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文档简介

1、复复温温 pcr的的三个热反应过程三个热反应过程 pcr的产量的产量u 每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。每一次循环后模板比前一次循环增加一倍。u dna产量以指数上升，产量以指数上升，n个循环后，达到个循环后，达到2n拷贝。拷贝。4. pcr的反应体系中各组分作用的反应体系中各组分作用dna 模板模板 (template)引物引物 (primer)4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸 （dntp）dna聚合酶聚合酶 （taq）反应缓冲液反应缓冲液mg2+及某些使酶稳定的辅剂及某些使酶稳定的辅剂质量：要求有较高纯度的质量：要求有较高纯度的dna样品样品避免反复冻融，防止降解避免反复冻融，防止降解数量

2、数量: 25-100ng/20l 1）dna 模板模板2）引物）引物 与模板与模板dna的某个局域具有互补碱基特异性的某个局域具有互补碱基特异性的短的单链的短的单链dna片段。片段。3）dntp 4种种 dntp 用量应均衡，否则会减少用量应均衡，否则会减少 taq 酶合酶合成的忠实性，增加错配率。成的忠实性，增加错配率。l最初的聚合酶最初的聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌dna 聚合酶聚合酶 klenow 片段片段, 不耐热，每次加热变性后需重新补加。不耐热，每次加热变性后需重新补加。 聚合温度偏低（聚合温度偏低（37 ），产生非特异性扩增），产生非特异性扩增ltaq dna 聚合酶聚合酶 从水生栖

3、热菌中分离，可在从水生栖热菌中分离，可在70-75生长。生长。 taq 酶扩增效率酶扩增效率: 600bp/min 错配率错配率: 1bp/4000bp (无无3-5外切酶活性外切酶活性) 4）dna聚合酶聚合酶作用作用: 增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。增强酶蛋白的稳定性，维持酶活性。 增加增加 dsdna 的的 tm 值，提高融合温度。值，提高融合温度。 与游离与游离 dntp 形成可溶性复合物，有利形成可溶性复合物，有利 dntp 渗入。渗入。浓度浓度: 1.5-2.0 mmol/l5）缓冲液中的）缓冲液中的mg2+6）循环次数循环次数 循环次数是循环次数是2535次。次。 循环次数过多，产生平台效应；非特异性扩增产物增循环次数过

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