(完整版)PCR技术原理

1、第五章第五章 pcr技术原理技术原理 定义：定义： pcr技术又称聚合酶链式反应（技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内，是通过模拟体内 dna 复制的复制的 方式，在体外选择性地将方式，在体外选择性地将 dna 某个特殊区域扩某个特殊区域扩 增出来的技术。增出来的技术。n pcr技术技术:pcr概念的提出概念的提出1983，kary mullis引物引物引物引物mullis最初使用的dna聚合酶是大肠杆菌 dna 聚合酶 i 的klenow片段。不耐高温。heat-stable polymerase is vital to the eas

2、e of the processthermus aquaticustaq dna多聚酶的发现多聚酶的发现1988年年saiki 等从温泉等从温泉（ hot spring）中分离）中分离的一株水生嗜热杆菌的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热中提取到一种耐热dna聚合酶。聚合酶。 此酶具有以下特点此酶具有以下特点： 耐高温，耐高温， 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度长度(2.0kb)。 酶命名

3、为酶命名为taq dna多聚酶多聚酶(taq dna polymerase)。此酶的发现使被。此酶的发现使被pcr广泛应用。广泛应用。 在在 1989 年，年，science 将将pcr中的中的taq dna多聚酶命多聚酶命 名为当年的风云分子名为当年的风云分子 (molecule of the year) 722.pcr反应过程：反应过程：1个个pcr循环循环 模板：单链或双链模板：单链或双链dna 引物：引物：16-30 bp合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸 dna聚合酶：耐热的聚合酶：耐热的dna聚合酶聚合酶 底物：四种脱氧三磷酸核苷底物：四种脱氧三磷酸核苷 （dntp: datp、dttp

4、、dctp、dgtp) 3.pcr基本要素基本要素4.pcr反应程序反应程序9496 30-3 预变性（使模板预变性（使模板dna充分变性）充分变性）94 30 变性变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）复性（使引物与模板充分退火）72 n(按按1扩增扩增1kb计算）延伸计算）延伸 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整）总的延伸（使产物延伸完整）4-10 保存保存 25-35个循环个循环1）复性和延伸复性和延伸温度温度 复性的温度是复性的温度是 pcr 扩增是否顺利的关键因素，通常在扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60 之间。具体的温度主要由引物的之间。具体的温度主要由

5、引物的 tm 值决定值决定（低于（低于tm 值值2-3 ）。）。 延伸温度绝大多数设定为延伸温度绝大多数设定为 72 。如果复性的温度很高，。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法法 pcr 。2）反应）反应时间时间 变性一般使用变性一般使用 30 秒钟，如果模板的秒钟，如果模板的 g+c 含量较高，或含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。 复性时间有复性时间有 30 秒种一般是足够的。秒种一般是足够的。 延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用延伸时间由扩增产物的大

6、小决定，一般采用 1kb 用用 1 分分钟来保证充足的时间。钟来保证充足的时间。 3）循环）循环次数次数 循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为循环次数主要与模板的起始数量有关，循环数通常为 2535 次。次。 平台效应（平台效应（plateau effect）：）：pcr 扩增过程后期出现扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。 原因：底物和引物的浓度已经降低，原因：底物和引物的浓度已经降低，dntp 和和 dna 聚合聚合酶的稳定性或活性降低酶的稳定性或活性降低 ，产生的焦磷酸会出现末端产物，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用

7、，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。彻底。 4）pcr 反应液的配制反应液的配制 最后加入最后加入 dna 聚合酶。聚合酶。 早期的早期的 pcr 仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆仪没有带加热的盖子，要求在反应液上覆盖一层矿物油，防止水分蒸发。盖一层矿物油，防止水分蒸发。热启动（热启动（hot start）pcr操作方式可较好解决非特异操作方式可较好解决非特异性扩增的问题。性扩增的问题。 mgcl2， 50mm k+ 引物设计的一般原则引

8、物设计的一般原则 长度：至少长度：至少 16bp ，通常为，通常为 18-30bp。 更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 引物的解链温度：两个引物之间的引物的解链温度：两个引物之间的 tm 值差异最好在值差异最好在 2-5 。 对于小于对于小于 20 个碱基的引物其个碱基的引物其 tm 值可用简易公式计算，即值可用简易公式计算，即 tm=4（g+c）+2（a+t）。）。 对于对于 14-70 个核苷酸的引物可用个核苷酸的引物可用 以下公式计算。以下公式计算。 tm=81.5+16.6（1gk+）+0.41（g+c）%

