弗氏柠檬酸菌的酶法合成

1、用弗氏柠檬酸菌酶法合成用弗氏柠檬酸菌酶法合成L-酪氨酸酪氨酸组别：第五组组员：张秀婷 史雪松 潘丽刘慧明 林蔷薇一、基础知识 弗氏柠檬酸菌 柠檬酸菌属直杆菌、直径约1.0，长2.06.0m，单个和成对。 柠檬酸杆菌属是肠道菌中常见的非致病菌，由于该菌与肠道中的致病菌沙门氏菌十分相似，故在肠道细菌的分类鉴定中非常重要。L-丝氨酸的基础知识丝氨酸的基础知识 英文名：英文名：L-TyrosineL-Tyrosine 学名：学名：2-2-氨基氨基-3-3-对羟苯基丙酸。对羟苯基丙酸。一种含有酚羟基的芳香族极性一种含有酚羟基的芳香族极性氨基酸。是组成蛋白质氨基酸。是组成蛋白质的的2020种氨基酸中的一种

2、，是哺乳动物的必需氨基酸，又种氨基酸中的一种，是哺乳动物的必需氨基酸，又是生酮和生糖氨基酸。符号：是生酮和生糖氨基酸。符号：Y Y CASCASNo.No.：60-18-460-18-4 产品描述：白色结晶体或结晶粉末，无味，易溶于甲酸，产品描述：白色结晶体或结晶粉末，无味，易溶于甲酸，难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸或稀硝酸中溶难溶于水，不溶于乙醇和乙醚。在稀盐酸或稀硝酸中溶解解 生产标准：生产标准：AJI92AJI92，USP26USP26，EP4EP4 分子式：分子式：C C9 9H H1111NONO3 3 相对分子量或原子量：相对分子量或原子量：181.20181.20 密度：密

3、度：1.4561.456 熔点（熔点（）：）：l:342l:342344344（分解）；（分解）；d:310d:310314(314(分解分解) )；dl:340dl:340（分解）（分解） 比旋度：比旋度：-11.3-11.3至至-12.1-12.1 【性状】【性状】 l- l-体从水中结晶出来者，无色至白体从水中结晶出来者，无色至白色丝光针状结晶或结晶性粉末；色丝光针状结晶或结晶性粉末；d-d-体从水中结晶者为无色晶体；体从水中结晶者为无色晶体；dl-dl-体体从水中结晶者为有光泽的针状晶体。从水中结晶者为有光泽的针状晶体。为动物体内非必需氨基酸！为动物体内非必需氨基酸！ 【制备或来源】【

4、制备或来源】 由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋由含蛋白质的物质（废丝、酪蛋白和玉米等）水解液中提取；白和玉米等）水解液中提取； 以葡萄糖为原料，经短杆菌出发以葡萄糖为原料，经短杆菌出发诱导的诱导的l-l-酪氨酸生产菌发酵而得；酪氨酸生产菌发酵而得； 以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利以苯酚、丙酮酸、氨为原料，利用用-酪氨酸酶催化制取酪氨酸酶催化制取L-丝氨酸的结构式丝氨酸的结构式【用途】【用途】 与糖类共热可产生氨基羰基间的反应，而产与糖类共热可产生氨基羰基间的反应，而产生一种特殊的香料。必需氨基酸。生一种特殊的香料。必需氨基酸。 酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底物，酪氨酸是酪氨酸酶单酚酶功能的催化底

5、物，是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在是最终形成优黑素和褐黑素的主要原料。在美白化妆品研发中，可以通过研究合成与酪美白化妆品研发中，可以通过研究合成与酪氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地氨酸竞争的酪氨酸酶结构类似物也可有效地抑制黑素的生成。抑制黑素的生成。二、L-L-酪氨酸的酶法合成酪氨酸的酶法合成 L-L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，应用酶法取代水解法生产酸之一，应用酶法取代水解法生产L-L-酪氨酸是近酪氨酸是近年来氨基酸工业的研究热点之一。年来氨基酸工业的研究热点之一。 酪氨酸酚裂解酶酪氨酸酚裂解酶( tyrosine p

