丙烯酰胺的代谢机理及体内防护的研究进展

1、环氧丙酰胺的代谢机理及体内防护的研究进展摘 要：丙烯酰胺，是一种潜在的致癌物，自被研究者在高温焙烤食品中发现后，即引起了国内外广泛的重视。而研究进一步表明，其对人体的危害主要是由其代谢产物环氧丙酰胺造成的。因此近年来，科学家开始对环氧丙酰胺的毒性进行评估，并完善了检测方法，对环氧丙酰胺的体内防护也展开了探索。本文综合了近年来对环氧丙酰胺的研究成果，总结了环氧丙酰胺的代谢机理以及分析测定方法；并结合已有的成果，对抑制环氧丙酰胺体内毒性提出了展望。关键词：丙烯酰胺；环氧丙酰胺；形成机理；分析方法；体内防护Abstract：Acrylamide (AA)，a potential carcinogen

2、，received a world-wide attention, since was found in food after high temperature treatment.The further studies indicated that the harm of acrylamide to human body was mainly performed by its metabolitesglycidamide (GA).In recent years, researchers began to assess the toxicity of GA, improve the dete

3、ction methods and initiate searching for the way of protection from GA in vivo.In this article, the achievement on mechanism and analysis methods of GA are sumarized.Suggestions on inhibition of GA in vivo toxicity are also proposed, according to the existing knowledge.Keywords: Acylamide; Glycidami

4、de; Mechanism; Analysis method; Protection in vivo早在1994年，国际癌症研究署（IARC）就将丙烯酰胺定为准致癌物，提醒人们关注。随着丙烯酰胺被发现存在于高温焙烤食品当中后，国际粮农组织（FAO）和世界卫生组织（WHO）联合食品添加剂专家委员会(JECFA)第64次会议，对食品中的丙烯酰胺进行了系统的危险性评估。人们逐渐认识到丙烯酰胺所具有遗传毒性、准致癌性等几乎都与其在体内的代谢产物环氧丙酰胺有关 13。丙烯酰胺进入生物体后，其中10%左右在线粒体细胞色素P450中的氧化酶作用下，转变成为环氧丙酰胺46。环氧丙酰胺是一种具有较强遗传毒性的物

5、质，能够攻击DNA分子，破坏遗传物质7；而且对遗传物质的破坏作用有明显的富集性8。此外,环氧丙酰胺还被证实，能够造成生物体精子细胞的遗传突变，增加了其它疾病的发病几率9。目前，人们更加关注丙烯酰胺的产生阶段，并在利用天然产物抑制生成丙烯酰胺的美拉德反应方面取得了长足的进展10。近年来，已有不少研究者开始着手利用天然产物抑制丙烯酰胺及其代谢物环氧丙酰胺在体内的毒性，作为防护丙烯酰胺危害的第二道防线。因此，总结相关的体内代谢研究和毒性防护方面的成果，将为人类抵御丙烯酰胺的威胁提供新的思路。丙烯酰胺在体内的代谢途径图 1: 丙烯酰胺体内代谢途径AAMA：(N-acetyl-S-(2-carbamoy

6、lethyl)cysteine GAMA：N-acetyl-S-(2-hydroxy-2-carbamoylethyl) cysteine 异GAMA：N-acetyl-S-(1-carbamoyl-2-hydroxyethyl) cysteineAA-Hb：N-(2-carbamoylethyl)valine GA-Hb：N-(2-carbamoy-2-hydroxyethyl) valine 如图1，丙烯酰胺通过饮食、皮肤或者吸烟1113进入体内后，有两条主要的代谢途径：1、在谷胱甘肽-S-转移酶的作用下，与谷胱甘肽结合生成硫醇尿酸化合物（AAMA）；2、在细胞色素P450当中的CPY2E

7、1单氧合酶催化下，生成环氧丙酰胺14,15。所生成的环氧丙酰胺同样可以与谷胱甘肽结合生成两种硫醇尿酸化合物（GAMA和异GAMA）。除了谷胱甘肽外，人体对于环氧丙酰胺具有另一种解毒的途径：在环氧化物水解酶的作用下，一部分环氧丙酰胺可以被转化成Glyceramide（无毒）16,17。上述的AAMA，GAMA，异GAMA， Glyceramide甚至一小部分游离的丙烯酰胺都可以通过尿液排除体外。其中，AAMA的量为GAMA的10倍左右，而异GAMA含量远远小于GAMA4,14,18。这些硫醇尿酸化合物在体内的存留时间很短，一般48小时后，几乎完全排出体外4。由于AAMA是尿液中主要结合物，很多研

