实验十八弓形虫病、住肉孢子虫病和结肠小袋纤毛虫病病原检查

1、实验十九弓形虫病血清学诊断技术一、实验目的及要求掌握弓形虫病血淸学诊断技术，通逑扌弓形虫的检测和鉴定，为防治和预防弓形虫病提供科学依据。二、实验器材弓形虫虫株、小口鼠、恒温箱、离心机、血清、&砂蕊漏斗、纤维素滤膜、试管、载玻片、盖玻片、 显微镜、荧光显微镜、冰冻切片机、吸管、湿盒、微量血凝试验型v反应板、微量加样器、无菌试管、 一次性灭菌注射器、冰箱、胶乳试验玻璃板、常规石蜡切片机、染色缸、水浴锅、微量加样仪、elisa 板、等。跖品：牛理盐水、胰酶、美蓝染液、pbs、弓形虫诊断制剂(iha抗原)、碘酒、70%酒精、无菌牛 理盐水、5%柠檬酸钠、dab、tris盐酸、牛血清白蛋白(bs

2、a)等。三、实验方法步骤和操作要领。弓形虫病血淸学诊断技术主要有以下几种方法:()染色试验 (sabinfeldman dye tese, dt)染色试验(sabin一feldman dye tese, dt)。是弓形虫特有的血淸学诊断法，此法特异性高而且 被认为是标准的诊断方法。其原理是活的弓形虫速殖子与正常血清混合，在37°c作用lh或室温数小时灰, 人部分滋养体市原来的新月形变为圆形或椭圆形，细胞质对碱性美蓝具冇较强的亲和力而被深染。但当 弓形虫与含特异性抗体和补体(辅助因子accessoryfactor. af)的血清混合时，虫体受到抗体和补体的协 同作用血变性，对碱性美蓝不

3、着色。计算着色与不着色虫体比例即可判断结果。1. 辅助因子。存在于止常人新鲜血清内，不耐热。用作辅助因子的血清需预先筛选，即将候选血 清与弓形虫速殖子混合，37°c作用lh后，有90%以上虫体经美蓝染色后，着色者即含有辅助因子(af)。 含辅助因子血清可分装厉于一 20°c保存备用。2. 抗原制备。弓形虫速殖子经腹腔感染小鼠，3d后抽取腹腔液，生理盐水洗涤3次(3000r/minx lomin),收集纯净虫体。也可将小鼠腹腔悬液用胰酶消化，经g?砂蕊漏斗或纤维素滤膜过滤纯化，所获 虫体用辅助因子血淸稀释至每高倍视野50个左右虫体，即为抗原液。3. 美蓝染液。美蓝10g加入9

4、5%乙醇溶液100ml,滤纸过滤,取3n)l加phll的碱性缓冲液(0.53% na2c039.73ml, 1 91%na2b4070. 27ml) 10ml 0 碱性缓冲液临用前配制。4待检血清。新鲜血清需经56°c30min灭活，或直接用牛理盐水倍比稀释后，每管0. lml,4°c中次 日使用。5. 检测。衣稀释血清内每管加上述抗原悬液0. 1ml, 37°c孵育lh,滴加美蓝染液0.02ml/管，继续 温育15 m i n后，口毎管取悬液1滴涂片，加盖玻片镜检。6. 结果判定。计算各管不着色虫体的tt分比，以50%虫体不着色管的血清稀释度为该份被检血清 的兹

5、高抗体滴度。一般认为，抗体滴度1:8为隐性感染;1:956为活动性感染;1:1024以上为急性感染。dt所测抗体是虫体表膜抗原诱导的特显性抗体。本试验易与肉抱子虫抗血淸发牛交叉反应；操作 中需川活山；辅助因子血清筛选较烦琐。(-)荧光抗体试验(fa)荧光抗体试验(fa)该技术将血淸学的特异性和敏感性与显微技术的精确性结合起来，解决了牛物 学上的许多难题。其原理是：用荧光素对抗原或抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以 分析示踪相应的抗原或抗体的方法。1. 直接荧光抗体试验。(1 )标本制备。 切片制备。取被检动物腹般沟淋巴结压印片，冷丙酮4°c固定lomino 洗涤。将固定