6、henol-lyase( tyrosine phenol-lyase，TPLTPL，EC4EC41 199992) 2) ，也称，也称 -酪氨酸酶，在生物体酪氨酸酶，在生物体内催化内催化L-L-酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为L-L-酪氨酪氨酸而酸而L-L-酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患酪氨酸常作为营养增补剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸，以及者的必需氨基酸，以及L-L-多巴、黑色素、对羟基多巴、黑色素、对羟基肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产品的制备原肉桂酸、对羟基苯乙烯等医药化工产

7、品的制备原料。料。 TPLTPL催化催化L-L-酪氨酸裂解的最适酪氨酸裂解的最适pHpH为为8 82 2，pH6pH60 0时该酶基本没有活性。一般认为这时该酶基本没有活性。一般认为这种高、低种高、低pHpH情况下的酶活差异是由于情况下的酶活差异是由于pKapKa约约为为7 78 8的二种催化碱的质子化引起的。的二种催化碱的质子化引起的。实验原理实验原理 TPLTPL由由4 4个相同的亚基组成。个相同的亚基组成。DemidkinaDemidkina等将每个亚基分成等将每个亚基分成N-N-末端臂、小结构域、大结构域及结构域间的连接区等四末端臂、小结构域、大结构域及结构域间的连接区等四个部分。个部

8、分。TPLTPL的催化活性需要磷酸吡哆醛的催化活性需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate(pyridoxalphosphate，PLP)PLP)作为辅因子。每个亚基含有作为辅因子。每个亚基含有1 1个个PLPPLP结合位点，该位点位于一个亚基大、小结构域与结结合位点，该位点位于一个亚基大、小结构域与结晶学相关的另一亚基大结构域之间形成的深裂内。晶学相关的另一亚基大结构域之间形成的深裂内。TPLTPL的的催化活性还需要单价阳离子催化活性还需要单价阳离子K+K+或或NH4+NH4+作为激活剂。每个亚作为激活剂。每个亚基含有基含有1 1个个K+K+结合位点，该位点位于结晶学相关的二个亚

9、结合位点，该位点位于结晶学相关的二个亚基之间相联系的界面上，具有稳定催化二聚体的作用。基之间相联系的界面上，具有稳定催化二聚体的作用。K+K+的配位数为的配位数为7 7，它们是一个亚基，它们是一个亚基Gly52Gly52和和Asn262Asn262的羧基氧、的羧基氧、另一个结晶学相关亚基另一个结晶学相关亚基Glu69Glu69的主链羧基氧与侧链羧基氧，的主链羧基氧与侧链羧基氧，以及三分子水。以及三分子水。PhillipsPhillips等认为，等认为，Lys256Lys256紧邻紧邻PLPPLP结合位结合位点点Lys257Lys257，在单价阳离子结合位点的形成中具有关键作用。，在单价阳离子结

10、合位点的形成中具有关键作用。不同阳离子与配位体在距离上的微小差异，引起了活性部不同阳离子与配位体在距离上的微小差异，引起了活性部位构象的细微改变，这可能是不同阳离子对位构象的细微改变，这可能是不同阳离子对TPLTPL活性具有活性具有不同效应的原因。不同效应的原因。 TPLTPL的作用机理的作用机理 TPLTPL催化的催化的-消除反应机制主要包括以下步骤消除反应机制主要包括以下步骤: : 酶活性部位酶活性部位Lys257Lys257的的-氨基与氨基与PLPPLP共价结合形成共价结合形成内醛亚胺，内醛亚胺与底物内醛亚胺，内醛亚胺与底物 L- L-酪氨酸作用形成外酪氨酸作用形成外醛亚胺，醛亚胺，Ly

