脂斜面，于37C培养18h24h,即为第3代培养物。将其密封后在4C 保存，时间不得超过6周。2）试验时，取第3代斜面培养物在砂堡琼脂斜面上连续传代，方法与 第3代相同。取第5代或6代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h24h），用5. 0 ml吸管吸取3. 0ml-5. 0ml稀释液加入斜面 试管 内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试 管中，用电动混合器混合20s,或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌 菌悬浮均匀。3）悬液杀菌试验时，实验用菌悬液的含菌量为1007c

4、fu/ml5X 107cfu/ml ；菌片制备按2. 1. 1. 2要求进行。4）菌悬液保存在4C冰箱内备用。当天使用不得过夜。5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。菌落形态可直接用显微镜观察。菌体形态可在涂片后直接用高倍显 微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成 薄膜）后观察。2）黑曲霉ATCC 16404悬液或菌片的制备。1）取冻干菌种管，以无菌操作打开，用毛细管吸取少量麦芽浸膏肉汤 培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。取少许沉淀 物悬液加到含5.0ml麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30C 士 1C培 养42h-48ho用

5、接种环划线接种第1代培养物于MEA培 养基平板，置 30C 士 1C培养箱中培养42h48h。取平板培养物中的典型菌落，接种 于麦芽浸膏营养琼脂斜面培养基，置30C 士 1C培 养箱中培养42h 48h,即为第3代培养物。将其密封后在4C保存，时间不得超过9周。2）试验时，取第3代斜面培养物接种麦芽浸膏琼脂斜面，30C培养48h,取得3. 05. 0ml麦芽浸膏肉汤，洗下斜面上的培养物，接种罗氏 瓶，并摇动使菌液布满MEA培养基表面，然后吸弃多余肉汤培养物液 体，置 30C 士 1C 培养 7d-9do3）向罗氏瓶培养物中加入5.0 ml-10. 0ml 0. 05% （V/V）吐温80生 理

6、 盐水溶液，刮洗黑曲霉分生抱子于溶液中，将砲子悬液移入装有玻 璃 珠的三角瓶中，轻轻振摇lmin后，滤过除去菌丝。滤过后，显微 镜下（400倍）观察是否存在菌丝，若悬液中有菌丝存在，可经5000若悬r/min6000 r/min ,离心20min。再次在显微镜下（400倍）观察, 液中仍有菌丝存在，须再离心。4）黑曲霉分生抱子悬液在2C8C储存不能超过2 d,使用前，混合均匀，在显微镜下（400倍）观察是否有砲子岀芽，若有抱子出芽，则弃 之不用。5）使用时，可用稀释液适当稀释。悬液试验时实验用菌悬液的含菌量 为 1 x 10" cfu/ml 5X 107 cfu/mlo6）制备染菌样

7、片时染菌方法为滴染法，每片加菌悬液10卩lo染菌后，置37C培养箱内干燥（约30min）,或置室温下自然阴干后再使用。7）回收菌数应达5x 10°cfu/片5x 106cfu/片，可依试验要求确定。2. 1. 1.9.4试验分组 试验分为下列各组：（1）试验组，按2.1. 1.7.3规定，选定消毒剂浓度与作用时间，对受试 菌种的杀灭能力进行测定。（2）阳性对照组，以硬水代替消毒剂溶液，按2. 1. 1. 7. 3规定程序进 行试验。所得结果代表试验体系中所含试验菌的初始浓度，并以其计算 消毒因子对试验菌的杀灭对数值。阴性对照组，观察同次试验用相关溶液和培养基有无污染。2. 1. 1.

8、9.5试验程序 常用杀灭试验有：悬液定量杀菌试验、载体浸泡定量杀菌试验、载体 喷雾定量杀菌试验等。培养基对白色念珠菌为沙堡葡萄糖琼脂，对黑曲 霉菌为麦芽浸膏琼脂（MEAo其操作程序详见2. 1.1. 7o活菌培养计数时，对白色念珠菌，在37C培养箱中培养48h观察最 终结 果。对黑曲霉菌，在30C培养箱中培养72h观察最终结果。2. 1. 1.9.6 评价规定(1) 产品监督检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和作用时间，重 复试验3次，对白色念珠菌和黑曲霉菌各次试验的杀灭对数值均> 4.00,要求载体定量杀灭试验，各次试验的杀灭对数值均3. 00 ,可判定该产品对真菌污染物消毒合格。(2) 产品申报卫生许可检验，按产品使用说明书指定的使用浓度和3个 作用时间，重复试验3次，要求悬液定量杀灭试验在产品使用说明书规 定使用浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验 的杀灭对数值均应4. 00，在产品使用说明书规定使用浓度与最低作用 时间的0.5倍时，允许杀灭对数值V 4. 00,可判为实验室试验该产品对真 菌污染物消毒的有效剂量。用载体浸泡定量杀灭试验评价杀菌效果时，在产品使用说明书规定使用 浓度与最短作用时间，以及最短作用时间的1.5倍时，各次试验的