6、好的压印片用o.olmol/lph值7.27. 4pbs漂洗,漂洗5次,每次3min,吹干。(2) 直接染色。 在压印片上滴加川0. olmol/lph值& opbs稀释的1： 16的荧光标记的特异抗体。 放于湿盒内，37°c经30min孵育。 用0. olmol/lph值7. 27. 4pbs漂洗，漂洗5次,每次3min,吹干。 用0.01%伊文思兰液复染，在滴加后立即洗去，并吹干。 载玻片上加缓冲甘油并覆以盖玻片封片。 置荧光显微镜下立即观察。 结果判定标准：+ + + +黄绿色闪光荧光+ + + 黄绿色亮荧光+ +黄绿色荧光较弱+仅有暗淡的荧光-无荧光2. 间接荧光抗体

7、试验。(1) 标木制备。 切片制备。将冰冻的被检动物腹股沟淋巴结进行切片，冰冻切片置载玻片上，以一30°c丙酮4°c 固定30mino 洗涤。将固定好的切片以pbs漂洗，漂洗5次，每次3mino(2) 间接染色。 一抗作丿在晾干的标木片上滴加弓形虫抗体，置湿盒，37°c作川30mino 洗涤。以吸管吸取p13s冲洗标木片上的弓形虫抗体，后置人fflpbs屮漂洗，共漂洗5次，每次 3mirio 二抗染色。滴加荧光抗体，置湿盒，37°c染色30mino 洗涤。以吸管吸取pbs冲洗标木片上的荧光抗体，后置人量pbs屮漂洗，共漂洗5次，每次3mino 晾干。将标

8、本片置晾片架上晾干。 镜检。将染色后的标本片置荧光显微镜下观察，先用低倍物镜选择适当的标木区，然后换高倍 物镜观察。以汕镜观察时，可川缓冲甘汕代替香柏汕。木试验应设以下对照：自发荧光对照。己知阳性对照。己知阴性对照。结果判定。同上。(三)间接血凝试验(iha) (ind i recthaemaggiut i nat iontest, ihaat)间接血凝试验(iha) (indirecthaemagglutinationtest, ihmt)亦称被动血凝试验，其操作简单、 价格低廉、敏感性高、特异性强，宜作为辅助诊断、流行病学调杳的方法。反应原理是：将可溶性抗原 致敏于红细胞表而，用以检测相应

9、抗体，在与相应抗体反应时出现肉眼可见凝集。(1) 弓形虫抗原的制备。取小鼠，以碘酒和70%酒精消毒小鼠腹部皮肤，腹腔接种弓形虫速殖 子，4d后乙储麻醉或颈椎脱臼法处死小鼠，以碘酒和70%酒精消毒腹部皮肤，向腹腔内注入无菌牛理 盐水34ml,轻揉腹壁，再抽取腹腔液,2500ipm离心15min,倾去上淸液，在沉淀中加10倍ph 7.2 pbs, 振荡混匀，4°c过夜，10000rpm4°c离心lh,取上淸液加等量1.7%盐水。一20°c以下保存备用。(2) 绵羊红细胞的榦化。 绵羊红细胞的采集和处理。以碘酒和70%酒精消毒健康绵羊颈部皮肤，用5ml的一次性灭菌注 射

10、器采集全血23ml,快速注入含有0.20.3ml5%柠檬酸钠的试管内，轻轻摇匀。2000ip m离心1 omin,加入0.15m ph 7.2 pbs适量进行洗涤，2000rpm离心lomin,再加入0.15m ph 7.2 pbs适量进行 洗涤。如此反复洗涤3次，用pbs配成2.5%的红细胞悬液。 绵羊红细胞的糅化。在2.5%的红细胞悬液屮加入含1%糅酸的pbs使糅酸的终浓度为1/1（）（）（）（） 或1/20000, 3 tc水浴15min,用pbs洗涤3次,再加pbs配成2.5%糅化红细胞。（3）抗原致敏糅化的绵羊红细胞。将2.5%糅化红细胞1份，抗原液1份，ph6.4的pbs液4份 混

