高级微生物期末试题

1、1、 y结合自己的专业，围绕一种微生物资源的开发，设计一种产品，说明理由，产品的技术方案，及质量标准。SFTVS重组活载体疫苗发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是近年在我国新发现的一种布尼亚病毒,病人的主要症状为发热、血小板减少、白细胞减少、消化道症状和多脏器功能损伤。目前已在河南、湖北、山东、江苏、安徽、辽宁等16个省发现发热伴血小板减少综合征(SFTS)病例,病人平均死亡率在10%左右。目前尚没有有效的疫苗可以使用,研制安全有效的预防用疫苗成为了应对SFTS疫情的迫切需要。重组活载体疫苗是利用微生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中，使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫

2、苗。Ø 优点：疫苗多为活疫苗，重组体用量少，抗原不需纯化，载体本身可发挥佐剂效应增强免疫效果一、疫苗制备第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。 第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子转入大肠杆菌中增殖。第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。1）在含有一定浓度抗生素的选择培养基上筛选2）酶切鉴定，3）PCR鉴定，测序分析第五步是目的基因诱导表达6、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及

3、western blot 分析二、质量标准试验1、蛋白浓度的测定（采用BCA蛋白定量试剂盒测定浓度）2、抗原 含量的测定（ELISA）3、无菌检查：判定标准：自接种肉汤培养基之日起观察 14 天，接种样品培养基无杂菌，判定为合格，如有杂菌，复试。复试样品量应加倍。无杂菌生长判为合格。若复试仍有杂菌生长，判为不合格 5宿主细胞细胞 DNA 残留量 6细菌内毒素含量 7 pH 值 8 鉴别试验（采用双抗体夹心酶联免疫法）2.2.14 外观 灯检法。 2.2.15 装量 2.2.17 异常毒性试验 8重组活载体疫苗的免疫效力实验9病毒滴度一）、重组活载体疫苗的小鼠免疫与攻毒保护试验及攻毒剂量试验1、

4、疫苗免疫小鼠2、小鼠体重变化监测3、攻毒保护实验4、攻毒后肺滴度的测定5、免疫小鼠抗体和小鼠细胞因子检测二）疫苗抗原与SFTSV血凝抑制试验血清的特异性反应的检测（ELISA）四）产品抗原性、免疫原性和动物试验保护性的分析5) 动物过敏性试验7、疫苗免疫持续期，和疫苗保存期检测2、 针对你设计的产品，如果要申请知识产权保护其核心竞争力，你认为应该从哪些角度进行申请，主要目的是什么。如何保证你申请的知识产权能够被授权1) 产品发明专利，发热伴血小板出血热疫苗发明，目前尚无发热伴血小板减少综合征疫苗。2) 外观改进，申请外观设计专利3) 可以实验方法的改进上，申请实用新型专利。申请专利目的：

5、60;其一，通过法定程序确定发明创造的权利归属关系，从而有效保护发明创造成果，独占市场，以此换取最大的经济利益，及时申请专利就是要防止其发明创造成果被他人随意使用，丧失其应有的价值。     其二，及时申请专利是为了在市场竞争中争取主动，防止竞争对手将相同的发明创造申请专利，从而确保自身产品生产与销售的安全可靠性。三、多角度申请专利可以增加申请的知识产权被授权的可能性如何保证你申请的知识产权能够被授权二、将帮助专利代理人更好的起草专利文件。可以评价专利申请获得授权的可能性。据国外专利机构调查，有66%以上的发明专利最后不能获得授权，其中绝大多数

6、都是因为存在在先公开的文献，缺乏新颖性而致。二、将帮助专利代理人更好的起草专利文件。通过申请前的初步专利检索，可以获得理解现有技术所需的必要信息，这样可以比较现有技术，描述本申请所具有的有益效果和创造性，以及与现有技术的本质区别。这对于将来的实质审查是非常重要的。三、申请前的初步专利检索将完善申请方案。通过申请前的初步检索，可以获得一些相关的对比文件，其中很有可能包含着可以借鉴之处，这有助于申请人完善技术方案，以更好的提出技术方案，获得最佳的保护效果。四、申请前的初步专利检索能为你节省时间和金钱。通常，从发明专利申请到专利授权或不予授权的时间。如果申请人不在申请专利前进行初步的专利检索，一旦专

