胰岛临床移植相关问题

1、免疫抑制剂分类1 tacrolimus在低剂量时(0.3mg/kg/day)不対血糖代谢产生明显作用，但高剂量时 (lmg-3mg/kg/day)则明显降低血糖清除率，抑制血糖介导的c肽反应，诱导血糖耐受。并 具有节制激素作用。2 deoxyspergualin(dsg)-脱氧精肌菌素通常用于挽救对皮质激素耐受排斥的病人。没有明显的代谢副作用。dsg对丁减少同利胰 岛移植周围非特异性炎症反应导致的早期无功能冇较好效果。经过一期临床试验，癌症患者 给了 2000r/m2的dsg灌注3小时，具有很小的毒性作川。其上限剂量是2-4mg/kg/day0 对于胰腺功能没有明显副作用。3 sirolimu

2、s(rapamycin, rapamune)-为一种放射菌类产生的大环内脂类抗生索。其副作用 类似钙调磷酸酶抑制剂如：增加血清低密度脂蛋白、胆固醇、和廿油三酣水平，轻度降低血 小板和白细胞。这些副作用可以通过减低剂量、対抗治疗、不连续应用等方法纠正。其与环 抱霉索a联合应卅，毒性人増。低剂量应川对胰岛无明显:毒副作川。总之，尽管存在由于 脂质水平变动导致心血管疾病的风险,但低剂量sirolimus对ptdm和高血压的极小影响是 该药具冇很光明的前景。4 sdz-rad-为sirolimus在40位处挂一拜乙基链形成的衍生物，增加了极性并更容易溶 解。具有较sirolimus更短的半衰期。副作用

3、与sirolimus相似。并且不用象sirolimus那样 给予首次负荷剂量。对于csa tacrolimus联合应用时减少副作用具有很大优点。动物 实验证明其对生长激素、促黄体(生成)激素lh、催乳素、睾酮、皮质激素、血糖、钙没有 明显影响。但当大剂量联合环抱霉索a应用时，可以导致器官出血、关节炎、胰岛细胞退 行性变。5 mycophenolate mofeti(mmf)-在対小型动物实验中存在胃肠道反应，匚i细胞减少，和感 染。但未发现对血糖代谢有何影响。目前，mmf已经成为大多数胰腺移植免疫抑制疗法屮 必要的一员。在胰腺移植过程屮tacrolimus mmf和steroid联合应用可以允

4、许steroid减 量并撤退。6 leflunomide-ft有免疫调节和抗炎性作用。可以阻止肿瘤坏死因子介导的核因子k-b活 性。其结合tacrolimus用于朕岛移植效果很好，未发现对内分泌月夷腺冇何副作用。7 fty720-是一种与myrinocin(从真菌培养过滤物中分离出来的)相关的叫spingosine的合 成结构类似物。与sirolimus或环孑包霉素a有协同作用。未发现对内分泌胰腺有何副作用。8 brequinar-是一种唆嚇竣酸衍生物，在二氧乳清酸脱氢酶水平下抑制啼唏合成。主要毒 副作用是骨髄抑制、体重减轻、胸腺利空肠绒毛萎缩。即使在高剂虽吋，未发现对内分泌胰 腺有何毒副作用

5、。易溶于水溶液，可静脉注射或口服。9坏也霉索a(cyclosporin)-具有致糖床病作川。对移植受体有损害血糖代谢作用。并增 加移植示糖尿病(ptdm)发生率。10 interleukin 2 receptor blockade-baxilixmab and daclizumab是抗白介素2受体的单克隆抗体。与tacrolimus和mmf联合应用效果正在观察中。免疫抑制剂的矛盾作用：csa和tacrolimus对b细胞功能的抑制作用很有意思，因为进行胰腺移卅i的病人通常给予 两种药物屮的一种°csa所诱导的血糖耐受掩盖了其作为免疫抑制剂的优点。目前看来，烟 酰胺，强化胰岛素治疗，及