9、-（675/n） n 表示引物的核苷酸数目，表示引物的核苷酸数目， k+ 表示单价离子即钾离子的浓度表示单价离子即钾离子的浓度 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的 3端）。端）。 g+c 含量：尽量控制在含量：尽量控制在 40% 至至 60% 之间，之间， 4 种碱基的分布应种碱基的分布应 尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 t 在在 3 末末 端的重复排列。端的重复排列。 引物的引物的 3 末端最好是末端最好是 g 或或 c ，但不要，但不要 gc 连排。连排。1. 长

10、片段长片段dna的的pcr扩增扩增常规常规pcr长度为长度为2kb以下。以下。长片段长片段pcr扩增存在的问题：扩增存在的问题：（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低）随着扩增片段的延长，扩增效率降低（2）高温会损坏模板）高温会损坏模板dna和和pcr产物产物（3）高温下其他二价离子的存在会促进）高温下其他二价离子的存在会促进dna的裂解的裂解（4）长片段）长片段dna分子的变性比短片段困难，分子的变性比短片段困难，dna聚合聚合酶与模板酶与模板dna的趋近和接合变得困难的趋近和接合变得困难（5）错配碱基的掺入导致）错配碱基的掺入导致dna聚合酶的作用不能正常聚合酶的作用不能正常发挥，从而限制

11、产物的长度发挥，从而限制产物的长度二、二、pcr的类型的类型改进：改进： (1)改进缓冲体系改进缓冲体系 (2) 采用混合采用混合dna聚合酶聚合酶 主体使用扩增效率高，延伸能力强的主体使用扩增效率高，延伸能力强的2. pcr扩增未知扩增未知dna片段片段1).染色体步查（移）（染色体步查（移）（chromosome walking ）：）： 是指从生物基因组或基因组文库中的是指从生物基因组或基因组文库中的已知序列出已知序列出发发，逐步获得，逐步获得与其相邻的未知序列的核苷酸组成与其相邻的未知序列的核苷酸组成的方的方法和过程。法和过程。2) . 反向反向pcr(inverse pcr) 一种简

12、单的扩增已知序列周边序列的方法。一种简单的扩增已知序列周边序列的方法。扩增原理：扩增原理：步骤：步骤：首先首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板 dna ，再再将酶切后的将酶切后的 dna 片段连接成环状分子，片段连接成环状分子，最后最后根据已知片段两端的序列设计引物，根据已知片段两端的序列设计引物， pcr扩增邻近的扩增邻近的dna 片段。片段。3) .利利用接头用接头的的pcr步骤：步骤： ( (1) )基因组基因组dnadna的限制性内切酶酶切，的限制性内切酶酶切，（2 2）接头与限制性内切酶片段的连接，）接头与限制性内切酶片段的连接，（3

13、3）已知序列侧翼未知序列的）已知序列侧翼未知序列的pcrpcr扩增（利用分别扩增（利用分别根据已知序列和接头序列设计的引物）。根据已知序列和接头序列设计的引物）。 4).（1）热不对称交错）热不对称交错pcrtail-pcr的基本原理：的基本原理： 利用目标序列旁的已知序列设计利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（个嵌套的特异性引物（简称简称sp1，sp2，sp3），用它们分别和），用它们分别和1个具有低个具有低tm值的短值的短的随机简并引物（的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，ad，约，约14bp）相组合，根据）相组合，根据引物的长短引物的长短和

14、和特异性的差异特异性的差异设计设计不对称不对称的温度循环的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。，通过分级反应来扩增特异引物。第一次反应包括第一次反应包括5次高特异性、次高特异性、1次低特异、次低特异、10次较低特异性反应次较低特异性反应和和12个热不对称的超级循环。个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使次高特异性反应，使sp1与已知与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行种

15、引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。次超级循环。 第二次反应则将第一级反应的产物稀释第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的pcr反应或热不对称超级循环，反应或热不对称超级循环， 通过上述通过上述3次次pcr反应可获得与已知序列邻近的目标序列。反应可获得与已知序列邻近的目标序列。sp1，sp2，sp3随机引

