木聚糖酶检测方法

1、木聚糖酶活力的测定分光光度法1 原理木聚糖酶能将底物木聚糖（本实验采用xylan from oat spelt，燕麦木聚糖，sigma no. :x0627 ）降解成寡糖和单糖，具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与dns 试剂发生显色反应。反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中木聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算待测木聚糖酶的活力。2 木聚糖酶活力单位（u）的定义在 40、 ph 值为 5.0 的条件下， 1.0 min 从浓度为 5 mg/ml 的木聚糖溶液中降解释放1 mol 还原糖（以木糖表示）所需

2、要的酶量为一个酶活力单位（u） 。其中样品的酶活力以u / g（固体酶）或u / ml （液体酶）表示。桦木木聚糖（xylan from birch wood ）山毛榉木聚糖（xylan from beechwood ）3 主要仪器3.1 分光光度计3.2 精密电子天平精确至 0.0001 g。3.3 恒温水浴锅30-60可调，精度为0.1。3.4 酸度计精确至 0.01。3.5 秒表每小时误差不超过5s。3.6 刻度试管（ 15ml ）带玻璃塞， 10 支以上。3.7 移液管（ 0.5、 1、2、5、10ml）3.8 分样筛孔径为 0.25 mm（ 60 目） 。3.9 分析天平精确至 0.

3、001 g。3.10 磁力搅拌器附加热功能。3.11 电磁振荡器3.12 烧结玻璃过滤器孔径为 0.45 m。3.13 离心机3000 r/min 3.14 冰箱4 试剂与溶液配制除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水均为符合gb/t6682 中规定的二级水。4.1 氢氧化钠（ naoh ）溶液（浓度为200 g/l）称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100ml。4.2 乙酸（ ch3cooh ）溶液（浓度为0.1 mol/l）吸取冰乙酸0.60ml，加水溶解，定容至100ml。4.3 乙酸钠溶液（ch3coona ） （浓度为0.1 mol/l）称取三水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容

4、至100ml 。4.4 乙酸 乙酸钠（ch3cooh ch3coona ）缓冲溶液 （浓度为0.1 mol/l，ph 为 5.0）称取三水乙酸钠19.17 g，加入冰乙酸3.60 ml。再加水溶解，定容至2000 ml 。测定溶液的 ph 值。如果 ph 值偏离 5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。用精密 ph 试纸检定。4.5 木糖（ c5h10o5）溶液（浓度为10.0 mg/ml ）称取无水木糖1.000 g，加乙酸 乙酸钠缓冲溶液（4.4）溶解，定容至100 ml。4.6 木聚糖溶液（浓度为10.0g/l）称取木聚糖 （sigma x0627 ）1.00

5、g，加入 0.32g 氢氧化钠， 再加入 90 ml 水，磁力搅拌，同时缓慢加热，直至木聚糖完全溶解。然后停止加热，继续搅拌30 min，加入 0.8 ml 冰乙酸。继续磁力搅拌，测定其ph 值。如果ph 值为 5.0，用乙酸 乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至 100 ml。如果 ph 值偏离 5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（ 4.3）调节至 5.0，然后再用乙酸 乙酸钠缓冲溶液（4.4）定容至100 ml。木聚糖溶液能立即使用，使用前适当摇匀。 4避光保存，有效期为3 天。4.7 dns 试剂称取 3,5-二硝基水杨酸3.15 g（化学纯），加水 500 ml，搅拌 5 s，水浴至

6、 45。然后逐步加入 100 ml 氢氧化钠溶液（4.1） ，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48。 ） 。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚 2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续 45水浴加热，同时补加水300 ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000ml。用 烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶 中，避光保存。室温下存放7 天后可以使用，有效期为6 个月。4.8 乙酸 乙酸钠 2号缓冲溶液量取 100ml 乙酸 乙酸钠 1 号缓冲溶液， 加入 0.15gtriton x-100（曲拉通