6、少壽性药物治疗(单克隆抗体和免疫抑制剂)会对人类i型糖丿亲 病有更大的好处。冃前看来，tacrolimus的免疫抑制作用和抗炎性作用较其致糖尿病性作用 为重要。冇证据表明，tacrolimus可成功挽救鳩肾联合移植过程中由于应川csa导致的胰 腺移植物排斥。从长远角度來看，tacrolimus可提高胰腺移植物的存活率。胰腺和胰岛移植免疫抑制剂应用总结:1诊断移植后糖尿病应该准确。应该通过口服gtt逐条对照who标准，系列检测hbalc 以监测顺应性，并预测继发并发症。2 建议疗法：atgam, mmb tacrolimus, and prednisone 联合应用。prednisone 于 3

7、 个月时 开始减量，6个月减完。atgam给5-7天，肓到tacrolimus达到足够水平。tacrolimus水 平头6周应维持在20-25ng/ml, 6周到3个月维持在15-20ng/ml, 36个月10-15ng/mlo 应用两个新的抗白介素2受体的单克隆抗体zenapax and simulect 丁胰岛移植长期效果尚 在观察中。3新的免疫抑制剂如，mmf, dsg, brequinar; leflunomide等需要对具致糖丿永病作川和在胰 腺移植屮的作用进行长期评估。4胰岛移植并不是完全成功，因此并不明确推荐该应用何种免疫抑制剂。冇证据表明，肾 移植后胰岛功能随着激素在早期阶段的

8、撤退而有所改善。对于肾赃和胰岛联合移植，临床前 研究推荐使用抗-cd40l抗体。対于胰岛单独移植，应避免使用激素类药物。5对于器官移植患者减低移植后糖丿亲病应同减低心血管疾病和神经血管疾病一样看作是整 体战略的一部分。除了严格控制移植后糖尿病外，减低其它心血管疾病风险因子如：高血压、 吸烟、异常脂血症、肥胖也非常关键。6建议对于带血管胰腺移植受体按撤药方案于移植后3个月开始逐渐减少给予激素。7免疫抑制剂主要从以下三个方面增加冠脉疾病和中风所导致的死广风险：界常脂血症、 高血压、高血糖。移植后糖尿病已经成为免疫抑制剂的一个主要副作用。8为了最优化纟f1合免疫抑制剂并减少代谢副作用，推荐连续丿应用

9、免疫抑制剂，而tacrolimus 为基础的免疫抑制剂用于跟随csa/sirolimus/sdz-rad z后进行诱导维持作用。应用mmf, sirolimus, sdz-rad, and monoclonal antibody并减少激素用量可以减少ptdm的发生。并 建议具有ptdm或者心血管疾病风险的稳定移植受体应用激素逐渐减量撤退i办议。胰岛冻存目前來看，胰岛用uw或hts（hypothermosol）结合dmso进行冻存，可以在冻存后48小 时复苏培养获得极高的胰岛生存率。现仍以培养基冻存方式详述如下：一、冻存前阶段胰岛分离后，经过在cmrl1066组织培养液中（含10%胎牛血清、25

10、mm hepes、100u/ml 青霉素、100ug/ml链霉素）于22°c中含5% co2条件下培养24小时后，检测数量、纯度和 活性。然后以 10, 000-15, 000ie（0.5ml tissue）溶于 1 ml 22°c的 m199 培养基屮（含 10%胎 牛血清、25mmhepes、100u/ml #霉素、100ug/ml链霉素）。经过轻轻搅动,将胰岛分离 并分装入玻璃冻存管（siliconized kimax 12.5xl50mm）o并逐步或一次加入dmso至终浓度 为 1.5m 或 2.0m。二、逐步冻存当dmso加入到0.67m lhf（即加入2m dm

11、so 0.5ml）,于22°c放置5分钟；当dmso加入 到1.0m时（即再加入2m dmso 0.5ml）,于22°c放置25分钟;当dmso加入到1.5m或2.0m 时（即加入3m dmso 2ml）,于22c放置15分钟。三、一步法冻存先将胰岛于22°c培养30分钟或45分钟，然后一次加入dmso至终浓度为1.5m,对于丽 者述需要将胰岛于22°c培养15分钟，对于后者则直接将其置入4°c冰浴而无须放置平衡。四、冷冻、保存、复苏加入dmso后将各冷冻管直接置入04°c冰浴作用5分钟。然后将各管样品在75°c含95% 酒