16、物随机引物 （2）不对称）不对称pcr 3.3.与反转录相关的与反转录相关的pcr扩增扩增 rt-pcr（reverse transcriptase-pcr,rt-pcr): 又称反转录又称反转录pcr, 是以反转录的是以反转录的cdna作模板所进行的作模板所进行的pcr， 可对基因的表达和序列多态性分析。可对基因的表达和序列多态性分析。聚合酶聚合酶cdnapcr扩增aaanaaaana逆转录酶逆转录酶反转录反转录 t t tntcdna第一链第一链mrna1）cdna末端的快速扩增（末端的快速扩增（rapid amplification of cdna end,race) (a) 5race

17、：gsp3设计引物，合成cdna第一链aaaaa.aaaanpoly(a)尾ttttt .tttt5apaaaaa.aaaanttttt .tttt5用rnase降解模板mrna,纯化cdna第一链ttttt .tttt5- - -ttttt .ttttgsp1auapgsp2(b) 3race特异性引物与接头引物对cdna的pcr扩增2)差异显示差异显示pcr:(differential display reverse transcriptase-pcr,ddrt-pcr)使用使用3端的锚定引物（端的锚定引物（t12mn），通过反转录过程，可以将），通过反转录过程，可以将整个整个mrna群体

18、在群体在cdna水平水平上，分成大致相等但序列结构上，分成大致相等但序列结构不同的不同的12亚份群体，这一过程亚份群体，这一过程叫差异显示反转录叫差异显示反转录(ddrt).锚定引物的通式是锚定引物的通式是oligo(dt)12mn，m：a、c、g；n：a、c、g、t共有共有12种种oligo(dt)12mn引物。引物。4.pcr产生产生dna指纹指纹1）多重）多重pcr(multiplex pcr)： 设计多对引物，在同一个设计多对引物，在同一个pcr反应体系中，同时扩反应体系中，同时扩增一份增一份dna样本中几个不同靶区域的样本中几个不同靶区域的dna片断，这片断，这一过程称之为多重一过程

19、称之为多重pcr. 使用使用随机选择随机选择的核苷酸作为的核苷酸作为pcr反应体系中的引物，在反应体系中的引物，在较低较低的复性温度的复性温度下下(36)进行进行pcr。由于非特异性引物与模板上的。由于非特异性引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过pcr扩增反应后可以产生多个扩增反应后可以产生多个pcr产物。经凝胶电泳可以将上产物。经凝胶电泳可以将上述多个述多个pcr反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性增多态性dna(random ampificati

20、on polymorphic dna,rapd)2）随机扩增多态性（）随机扩增多态性（random ampification polymorphic dna,rapd ）是针对基因组是针对基因组dna的限制性酶切片断进行选择性的限制性酶切片断进行选择性pcr扩增而建立扩增而建立dna指纹的技术。指纹的技术。1）基因组）基因组dna的限制性内切酶酶切，的限制性内切酶酶切，2）（与酶切片段末端相对应的）接头与酶切）（与酶切片段末端相对应的）接头与酶切dna片段的连接，片段的连接，3）（含有接头序列和酶切位点序列及延伸序列的）引物对连接）（含有接头序列和酶切位点序列及延伸序列的）引物对连接产物作产物

21、作pcr扩增。扩增。3）扩增片断长度多态性）扩增片断长度多态性（aflp,amplified fragment length polymorphism）gaattccaattgttaaaattgaattctaatgcaatttaatgaattcmnvmnvaatt核心 酶切 延伸序列 位点 序列7.实时定量实时定量pcr( real-time pcr)常规常规pcr技术：技术：对对pcr扩增反应的扩增反应的终产物终产物进行定量及定性分析进行定量及定性分析定量定量pcr技术：技术：对对pcr扩增反应中扩增反应中每一个循环的产物每一个循环的产物进行定量及定性分析进行定量及定性分析（1）原理：）原理： 通过特定设计的通过特定设计的pcr仪器来仪器来实时检测实时检测pcr扩扩增过程中每一轮循环产物的累积数量增过程中每一轮循环产物的累积数量，可以很好，可以很好的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时的推算模板的起始浓度，这种工作方式称为实时定量定量pcr。域值域值：将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所：将