7、利没有获得授权或保护范围减少，失去的不仅仅是申请的费用，更重要的是损失了宝贵的时间和精力。通过申请前的初步专利检索，可以获得理解现有技术所需的必要信息，这样可以比较现有技某种化合物或者合成某种化合物的微生物相关基因，清设计两种以上实验方案证明该基因功能，并说明理由Pseudomonas aerugionas ZD4中的邻苯二酚2,3一双加氧酶基因(pheB)的降解芳香烃化合物细菌对苯酚的降解试验1、将五株Pseudomonas aerugionas ZD4中pheB基因通过基因敲除方法去除，和五株正常菌株分别接种在酚浓度为500mg几的酚无机盐培养基中,恒温摇床内30振荡培养,每隔12h取样一

8、次,分别测定降解液中苯酚残留浓度,总有机碳残留浓度以及降解液在600nnl波长下的光密度。理由：几的酚无机盐培养基中接种菌株，如果不含pheB基因的菌株不能降解芳香烃化合物即苯酚浓度和总有机碳残留浓度及600nnl波长下的光密度不变，则证明芳香烃化合物未被降解即Pseudomonas aerugionas ZD4中的邻苯二酚2,3一双加氧酶基因(pheB)降解芳香烃化合物，而含pheB基因的菌株能降解芳香烃化合物即苯酚浓度和总有机碳残留浓度及600nnl波长下的光密度改变，则证明芳香烃化合物被降解即Pseudomonas aerugionas ZD4中的邻苯二酚2,3一双加氧酶基因(pheB)

9、降解芳香烃化合物。2、 克隆邻苯二酚2,3一双加氧酶基因(pheB)部分序列1） Pseudomonas aerugionas ZD4基因组 DNA 的提取2） pheB基因同源克隆简并引物的设计3） pheB基因部分序列4） 从琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段5） 连接体系的建立6） 感受态细胞热击转化7）筛选重组子8）重组子基因降解芳香烃化合物的能力鉴定：9）酶切和PCR鉴定理由：将菌液涂布于几的酚无机盐培养基中，28振荡培养过夜，进行降解试验，培养两天后，培养基的颜色变为白色，则是重组菌株是降解了芳香烃化合物即Pseudomonas aerugionas ZD4中的邻苯二酚2,3一双加氧酶

10、基因(pheB)降解芳香烃化合物。若未变则是芳香烃化合物未被降解，即Pseudomonas aerugionas ZD4中的邻苯二酚2,3一双加氧酶基因(pheB)不能降解芳香烃化合物。3、 如果我们要对实验室分离的一株细菌进行鉴定，应从哪些角度进行阐述，并说明每种方法的优缺点细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4 个水平:细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。细菌常规鉴定法细菌常规鉴定法是细菌形态和生理生化水平及蛋白质水平的鉴定,前者是最经典、最常用的分类鉴定指标,也是现代化分类鉴定的依据,后者包括免疫诊断技术、蛋白质图谱分析和氨基酸序列分析等。

11、一、形态学特征鉴定：（1）细胞形态在显微镜下观察细胞外形大小、形状、排列等，细胞构造，革兰氏染色反应，能否运动、鞭毛着生部位和数目，有无芽孢和荚膜、芽孢的大小和位置，放线菌和真菌的繁殖器官的形状、构造，孢子的数目、形状、大小、颜色和表面特征等。（2）群体形态群体形态通常是指以下情况的特征：在一定的固体培养基上生长的菌落特征，包括外形、大小、光泽、黏稠度、透明度、边缘、隆起情况、正反面颜色、质地、气味、是否分泌水溶性色素等；在一定的斜面培养基上生长的菌苔特征，包括生长程度、形状、边缘、隆起、颜色等；在半固体培养基上经穿刺接种后的生长情况；在液体培养基中生长情况，包括是否产生菌膜，均匀浑浊还是发生

12、沉淀，有无气泡，培养基的颜色等。如是酵母菌，还要注意是成醭状、环状还是岛状2）2、生理生化反应特征 生理生化方法与细菌酶和调节蛋白的本质和活性直接相关，酶和蛋白质都是基因产物，对细菌生理生化特征的比较也是对细菌基因组的间接比较。常用于细菌分类鉴定的生理生化特征有：营养类型、与氧的关系、对温度的适应性、对pH的适应性、对渗透压的适应性、呼吸酶类试验、毒性酶类试验、糖( 醇) 类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验、淀粉水解试验 V-P试验 甲基红（Methyl Red）试验 靛基质（Imdole）试验、硝酸盐（Nitrate）还原试验、明胶（Gelatin）液化试验 、尿素酶