12、精的沉降管（seeding bath）中做用5分钟，使过度冷却50-7.5°c,确保所有冻存管降温一 致。然后轻轻晃动以悬浮起在冻存液中的胰岛。为保证所有冻存管得到一致降温，采用核品 形成步骤。即川一内循环有液氮的不锈钢圈（采川fts泵将液氮在具屮循坏，cp-10a-i, fts system inc.z stoneridge, n.y.）接触冻存管的边缘，或者将一从液氮屮取出来的金属杆接触 到各冻存管的外缘的弯月液而部分。使进行人工核晶形成。然后将样品温度回升到-2.5°c（约 dmso的冰点），估计融合的潜在热量已经释放出来，将各冻存管再次放入沉降管中7.5°

13、c保 存，总过程10分锹08ml ）,或者15分钟（4ml窗。当所冇样品冻存后，转移到下图 evacuated freezing dewar屮（见图），它能将样品缓缓以025°c/min的速度冷却到40°c（在 这一过程中要不断搅动混匀乙醇以确保降温一致）。这个glass dewar在大约加入dmso这 步5分钟时放入一个装冇液氮的不锈钢dewar（mve, model g-i, mve cryogenics, new prague, minn）中，以确保乙醇温度降至75°c。然后投入到液氮中保存。在液氮屮保存至少 周后，在37°c水浴中以150

14、6;c/min的速度快速解冻至0°c。缓慢逐步稀释方案：即在解冻的头8分钟内每2分钟加入1ml m199培养基于冻存管屮，然示每2分钟加入2ml m199培养慕，直至试管内体积达到16ml,然后每2分钟加入4mlm199培养基共4次，m 后于26分钟加入8ml,最终冻存管内体积达到40ml,而dmso浓度减小到02m., 修改的缓慢逐步稀释方案：即每5分钟加入2ml m199培养基,共持续到30分钟，而dmso浓度减小到0.5m。六、复苏后胰岛活性检测1、体外实验：通过将复苏后的一定数量的胰岛连续在含有50mg/ml（2.8mmol/l）®萄糖、 500mg/ml（28mm

15、ol/l）葡萄糖、50mg/ml（2.8mmol/l）葡萄糖的培养基屮培养各60分钊x然 后收集检测胰岛素分泌。2、体内实验：复苏后的胰岛行糖丿來病裸鼠肾包囊内移植，观察效果。七、冻存袋冻存方法将所分离出來的胰岛悬于含冇25ml冻存培养基的500ml冻存袋中(cryocyte freezer bags, baxter healthcare corporation, deerfield , il),冻存方法见步骤二、三、w标准蔗糖稀释方案：将冻存袋屮的内容物倒入2个50ml falcon试管中，1500rpm离心，去上清。每个试管加 入5ml 0.75m蔗糖，置于冰上30分钟。然后按照步骤五屮所

16、述方案按比例加入稀释培养基。 修改的缓慢逐步稀释方案：向冻存袋中每5分钟加入50 m199培养棊，共6次。直到dmco浓度降至0.5m。然后将 冻存袋小的内容物倒入2个250ml锥形试管中，1500rpm离心，去上清。然后转入等张培 养基中.cmrl1066o冻存袋上可配冇t型热电偶(cole parmer; niles, il)o第一个热电偶放在冻存袋的上1/3处, 第二个放在中间，第三个放在下1/3处。胰岛临床移植和关问题移植前胰岛培养问题：移机前头24h在37°c中培养，2448h其间在22°c培养，培养用80cm2培养瓶培养，浓 度最人为30000ieq/30ml培

17、养基。如果胰岛纯度>90%,则每瓶最多30000ieq/30ml培养 基。如果纯度<90%,贝懦要的培养瓶数二纯化后的ieq/30000ieqx纯度24小吋后如果胰甜出现聚集则应放丁22°c培养并换液，换液吋倾斜培养瓶至45度，让所 冇胰岛沉淀1分钟，无菌吸出20ml培养基并加入新鲜培养基，璽新在22°c下培养。移植时胰道细胞靠重力进行灌注，并每小时检测血糖。如果餐前血糖&ommol/l;餐后2 小时血糖100mmol/l时应保留胰岛素注射。移植前患者检查：全血细胞计数；临化全项；尿常规；前列腺特杲抗原（men> 40）；乳腺x线（women>