11、s257Lys257夺取外醛亚胺夺取外醛亚胺( (底物底物)C)C质子产生质子产生醌型中间物，经底物醌型中间物，经底物CC质子化及质子化及C-CC-C键断裂键断裂生成生成-氨基丙烯酸中间物，氨基丙烯酸中间物，-氨基丙烯酸中间氨基丙烯酸中间物进一步受与物进一步受与PLPPLP结合的结合的Lys257-Lys257-氨基攻击再生氨基攻击再生TPLTPL全酶全酶工艺路线工艺路线 1、丙酮酸路线、丙酮酸路线 L-L-酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酪氨酸是目前仍采用酸水解法生产的少数氨基酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代酸之一，收率低，环境污染严重，应用酶法取代水解法生产水解法生产L-

12、L-酪氨酸具有重要的应用价值。用酪氨酸具有重要的应用价值。用TPLTPL合成合成L-L-酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。酪氨酸，首先开展的工艺是丙酮酸路线。 ParaPara等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的等将包埋于聚丙烯酰胺凝胶中的C Cintermiediusintermiedius固定化细胞作为催化剂，分批添固定化细胞作为催化剂，分批添加底物，建立加底物，建立75mmol/L75mmol/L丙酮酸钠、丙酮酸钠、45mmol/L45mmol/L硫酸硫酸铵、铵、45mmol/L45mmol/L氯化铵和氯化铵和55mmol/L55mmol/L苯酚的转化体系，苯酚的转化体系，反应反应5h5h后可

13、积累后可积累L-L-酪氨酸酪氨酸10g/L10g/L。若将反应体系置。若将反应体系置于连续的柱反应器内，苯酚对于连续的柱反应器内，苯酚对L-L-酪氨酸的转化率酪氨酸的转化率达达90%90%，且稳定性可维持，且稳定性可维持5d5d。 2、L-丝氨酸路线 由于由于L-L-丝氨酸可通过丝氨酸羟甲基转移酶丝氨酸可通过丝氨酸羟甲基转移酶(EC2(EC21 12 21)1)催化甘氨酸和甲醛廉价制备，催化甘氨酸和甲醛廉价制备，LeeLee等用产气克雷伯氏菌等用产气克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)(Klebsiellaaerogenes)和和E EHerbicola ATCC 21434H

14、erbicola ATCC 21434分别作为丝氨酸羟甲分别作为丝氨酸羟甲基转移酶和基转移酶和TPLTPL的酶源，将以甘氨酸为底物合成的酶源，将以甘氨酸为底物合成L-L-丝氨酸的反应和以丝氨酸的反应和以L-L-丝氨酸为底物合成丝氨酸为底物合成L-L-酪氨酸酪氨酸的反应相偶联，反应体系含甘氨酸的反应相偶联，反应体系含甘氨酸0 025mol/L25mol/L、PLP0PLP05mmol/L5mmol/L、四氢叶酸、四氢叶酸0 07mmol/L7mmol/L、初始苯、初始苯酚浓度酚浓度0 032%32%，以，以37%37%甲醛启动反应甲醛启动反应16h16h后，可产后，可产生生L-L-酪氨酸酪氨酸2

15、6263g/L3g/L，甘氨酸转化率为，甘氨酸转化率为61614%4%，但该工艺存在甘氨酸对但该工艺存在甘氨酸对TPLTPL抑制较强和操作复杂的抑制较强和操作复杂的明显不足。明显不足。 3 3、S-S-邻硝基苯邻硝基苯-L-L-半胱氨酸半胱氨酸(SOPC)(SOPC)是是TPLTPL适适宜的人工底物，其宜的人工底物，其VmaxVmax比生理底物比生理底物L-L-酪氨酪氨酸高三倍，而酸高三倍，而KmKm仅为仅为L-L-酪氨酸的酪氨酸的50%50%。PhillipsPhillips等以等以C CFreundii ATCC 29063Freundii ATCC 29063细细胞悬液作为酶源，胞悬液作