11、合，摇匀后室温下放置15min,加1%正常兔血清后，2000rpm离心洗涤2次，再用pbs配成2.5%的 红细胞悬液。4°c下保存备存。（4）待检血清的采集与处理。取待检血清0.5ml置于试管中，加入1%正常兔血清1.5m. 1, 56°c 灭活30min,加入未致敏的绵羊红细胞2ml, 4°c过夜。（5）间接红细胞凝集试验的操作步骤。取处理后的待检血清作倍比稀释，于96孔“v”型反应 板中每孔加入上述倍比稀释的待检血清50 nl,然后加入致敏的绵羊红细胞悬液50h1, 37°c作用2h以 上，观察结果。以1： 64的稀釋度出现50%凝集者判为阳性。同时

12、设立阳性对照和阴性对照。（6）结果判定。 红细胞呈膜状均匀沉于孔底，屮央无沉点或沉点小如针尖，判为“+”。 红细胞呈膜状沉着，但颗粒较粗，屮央沉点较人，判为“+”。 红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，屮央沉点人，判为“+”。 红细胞沉集于中心，周围有少量颗粒状沉着物，判为“ + ”。 红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚，判为“一”。 结果判定：以出现“一”孔的血清最高稀样倍数定为木间接血凝试验的凝集效价°小于或等于 1： 16判为阴性;1: 32判为可疑;等于或人于1： 64判为阳性。兔血清要事先川绵羊红细胞吸收其非特异性凝集素;抗原致敏糅化的绵羊红细胞，在六个月内有效。（

13、四）胶乳凝集试验（la）胶乳凝集试验（la）其原理是在特定条件下将寄生虫抗原与胶乳相连接，使成为颗粒型抗原。这种 抗原与寄生山感染者血清中特异性抗体结合后，即形成抗原-抗体复合物，在有适当电解质存在的条件 下，经过一定时间，胶乳颗粒即凝集在一起，显示肉眼可见的凝集团块，即为阳性反应，否则为阴性反 应。1. 弓形虫抗原的制备。（1）弓形山腹水的制备。小鼠是获得弓形虫最为满意的动物模型。小鼠一般在感染速殖子灰的 4d左右因发病而死亡，此时速殖子大量繁殖并散在于腹腔液中，在其病死前处死，先注入lml灭菌牛 理盐水，吸出腹腔液，再用牛理盐水洗涤12次（有出血者弃去），这样可获得大量的速殖子。一般认 为

14、感染后3d内收集腹水故为适宜，此时口细胞数较少，容易纯化。（2）速殖子纯化方法。 胰蛋白酶消化法。将小鼠腹水3000rpm离心5min,奔上清，加入20倍量体积0.25%的胰蛋白 酶消化液，37°c消化30min, pbs离心、洗涤3次，沉淀再重复消化洗涤1次，取滤液置于白细胞计数 板上镜检，对弓形虫速殖子、白细胞进行计数。 微孔滤膜过滤法。将小鼠腹水3000rpm离心5min,弃上淸，加入适量pbs,制成虫体悬液，将 此悬液加入装有立径为3pm微孔滤膜的滤器，收集滤液，取滤液置于h细胞计数板上镜检，对弓形山 速殖子、h细胞进行计数。 植物血凝素（pha-p）法。将小鼠腹水3000r

15、pm离心5min,弃上清，加入适量pbs,制成虫体悬 液，然后加入植物血凝素，使植物血凝素的终浓度为0.005%o室温下放置30 mine尼龙纱布过滤，取 滤液置于门细胞汁数板上镜检，对弓形虫速殖子、白细胞进行计数。选择虫体冋收率、门细胞淸除率高以及非特异性可溶性蛋白少的纯化方法作为抗原纯化方法。（3）弓形虫抗原的制备。取纯净的弓形虫速殖子，加灭菌双蒸水，混匀，经超声波粉碎或反复冻 融5次，经10（）（x）rpm离心30min,取上清液加等虽1.7%nacl溶液即为可溶性抗原。2. 胶乳及胶乳抗原制备。（1）竣化聚苯乙烯胶乳及其衍生物的制备。 竣化聚苯乙烯胶乳制备。在苯乙烯的乳液聚合过程中加入