18、; 40）； 腹部超声；hiv ； cmvigg ； eb；核抗原 igg ； varicella-zoster（带状疱疹）igg；梅毒; toxoplasmosis（弓形休病）；淋巴细胞毒性抗体筛选；1空腹血糖;2 hbalc； 3 mage（分别于移植前、中及移植后1个月检测）;4 meal toleranee tests（分别于移植前、中及移植后1周、3, 6, 12, 18个刀检测）；5餐前和餐后90分钟血糖和c肽胰导质量监控：1 islet quantitycounting by size; volume; purity; ie count2 islet histologyhemat

19、oxylin(苏木素)-eosin(胰岛特异染色)aldehyde fuchsin(醛品红)细胞染成粉色；p细胞染成暗紫色immunoperoxidase staining with specific islet cell hormones3 islet vibility-tryphan blue is not very helpfulperifusion test(in vitro)丿ij加血清的含 60mg/dl 葡萄糖的 kreb bicarbonate media 培养 胰岛 40 分钟，然示 300mg/dl glucose 30mins,然示 300mg/dl glucose +1

20、0mm theophylline(茶碱)30mins,最后 60mg/dl glucose 30minsinsulin stimulation index4 islet sterilitysamplesdonor pancreas; reagents; processing steps;preserved isletstestingfiltration culture at 24°c+37°c 7ds to assay the bacteria and fungus术前服用免疫抑制剂、抗生素及保肝药1 sirolimus(rapamune, wyeth-averst can

21、ada)首剂 0.2mg/kg,然后 o.lmg/kg/d 口服并监测血药浓度：前3个月12-15ng/ml；以后7-10ng/ml2 7acrolimus(prograf z fujisawa canada)开始时,lmg bid po. ； 3个月后调整至3-6ng/ml/12hs (imx酶联免疫法abbott)3 daclizumab(zenapax, roche canada)每 lmg/kg/14d lvf 共 5 次如果第二次移植时间距第一次超过15个星期，则重复上述剂量。以上还需要根据肾功、移 植胰岛功能、白体免疫反应实行用药个体化。4术中胰岛一经杭入立即500mg万古酶素(v

22、ancomycin)和500mg亚胺培南(imipenem)静脉滴注5术后口服：vite 800u/d可减轻白细胞内皮细胞作川，抑制巨噬细胞排斥，从而增加移植稳定性vit b6 100mg/dvit a 2500u/d更昔洛i5(gancyclovir) lg/d tid poz共14周冃的是减少移植物丢失、防止淋巴增生紊乱。6 术后吸入：喷他月米(pentamidine) 300mg/month最终胰岛移植悬液溶于m199屮含500u川嗦和20%人血清口蛋口，灌注5min以上当胰岛灌注完毕，将导管部分退出，明胶海绵粒子拴塞到肝内穿刺管道7 pentoxifylline(a酮可可碱)可降低血t

23、nf-a水平,并减少巨噬细胞释放tnf-a,400mgzbidpo8 vit pp(nicotinamidez烟酰胺)可减轻氧化应激和自由基的损害，250mg,tid po9 metformin(二卩双弧)增加外周组织对胰岛索敏感性，恢复由于长期暴露于高自由脂肪酸 或高血糖中导致胰岛功能受损吋胰岛的分泌活性，减少胰岛功能丧失。400mg, bid po移植后监测：1神经系统疾病(neurothesiometer method)；视网膜疾病(检测眼底有无血管出血)；2 24小时尿蛋白、血肌酊、血脂；hbalc； 个刀测一次3 口服糖耐量实验(移植后不用依赖胰岛素后6和12个月，以后1年测一次)；具体用法：先检测空腹血糖基线水平，然后口服75g glucose ,然后分別于30,60,90, 120分钟检测血糖。4以50% dextrose 300mg/kg body wt.静脉注射人于1分钟进行静脉注射糖耐量实验(ivgtt),用以检测移植后1周、3, 6, 12, 18个j的以下各项指标：airg表示在第3、4、5分钟吋间点上基线上方的样品的胰側素平均值；airarg-表示取2、3、4、5分钟时间点中3个最高值的胰岛素平均值；kg是ivgtt法屮1030分钟期间以