13、（Urease）试验 、氧化酶（Oxidase）试验 、硫化氢（H2S）试验、三糖铁（TSI）琼脂试验、硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验等等。同样，它也存在一些缺点，例如重现率低、某些技术的不定性、低辨识能力以及相似的表型特征并不等同于相似的或者关系密切的基因型。所以对于许多表型特征难以区别的菌种，通过传统分类鉴定方法就无法准确鉴定到菌种，该方法操作较繁琐，实验周期也较长。但是在细菌分类鉴定方法的发展中又是极其重要的。是细菌分类鉴定不可或缺的步骤。蛋白水平鉴定1. 1 免疫诊断技术1. 1. 1 凝集试验。目前常用的是葡萄球菌协同凝集试验(SPA - CoA) ,金黄色葡萄球菌细胞壁的A

14、 蛋白(SPA) 能与动物血清中IgG的Fc 结合,成为致敏的颗粒载体,特异性IgG的Fc 与SPA 结合后, F ( ab) 2 段暴露在葡萄球菌表面,与相应细菌反应呈现凝集现象,此法用于细菌快速鉴定和分型。1. 1. 2 免疫酶技术。是将酶标记的抗抗体与抗原抗体复合物结合形成抗原- 抗体- 酶标记抗抗体复合物,加入酶底物产生有色产物。以酶联免疫吸附测定( ELISA) 和斑点酶联免疫吸附技术(Dot - ELISA) 应用较广泛。1.1. 3 免疫荧光技术。免疫荧光技术( FIA , Fuorescenceimmunoassay) 是将一抗滴加于待检抗原上,再加一抗的荧光抗体(二抗) ,呈

15、现特异性的荧光抗原抗体复合物以鉴定病原菌。此法比ELISA 更直观,可直接观察到菌体形态。1. 1. 4 放射免疫测定技术。放射免疫测定( RIA , Rad2ioimmunoassay) 是用放射性同位素标记抗原或抗体,与相应的抗体或抗原结合后通过放射自显影定性和定量抗原或抗体。1. 1. 5 免疫胶体金标记技术。胶体金是继酶、荧光素和放射同位素后免疫标记技术中令人瞩目的新标记物。胶体金是氯金酸(HAuCl4) 在还原剂如白磷、枸橼酸钠等的作用下,聚合成特定大小的金颗粒,通过静电作用与抗体或应的抗原抗体结合后,呈现特定的颜色反应。1 2 1 2 免疫检测常用标记技术免疫标记技术( immun

16、olabelling technique) 是运用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质( 胶体金、铁蛋白) 作为示踪剂标记抗体或抗原进行的一种抗原抗体反应8。此类方法具有灵敏、特异、快速，能够定性、定量甚至定位测定，结果易于观察、适合自动化检测等很多优点。广泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。免疫诊断技术若无相应抗体则无法鉴定1. 2 蛋白质图谱分析蛋白质图谱分析主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE ,Polyacrylamide Gel Electrophoresis)和SDS - PAGE。聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺(Acr) 和N ,N- 亚甲双丙烯酰胺(Bis) 在

17、催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺(TEMED) 作用下聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链,相邻长链通过甲叉桥连接形成三维网状结构物质,PAGE 根据电荷、形状和分子大小分离和定性、定量分析蛋白质和多肽。SDS - PAGE 根据分子量的不同分离蛋白质,SDS 是一种阴离子表面活性剂,与蛋白质疏水部分结合使蛋白质带大量负电荷且使蛋白质的形状趋向一致,抵消了蛋白质本身所带电荷和形状的影响,因此,样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。4 分子遗传学分类鉴定法4. 1 细菌染色体DNA G+ C mol %含量测定细菌染色体DNA G+ C mol %含量测定对表型相似的疑难菌株鉴定、新的分类