7、100） ， 0.15g牛血清白蛋白（bsa ）混合均匀。如果ph 值偏离 5.0，再用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节至5.0。5 标准曲线的绘制吸取乙酸 乙酸钠缓冲溶液（4.4）2.0 ml，加入 dns 试剂（ 4.7）3.0 ml ，沸水浴加热 5 min。用自来水冷却至室温，用水定容至15.0 ml，制成标准空白样。分别吸取木糖溶液（4.5）3.00、4.00、5.00、6.00 7.00 和 8.00ml，分别用缓冲溶液 （ 4.4）定容至 100 ml，配制成浓度为300、400、500、 600、700、800 g/ ml 木糖标准溶液。分别吸取上述浓度系列的木糖标

8、准溶液各1.00 ml （做三个平行） ，分别加入到刻度试管中， 再分别加入1.0 ml 缓冲液（4.4）（终浓度分别为： 0,150， 200， 250， 300， 350 和 400 g/ml）和 3.0 ml dns 试剂（ 4.7） 。振荡 3 s，沸水浴加热5 min。然后用自来水冷却到室温，再用蒸馏水定容至15 ml。以标准空白样为对照调零，在540 nm 处测定吸光度od 值。以木糖浓度为y 轴、吸光度od 值为 x 轴， 绘制标准曲线。每次新配制dns 试剂均需要重新表一：木糖标准曲线制作数据记录木糖系列浓度( g/ml) 150 200 250 300 350 400 用 e

9、xcel 线性回归，得到回归方程，用于后续酶活力的计算：y( g/ml)=aod540nm + b -（2）得：a= ；b= . 6 试样溶液的制备固体样品应粉碎或充分碾碎，然后过60 目筛（孔径为0.25 mm） ，称取1.000g 样品，精确至 0.001 g。加入 40 ml 乙酸 乙酸钠缓冲溶液（4.4） 。高速磁力搅拌30 min ，再用缓冲溶液（ 4.4）定容至100 ml。上离心机（3.13）4000r 离心 3min，取上清液，再用缓冲溶液（ 4.4）做适当稀释（吸光度od540nm值应控制在0.2-0.6 之间，否则需重新稀释再做）。（注： 当以麸皮或玉米芯份做载体的样品时，

10、应使用乙酸乙酸钠2 号缓冲溶液（4.8 ）抽提，但应使用乙酸乙酸钠1 号缓冲溶液（ 4.4 ）稀释。）液体样品可以直接用乙酸 乙酸钠缓冲溶液（4.4）进行稀释、定容（稀释后吸光度在 0.2-0.6 之间）。如果稀释后酶液的ph 值偏离 5.0，需要用乙酸溶液（4.2）或乙酸钠溶液（4.3）调节校正至5.0，然后再用缓冲溶液（5.4）做适当稀释定容。7 测定步骤吸取 10.0 ml 木聚糖溶液（ 5.6） ，40 平衡 10 min。吸取 10.0 ml 经过适当稀释的酶液，40平衡 10 min。酶空白样制作：吸取 1.00 ml 经过适当稀释的酶液（已经过40平衡） ， 加入到刻度试管中，

11、再加入 3ml dns 试剂（ 4.7） ，电磁振荡3 s。然后加入1.0 ml 木聚糖溶液（ 4.6） ，40反应 20 min，沸od540nm1 号管2 号管3 号管平均水浴加热5 min。用自来水冷却至室温，加水定容至15 ml，电磁振荡3 s。以此作为反应空白调零。酶反应样制作（需作3 个平行）：吸取 1.00 ml 经过适当稀释的酶液（已经过 40 平衡） ，加入到刻度试管中，再加入 1.0 ml 木聚糖 （ 4.6） （已经过40平衡） ，电磁振荡3 s，40精确保温20 min。加入 3.0 ml dns试剂（ 4.7） ，电磁振荡3 s，以终止酶解反应。沸水浴加热5 min，用自来水冷却至室温，加水定容至15 ml，电磁振荡3 s。以酶空白样为调零，在540 nm 处测定吸光度a。跟据回归方程计算出还原糖量，即y 值。8 试样酶活的计算y n 2 xd = -（2）20 150 xd 试样稀释液中木聚糖酶的活力，u/ml 或者 u/g；y 根据样品吸光度od540nm，用回归方程计算出的还原糖量（即 y 值） ， 单位为： g/ml；n 从固体样品到测定前最终液的总稀释倍数；2 酶促反应体积为2.0 ml 。