8、究中，都选择AAMA作为评价人体暴露于丙烯酰胺的生物学标记。此外，丙烯酰胺和环氧丙酰胺还会与血红蛋白的氨基末端缬氨酸结合，生成化学性质稳定的化合物：AA-Hb和GA-Hb19。这个过程是对肌体的毒害作用，而且与血红蛋白的结合物在血液中的残留时间很长，通常超过一周。 丙烯酰胺毒性的体内评价方法动物模型的选取在对丙烯酰胺毒性的评价方面，选取合适的实验动物是结果是否合理的关键。一般通过比较GAMA/AAMA的值，来评价一个物种对丙烯酰胺的体内转化活性。研究表明，大鼠的比值为0.2，小鼠为0.55，而人类为0.1左右4。这说明小鼠的CPY2E1酶的活性要远大于大鼠和人。所以选取大鼠进行体内评价更接近人

9、类。另一方面，对比了血液中GA-Hb/AA-Hb值后，发现猪等大型哺乳动物相对于啮齿类动物来说，更接近人类20。但鉴于实验成本和动物数量的考虑，研究者一般倾向于使用大鼠模型。样品预处理和测定方法早期评价丙烯酰胺暴露量的指标主要是血液中的AA-Hb和GA-Hb，采用GC，GC/MS，LC/MS来检测居多；近几年，尿液中AAMA和GAMA的含量也成为了一个重要的指标，基本都采用LC/MS和LC/MS/MS。因此，分析方法主要为血液检测和尿液检测两方面。 血液的预处理方法相对比较复杂，一般将采集来的血样在3000 rpm的转速下，离心得到红细胞，并在0.9%的NaCl溶液冲洗2次后，用蒸馏水将血细胞

10、溶解。溶解的血细胞在-80静置过夜，然后通过离心将细胞碎片去除。上述溶血产物在异丙醇中与盐酸作用后，离心去除杂质。再向悬浮液中加入乙酸乙酯，低温静置2小时后再次离心，得到的沉淀就是珠蛋白。经乙酸乙酯和n-己烷的冲洗后，珠蛋白在氮气下吹干。血液中的丙烯酰胺和环氧丙酰胺就结合在血红蛋白上。接下来是衍生化过程，环氧丙酰胺和丙烯酰胺与血红蛋白的结合物在碱性条件下，与异硫氰酸苯酯发生艾德曼反应，产生一种乙内酰苯硫脲衍生物2124。再用乙醚萃取并氮气吹干，经固相萃取柱净化后，方可利用LC/MS/MS检测19,20。AA-Hb和GA-Hb的检测限最低分别可达0.7pmol/g珠蛋白，1.3 pmol/g珠蛋

11、白22。 尿样的处理方法要简单很多。只需将尿样注入HLB固相萃取柱（用2ml甲醇, 2ml蒸馏水和1ml 0.1%甲酸溶液活化），用1.4ml的0.1%甲酸溶液洗涤，再用2×1.5 ml 的混合液(蒸馏水：甲醇：甲酸溶液，59 : 40 : 1, v/v)洗脱25。随后利用LC/MS/MS进行检测。AAMA和GAMA的检测限分别可达0.8 ng/ml和0.5 ng/ml26。 最近，中国的研究者Qunying X.等人还引进了一种新的测定方法：利用加速器质谱来检测样品中带放射性标记的丙烯酰胺和环氧丙酰胺的结合物27。这种方法可以便于观察，生物体内各结合物的微量变化及分布，但是应用局限

12、性较大，只能检测放射性标记后的物质。毒性评价 大量实验证明,丙烯酰胺在体内的毒性主要由代谢物环氧丙酰胺产生。对环氧丙酰胺的基因毒性和准致癌性的评价是通过体外和体内两个体系来实现的。体外毒性 体外毒性主要通过细胞实验来评价的。Dale,W. S.等在细胞有丝分裂的研究中发现，微管启动蛋白（有丝分裂所必须的）很容易受到环氧丙酰胺和丙烯酰胺的攻击。但是对比了两者的作用浓度后发现：要达到同样的作用效果(60%的抑制率)，环氧丙酰胺（500M,）所需的浓度要低于丙烯酰胺（5 mM）28。此外，丙烯酰胺和环氧丙酰胺会诱导染色体的畸变，还会缩短细胞周期1。 更为重要的是，从对DNA的作用上看，环氧丙酰胺会与

