02微生物的纯种分离培养

1、微生物学基础实验微生物学基础实验二、实验原理二、实验原理v 在自然界里，微生物的种类繁多，数量很大，几乎都是杂居在一起的。v 微生物群落在土壤的物质转化中具有多种重要作用，它与土壤肥力和植物营养有密切关系，同时又是工业和医药用菌的资源。v 从含有多种微生物的自然材料中，通过稀释分离、划线分离、单细胞分离等方法，使它由单个的个体在固体培养基上繁殖形成单个菌落，由于此菌落是由单个个体繁殖而来的，故可获得纯种。这种获得单个菌株纯培养的过程称为微生物的分离与纯化。 常用的微生物的分离与纯化方法常用的微生物的分离与纯化方法1.简易单细胞挑取法 在不借助显微操作器的情况下，直接在普通 显微镜下利用低倍镜分

2、离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。 2.平板分离法该方法操作简便，应用普遍。其基本原理及特点包括两方面： （1）通过稀释涂布或平板划线等技术能实现单细胞来源的纯培养。 （2）通过控制培养条件实现选择性分离。选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。三、实验用品三、实验用品(一)材料

3、土壤样品、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基、马铃薯培养基、豆芽汁培养基。(二)器材 无菌培养皿、无菌吸管、无菌水、酒精灯、接种环、接种针、火柴等。 四、实验操作四、实验操作1.连续稀释分离法（1）稀释土样稀释土样 称10 g土样，加到有90 ml无菌水和少许玻璃珠的三角烧瓶内，充分振荡，使土样与水充分混合，使微生物充分释放到土壤悬液(原液)中。 用无菌吸管吸取土壤悬液l ml，加到一个盛有9 ml无菌水的试管内，制成稀释度为10-1的土壤悬液，将此吸管在试管内反复吹洗3次，然后取出，通过火焰，再插入纸套内，以备再用。轻轻摇动试管，使菌液均匀。再用刚才用过的吸管，插入试管内，反复吹洗3次，然后

4、取出l ml菌液，加到另一支9 ml无菌水中，制成稀释度为10-2的土壤悬液。 相同操作直到获得lo-4的土壤稀释液。用移液管吸取菌液 （2）接种接种 从稀释液（10-4）各吸取1 ml分别加到2个牛肉膏培养皿，从稀释液（10-3）吸取1 ml分别加到高氏一号、马铃薯、豆芽汁培养皿各2个。（3）倒平板倒平板 将培养基加热融化，待冷至5560时，右手持三角瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞轻轻地拔出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞，左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基与菌液混合并均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上

5、，静置凝固。 倒如下平板：倒如下平板：(1)牛肉膏蛋白胨平板（分离细菌）2个： 加稀释度为10-4的菌液；(2)高氏一号平板（分离放线菌）2个： 加稀释度为10-3的菌液；(3)马铃薯培养基平板（分离霉菌）2个： 加稀释度为10-3的菌液；(4)豆芽汁培养基平板（分离酵母菌）2个： 加稀释度为10-3的菌液；(5)牛肉膏蛋白胨空白平板2个： 备用（细菌的划线分离操作）2.平板划线法纯化菌株 将融化的培养基制成平板，冷凝后，左手持皿底，平板面向上，稍斜，靠近火焰，用接种环取稀释样品一环在平板上划线，划线分离方法如图。 分段划线分段划线连续划线连续划线恒温培养 将分离细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）的培

6、养皿置于（倒置）370c恒温箱中，培养24小时；分离的放线菌（高氏i号培养基）培养皿置于（倒置）280c恒温箱中培养7天；分离的霉菌（马铃薯培养基）培养皿置于（倒置）280c恒温箱中培养4天；分离的酵母菌（豆芽汁培养基）的培养皿置于（倒置）280c恒温箱中培养48小时。 土壤微生物数量推算 土壤中的微生物经稀释倾注培养后，每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可根据平板上菌落的数目推算出每克土壤中所含的活菌总数，计算公式如下： 每克土壤微生物的数量= 本次实验只计牛肉膏蛋白胨平板上的细菌数、高氏一号上的放线菌数。平均菌落数稀释倍数(10/1) 100土壤克数 菌落形态 区分和

7、识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面进行。菌落是由大量微生物细胞集结的宏观形态，每大类的微生物都具有特定的菌落特征，可作为微生物分类研究的初步依据。多种霉菌菌落 菌落形态 多种酵母菌菌落细菌菌落(e.coli) 菌落形态 放线菌菌落（诺氏链霉菌）放线菌菌落(链霉菌)streptomyces coelicolor (天蓝色链霉菌分泌抗菌素)thompson et al. genome biology 2002 一些土壤放线菌菌落 菌落形态 多种细菌菌落 菌落形态的观察描述 从不同平板上选择不同类型的菌落进行肉眼观察，从如下方面进行描述 大小：直径范围 形状：圆形、不

8、规则形、根足形等 颜色：分正面、反面 边缘：整齐、锯齿状、丝网状、放射状等 光泽：润泽或干燥，透明、不透明或半透明 质地：平滑致密或粗糙疏松，与培养基结合紧密度 有无特殊形态如皱襞、旋涡状、荷包蛋状 隆起：程度分扁平、隆起、内陷等菌落形态的描述举例 1圆形，边缘整齐，表面光滑2圆形，边缘整齐，表面有同心圆3圆形，叶状边缘，表面有放射状皱褶4圆形，锯齿状边缘，表面较不光滑5不规则形，波浪状边缘，表面有不规则皱纹6圆形，边缘残缺不全，表面呈颗粒状7毛状8根状菌落形态的描述举例 微生物菌落隆起程度的差异绿脓杆菌pseudomonas aeruginosa植物乳杆菌lactobacillus plantaruman unkown isolate四大类微生物菌落形态的比较 细菌细菌放线菌放线菌霉菌霉菌酵母菌酵母菌相对大小小较小大较小隆起隆起较扁平隆起隆起度较细菌为高光泽多润泽，或干燥无光泽，有皱摺，表面粉状或颗粒状无光泽润泽粘稠，呈奶油状颜色多样，常见白、黄、红常见灰白，色素颜色多样，正反色