16、为酶源，4mmol/LSOPC4mmol/LSOPC和和4mmol/L4mmol/L苯酚反应苯酚反应2h2h，苯酚的转化率就达到，苯酚的转化率就达到70%70%，而，而且这一反应的最适且这一反应的最适pHpH较为宽泛较为宽泛(6(68 89 90)0)。不过，。不过，SOPCSOPC价格较高价格较高，从而限制了，从而限制了该工艺的工业化应用。该工艺的工业化应用。酶法合成产物L-酪氨酸的分析鉴定 酪氨酸酪氨酸酪氨酸的测定酪氨酸的测定电位滴定法电位滴定法 本方法适用于酪氨酸的含量测定。本方法适用于酪氨酸的含量测定。 方法原理：供试品加无水甲酸溶解后，再方法原理：供试品加无水甲酸溶解后，再加冰醋酸适

17、量，照电位滴定法（附录加冰醋酸适量，照电位滴定法（附录 A），用高氯酸滴定液（），用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定，）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每并将滴定的结果用空白试验校正。每1mL高氯酸滴定液（高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于）相当于18.12mg的的C C9 9H H1111NONO3 3。 电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以电位滴定法是在滴定过程中通过测量电位变化以确定滴定终点的方法，和直接电位法相比，电位确定滴定终点的方法，和直接电位法相比，电位滴定法不需要准确的测量电极电位值，因此，温滴定法不需要准确的测量电极电位值，因此，温度、液体接界电位的影响并不

18、重要，其准确度优度、液体接界电位的影响并不重要，其准确度优于直接电位法普通滴定法是依靠指示剂颜色变化于直接电位法普通滴定法是依靠指示剂颜色变化来指示滴定终点，如果待测溶液有颜色或浑浊时，来指示滴定终点，如果待测溶液有颜色或浑浊时，终点的指示就比较困难，或者根本找不到合适的终点的指示就比较困难，或者根本找不到合适的指示剂。电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示指示剂。电位滴定法是靠电极电位的突跃来指示滴定终点。在滴定到达终点前后，滴液中的待测滴定终点。在滴定到达终点前后，滴液中的待测离子浓度往往连续变化离子浓度往往连续变化n n个数量级，引起电位的突个数量级，引起电位的突跃，被测成分的含量仍然通过消

19、耗滴定剂的量来跃，被测成分的含量仍然通过消耗滴定剂的量来计算。计算。 使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱使用不同的指示电极，电位滴定法可以进行酸碱滴定，氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。酸滴定，氧化还原滴定，配合滴定和沉淀滴定。酸碱滴定时使用碱滴定时使用PHPH玻璃电极为指示电极，在氧化还玻璃电极为指示电极，在氧化还原滴定中，可以从铂电极作指示电极。在配合滴原滴定中，可以从铂电极作指示电极。在配合滴定中，若用定中，若用EDTAEDTA作滴定剂，可以用汞电极作指示作滴定剂，可以用汞电极作指示电极，在沉淀滴定中，若用硝酸银滴定卤素离子，电极，在沉淀滴定中，若用硝酸银滴定卤素离子，可以用银电

20、极作指示电极。在滴定过程中，随着可以用银电极作指示电极。在滴定过程中，随着滴定剂的不断加入，电极电位滴定剂的不断加入，电极电位E E不断发生变化，电不断发生变化，电极电位发生突跃时，说明滴定到达终点。用微分极电位发生突跃时，说明滴定到达终点。用微分曲线比普通滴定曲线更容易确定滴定终点。曲线比普通滴定曲线更容易确定滴定终点。 如果使用自动电位滴定仪，在滴定过程中可以自如果使用自动电位滴定仪，在滴定过程中可以自动绘出滴定曲线，自动找出滴定终点，自动给出动绘出滴定曲线，自动找出滴定终点，自动给出体积，滴定快捷方便。体积，滴定快捷方便。试样制备：试样制备： 1. 1. 高氯酸滴定液（高氯酸滴定液（0.