13、DNA分子结合从而造成基因突变，但是丙烯酰胺却不会直接攻击DNA2。环氧丙酰胺的攻击靶点很多：血红蛋白，血清清蛋白，鱼精蛋白和精子DNA27。它对人体的毒性显而易见。 虽然环氧丙酰胺是有害的，但Flurina C. C.等通过体外实验表明，低浓度（1mM的丙烯酰胺和环氧丙酰胺培养液）时可以诱导细胞产生自我保护作用，并没有明显的毒害作用。他认为人类在一般的饮食摄入量下，是不会产生癌症信号的29。体内毒性 体内毒性主要的受试对象为啮齿类动物，大型哺乳动物（如猪等），甚至也有人体的代谢实验。综合大量的研究成果发现，摄入丙烯酰胺会增加受试大鼠和小鼠的致癌几率30, 31。长期的致癌实验证明，当每天的摄

14、入量在1mg/kg以上时，致癌性才表现出来32。相比之下，西方国家人群摄入量每天一般在0.5µg/kg左右33，职业人群暴露量每天一般在1µg/kg左右，吸烟者为3µg/kg左右34。光从饮食摄入，并不能定论丙烯酰胺及其代谢物是否会对人体造成威胁。流行病学的研究中，也没有发现少量摄入丙烯酰胺与癌症的发病有直接的关系。但是，也有研究者认为这些数据很有可能是根据调查问卷来判定受试者的日常摄入量的，在估算摄入量时往往有所偏差。另外，丙烯酰胺对癌症的诱导作用也许并不是通过基因突变完成的，Pelle T.O.在研究中发现，如果扣除吸烟的影响，乳腺癌发病率与血液中的AA-Hb

15、和GA-Hb有一定的相关性35。由于两方的成果并不完全一致，现在还无法对这种食品中的准致癌物，做一个准确的安全性评价。毒性抑制的进展虽然人们在高温焙烤过程中，利用天然产物抑制丙烯酰胺产生方面有了较为成功的先例10，但在体内防护方面还鲜有报道。Dirk Taubert等人发现了一种细胞色素P450的抑制剂二烯丙基硫化物（该物质是从大蒜中提取的）。在大鼠肝脏细胞培养过程中，当浓度为100mol/L时，其对丙烯酰胺向环氧丙酰胺转变的抑制率为50%；当浓度为1000mol/L时，抑制率竟达到85%36！Qunying, X.等发现，茶多酚、白藜芦醇、大蒜素可以有效阻止环氧丙酰胺对DNA的破坏。茶多酚可

16、以减少其对鱼精蛋白的结合，同时大蒜素可以减少对血红蛋白的结合。两者还能增加谷胱甘肽-S-转移酶的活性，提高人体的解毒功能37。活性氧簇是活跃的氧自由基，对于人体细胞和遗传物质均有较强的攻击性。而JUN C.等发现当丙烯酰胺添加到DNAHepG2（人体肝细胞）细胞培养液中，会促进活性氧簇的生成；但是加入姜黄达2.5g/mL时，丙烯酰胺浸泡下的肝脏细胞产生活性氧簇得到了明显的抑制38。以上是天然产物对于丙烯酰胺和环氧丙酰胺毒性抑制的直接证据，另外还有很多关于天然产物抑制线粒体相关反应的证据。此外，大蓟中提取的水飞蓟素可以有效降低人肝微粒体中CPY2E1的活性39。红茶中的茶黄素和儿茶素可降低大鼠小

17、肠微粒体中的蛋白水平40。大豆中的金雀异黄素和牛尿酚能抑制小鼠肝微粒体中细胞色素CPY2E1对硝基苯酚的芳香基羟化作用41。以上的研究成果间接地提示我们，利用天然产物来抑制环氧丙酰胺的生成以及阻碍其体内毒性是可行的。对体内防护的展望随着人类对丙烯酰胺认识的加深，对丙烯酰胺防护的第一道防线食品体系中丙烯酰胺生成阶段，逐渐引起人们的重视，抑制其生成的研究也取得了较大的进展。但是，人们在日常生活中不可避免还会经常摄入丙烯酰胺，体内的第二道防线抑制环氧丙酰胺的毒性就显得尤为重要。现阶段关于体内抑制的成果并不多，还主要停留在体外实验阶段，今后人们定将探索出一条体内抑制环氧丙酰胺毒性的途径。总结了相关研究

18、，我们建议今后体内的抑制手段将通过以下途径进行：1、 抑制CYP 2E1酶的活性，从源头上减少环氧丙酰胺的生成量；2、 提高环氧化物水解酶的活性，增加环氧丙酰胺向无毒的Glyceramide转化；3、 提高体内谷胱甘肽的含量，从而增强人体的解毒能力，尽可能多地通过尿液将有害物质排出体外；4、 抑制环氧丙酰胺和丙烯酰胺对体内靶点的攻击，减少其对机体的伤害。参考文献【1】Ce´lia, M., Nuno, G. O., Marta, P., Goncxalo, G. C., Vanda, M., Marques, M. M., Frederick, A. B., Mona, I. C.,

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