18、单位建立和细菌亲源关系判定等是一项重要的分类鉴定指标和参考标准,包括纸层析法、浮力密度法、高效液相色谱法6 、热变性温度(Tm) 7法和荧光法等。4. 2 核酸杂交技术4. 3 限制性核酸内切酶分析法限制性核酸内切酶分析法(REA ,Restriction Enzyme Analysis) 是用限制性内切酶消化不同细菌染色体DNA 产生不同长度限制性片段的酶切图谱,将图谱与已知菌进行比较鉴定细菌。4. 4 质粒图谱分析法质粒是独立于细菌染色体之外进行复制的辅助性遗传单位,不是细菌生长繁殖所必需的,但质粒可使宿主菌具有某些非染色体决定的生物学性状如耐药性、溶血性、细菌毒力等。质粒图谱分析( PP

19、分析,Plasmid Profile Analysis) 是通过比较电泳图谱上质粒DNA 数目和分子量分析细菌,该法特异性好、分析周期短、稳定可靠,几乎适用于所有细菌的分型,特别适用于尚未建立标准分型方法和缺乏血清型的菌属(种) 的鉴定和分型。4. 5 脉冲场凝胶电泳分析法脉冲场凝胶电泳10(PFGE ,Pulsed - field Gel Electrophoresis) 采用定时改变电场方向的交变电源,每次电流方向改变后持续15 s 再改变电流方向,如此反复循环。PFGE 运用罕见切点的内切酶切割染色体DNA ,产生10800 kb 长的520 条大的DNA 片段。PFGE 是目前分辨力最

20、高的分型方法之一,但技术要求高。4. 6 PCR技术PCR 技术是在模板、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖DNA 聚合酶的酶促反应,包括高温变性、低温复性和中温延伸3 个_阶段,经2530 个循环,原始模板可扩增106 以上。PCR 技术具有高度的特异性和敏感性,是临床微生物检验的理想工具,用于细菌和病毒感染的早期诊断、遗传性疾病的诊断、肿瘤基因分析和法医学诊断等, 现已衍生出多种PCR 技术, 如: 锚定PCR、反向PCR、多重PCR、原位PCR、不对称PCR、重复序列PCR、巢式PCR、反转录PCR、差异显示PCR、免疫PCR、PCR - ELISA、随机扩增DNA 多态性分析(RA

21、PD) 和扩增片段长度多态性(AFLP) 等。RAPD 又称为随机引物PCR 法(AP - PCR) ,可用于未知菌株的快速鉴定和流行病学调查,细菌种间、亚种间乃至株间的亲缘关系分析。AFLP 技术1995 年由Vos 等首次报道,用于各种大小的基因组指纹分析,为研究物种间尤其是原核生物属以下及株间的亲缘关系提供有效手段。4. 7 16SrRNA 序列和16S23SrRNA 间区序列分析法rRNA 是研究细菌进化和亲源关系的重要指标,含量大(约占细菌RNA 总量的80 %) ,素有“细菌化石”之称,是细菌系统分类学最有用和常用的分子钟。原核生物的每种鉴定方法均有其优点和缺陷,常规鉴定法常出现表

22、型表达不稳定、敏感性不高、测试项目多、费时费力等问题;细菌自动化鉴定适于快速鉴定,但目前数据库中模式菌种数量有限,部分细菌只能鉴定至属,对革兰氏阳性菌和厌氧菌的鉴定效果较差;分子遗传学鉴定是从本质上阐明细菌间的亲源关系,但所需试剂和仪器昂贵,鉴定时间较长,专业性强,适于科研上的细菌分类研究,不适于基层和临床微生物的快速鉴定。因此,细菌分类鉴定必须同时使用几种方法或系统全面鉴定,表型鉴定和分子遗传学鉴定结合可对未知菌进行准确合理定位,目前应充分利用和完善现有鉴定技术,继续积累核酸数据库资源,研究和推广新的分子遗传学鉴定法,使其在敏感性、特异性和实用性上更适合细菌快速准确鉴定的需要,使其发挥应有的和更大的作用。随着细菌鉴定方法的不断建立和完善,将为科研和临床工作者提供简便、快速、准确、微量、灵敏和成本低廉的检测方法和更先进、更全面的检测手段。4、 5揭秘1 “水含有抗生素”影响几何？专家称含有极少量抗生素不会产生太大危害我国历来被视为抗生素生产消费大国。据统计，我国每年大约生产1300种化学原料药及化妆品，其中抗生素类药物和个人护理品（PPCPs）年产量在3.3万吨以上，药物产量的70%是抗生素，这个比例在西方国家只有30%。而有报告称我国地表水中含有68种抗生素，另有90种非抗生素类医药成分被检