21、1mol/L0.1mol/L） 配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每配制：取无水冰醋酸（按含水量计算，每1g1g水加水加醋酐醋酐5.22mL5.22mL）750mL750mL，加入高氯酸（，加入高氯酸（7072%7072%）8.5mL8.5mL，摇匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成，摇匀，放冷，加无水冰醋酸适量使成1000mL1000mL，摇匀，放置，摇匀，放置2424小时。若所测供试品易乙小时。若所测供试品易乙酰化，则须用水分测定法测定本液的含水量，再酰化，则须用水分测定法测定本液的含水量，再用水和醋酐调节至本液的含水量为用水和醋酐调节至本液的含水量为0.01%0.2%0.01%0.2%。 标定

22、：取在标定：取在105105干燥至恒重的基准邻苯二甲酸干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约氢钾约0.16g0.16g，精密称定，加无水冰醋酸，精密称定，加无水冰醋酸20mL20mL使溶使溶解，加结晶紫指示液解，加结晶紫指示液1 1滴，用本液缓缓滴定至蓝色，滴，用本液缓缓滴定至蓝色，并将滴定结果用空白试验校正。每并将滴定结果用空白试验校正。每1mL1mL高氯酸滴定高氯酸滴定液（液（0.1mol/L0.1mol/L）相当于）相当于20.42mg20.42mg的邻苯二甲酸氢钾。的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。算出本液的

23、浓度。 结晶紫指示液结晶紫指示液 取结晶紫取结晶紫0.5g0.5g，加冰醋酸，加冰醋酸100mL100mL使溶解。贮藏：置棕色玻使溶解。贮藏：置棕色玻璃瓶中，密闭保存。璃瓶中，密闭保存。 操作步骤：取该品约操作步骤：取该品约0.15g0.15g，精密称定，加无水甲酸，精密称定，加无水甲酸6mL6mL溶溶解后，加冰醋酸解后，加冰醋酸50mL50mL，照电位滴定法（附录，照电位滴定法（附录 A A），用高），用高氯酸滴定液（氯酸滴定液（0.1mol/L0.1mol/L）滴定，并将滴定的结果用空白试）滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每验校正。每1mL1mL高氯酸滴定液（高氯酸滴定液（0.1mol

24、/L0.1mol/L）相当于）相当于18.12mg18.12mg的的C9H11NO3C9H11NO3。 注注1 1：“精密称取精密称取”系指称取重量应准确至所称取重量的系指称取重量应准确至所称取重量的千分之一千分之一,“,“精密量取精密量取”系指量取体积的准确度应符合国系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。家标准中对该体积移液管的精度要求。 注注2 2：“水分测定水分测定”用烘干法，取供试品用烘干法，取供试品25g25g，平铺于干，平铺于干燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过燥至恒重的扁形称瓶中，厚度不超过5mm5mm，疏松供试品不，疏松供试品不超过超过10mm10mm，精

25、密称取，打开瓶盖在，精密称取，打开瓶盖在100105100105干燥干燥5 5小时，小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却3030分钟，精密称定重量，分钟，精密称定重量，再在上述温度干燥再在上述温度干燥1 1小时，冷却，称重，至连续两次称重小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过的差异不超过5mg5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（含水量（% %）。）。纸层析 分析鉴定酶法合成的酪氨酸纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物随流动相时而得到分离的方法。随流动相时而得到分

26、离的方法。纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当有机相沿滤纸流动经过样品点时，样品点动相。当有机相沿滤纸流动经过样品点时，样品点上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快。基酸移动较慢，而非极性氨

27、基酸移动较快。 溶质在滤纸上的移动速度用溶质在滤纸上的移动速度用R Rf f值表示：值表示： R Rf f = =原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/ /原点到溶剂前沿的距原点到溶剂前沿的距离离= X/Y= X/Y 在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的R Rf f值是常数。值是常数。 R Rf f值的大小与物值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。 实验试剂实验试剂1. 1. 展层剂和平衡液展层剂和平衡液 正丁醇正

28、丁醇: :冰醋酸冰醋酸: :水水=4:1:5=4:1:5，充分摇匀，用分液，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液( (弃去弃去) )。2. 2. 样品液样品液 用水配成每用水配成每mlml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml4mg/ml的氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸的混的氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸的混合液合液( (各各4mg/ml)4mg/ml)。3. 3. 茚三酮茚三酮 按展层剂按展层剂0.25%0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解使其溶解。（1 1）检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将）检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内其洗净并