16、丙烯酸单体，可获得带有竣基的聚苯 乙烯胶乳。各纽分的重量比为：水/苯乙烯/丙烯酸二180/20/0. 9,引发剂为过硫酸钾，乳化剂为1014 烷皋苯基磺酸钠。应川上述方法所制备的竣化胶乳的浓度约0. 5%,它的直径为0. 50. 6叽 为较适宜的 胶乳颗粒人小。 竣化聚苯乙烯衍生物制备。为提高胶乳颗粒结合蛋白分子的反应能力，可通过碳化二亚胺反应， 将£ 氨基c酸与胶乳相连接，即为竣化聚苯乙烯衍生物。 胶乳抗原制备。通过碳化二亚胺反应，将弓形虫抗原的氨基与竣化聚苯乙烯胶乳衍生物的末端 竣基相连接。交联时，抗原浓度为0. 3mg/ml,室温反应2h。离心洗涤后，悬浮于含0. 1%廉氮钠的

17、0. 05mol/l ph7.6磷酸缓冲液屮，即为胶乳抗原。它的胶乳浓度为10nig/mlo这种颗粒型抗原保存于46°c屮，备川。（2）重氮胶乳抗原制备。先将5%氨基聚苯乙烯胶乳重氮化，然后使重氮胶乳在酸性条件下，加 入等容积抗原。置37°c缓慢搅拌10h,以8000xg离心10 min,去上清液。抗原容积1/2加入20%间苯二 酚（0. 2mol/ l ph8. 3gbs）,混合后,静置2h,用上述gbs以8000xg离心10 min,共3次，最后使成2%胶 乳抗原，并加硫柳汞防腐,保存于4°c,备用。临用前加等容积ph7. 4pbs,使成1%浓度，用于检测。3

18、. 操作方法。吸取已川生理盐水作1： 10稀禅的待检血清约50m,置胶乳试验玻璃板上，加入胶乳 抗原约50m,轻轻摇动，使其充分混匀，5min后观察反应结果。每次检测时，均川阴性和阳性参考血清 作对照。凡la阳性者的血清，应进一步作倍比稀释，以确定其抗体滴度。4. 反应标准。阳性反应：呈现清晰的凝集颗粒；阴性反应：不呈现凝集颗粒。胶乳抗原保心于4°c屮，避免冰冻，有效期可达一年；试验时，将反应板摇动后，若发现待测样木 相互弥混者，需重做；观察反应结果时，应在光亮处进行。（五）放射免疫试验（ria）放射免疫试验（ria）是将放射性同位素检测的高灵做度与抗原抗体反应的高特异性相结合的一种

19、 免疫标记测定技术。其原理是待检标木中某微量抗原与川放射性同位素标记的该种抗原（八g*）竟争结 合有限量的特异性抗体，并形成抗原抗休的可溶性复合物ag-ab和ag*-ab,直至达到平衡状态。1. 加样。先将各浓度标准品和待检动物标本分别加在小试管中，再顺序加入标记抗原和特异性抗 体，保温作用一定时间，让其充分竞争结合。2. 加分离剂。分离剂实际上是一种沉淀剂（目的是将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分开）。常 用的分离剂有抗免疫球蛋白抗体（抗抗体）、聚乙二醇、硫酸钱、含spa的金黄色葡萄球、活性炭等。 离心沉淀。3. 测定放射性强度。分别测定上淸液和沉淀物中的放射活性（用液休闪烁计数仪），可得到

20、f和b 值，计算结合率。4. 绘制标准曲线。以标准品浓度为横座标，与z相应的结合率或b/f值为纵座标绘制标准曲 线.以测定管的放射性强度测得值（仍是b/b+f或b/f）,衣标准曲线上查出相应的待测抗原的含量。放射免疫测定（r1a）所用试剂均山专业单位制成成套试剂盒供应，根据检测对象选用相应的试剂 盒；试剂盒内一般含有标准品、标记抗原，特异性抗体、分离剂和稀释剂等，可按照说明书上的操作程 序进行；具体操作方法因检测项目不同而异。（六）间接辣根过氧化物酶免疫组化方法1病料采集。采集心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、肺门淋巴结、肠系膜淋巴结等组织,置于10% 中性福尔马林屮固定。2. 石蜡切片的制作。纽

21、织块经过修整、系列酒精脱水、二甲苯透明、透蜡和包埋，制成蜡块，切 片厚度4pm o3. 兔抗弓形虫抗体的制备。（1）参照胶乳凝集试验弓形虫抗原的制备。（2）家兔免疫。取健康家兔，首次在家兔两后脚足垫部注射0.5ml弗氏完全佐剂进行基础免疫, 2周后进行抗原免疫，每只家兔川抗原（）.4 ml加等体积弗氏完全佐剂充分乳化后，在家兔两后脚足热部 注射。一周后，进行第二次免疫，每只家兔用抗原0.4ml加等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后，在家兔 踝淋巴结注射免疫，一周后，进行第三次免疫，操作与第二次免疫相同，免疫一周后，取兔耳静脉血 lml,离心.分离血清，用琼扩试验测定免疫血清效价，若血清效价在1： 8

22、以上，最后在兔耳静脉注射 0.2ml抗原进行强化免疫，4天后，心脏、颈静脉采血，分离血清。（3）抗体粗提。免疫血清加等量ph7.07.2的0.0im pbs,滴加饱和硫酸钱溶液至50%浓度， 静置34h后40（x）rpm离心15min,倾去上清液，沉淀物加pbs至原血清量，再以33%饱和硫酸钱重 复离心3次，每次静k 30min, 4000rpm离心15min,最后的沉淀物加少量的pbs洗涤，装入透析袋 中，袋口严密扎紧，先用自來水流动透析5min左右，再置生理盐水或ph7.4的0.01m pbs中透析72h, 透析液的量至少相当于蛋白溶液的100倍以上，期间换透析液3次。透析情况以l%bac

23、l2溶液和纳氏 试剂检查，耍求完全去除硫酸根和较离子，必耍时对通过葡聚糖g50去除。粗提后血淸一 20°c保存备 用。4. 苏木索一伊红染色（he染色）。切片烘烤灰，经过二甲苯脱蜡、高浓度酒楮到低浓度酒精，冋归 到水洗，he染色，中性树胶封片，光学显微镜观察病理组织变化。5. 组织切片辣根过氧化物酶染色方法操作步骤。采集组织，置于10%福尔马林中固定，梯度酒精 脱水（浓度由高到低），二甲苯透明，浸蜡，包埋，切片4pm,烘片，脱蜡，水洗后4°c保存备用。用含 0.5%过氧化氢甲醇处理30min, 0.1%胰蛋口酶消化lominjsn 1 %bsa封闭液,37°c湿盒

24、内封闭30min, 加兔抗弓形虫抗体，37°c湿盒温育lh,洗涤3次，每次5min,加酶标记二抗，37°c湿盒温育1 h,洗涤 3次，每次5min,加dab避光显色反应58min,置于蒸馆水浸洗，苏木素衬染，中性树脂封片，光 镜下观察结果。6. 结果的判定。在被检动物的多个组织内观察到被染成棕褐色弓形虫速殖子存在于巨噬细胞或组 织细胞中，形成假包囊。在组织的坏死区内或周闌可见散在的游离于组织内被染成棕褐色的单个或成对 存在的弓形山速殖子。切片经烘片、脱蜡、水洗灰置于4°c保存备用；滴加封闭液，置于湿盒内封闭后，只将封闭液甩掉, 但不进行洗涤。（七）间接酶联免疫吸附

25、试验（elisa）间接酶联免疫吸附试验（elisa）可检査抗原、抗体或免疫复合物，操作简单，具有高度特异性和 敏感性，且简便经济，结果对定量，适于批量样品的检测。其原理是已知抗原与酶结合，仍保持其免疫 学及牛物化学特性，然后与待测样本中的抗体反应，形成酶标记的免疫复合物，如遇相应底物，即产牛 颜色反应.濒色深浅与样本中相应抗体的量成正比，故可检测样本内相应抗体的有无及其量的多少。1. 弓形虫抗原的制备。参照胶乳凝集试验弓形山抗原的制备。2. 实验步骤。（1）包被。以ph9.6的碳酸盐缓冲液稀释已知抗原（常用5lopg/mdo每孔100200pl （包被 反应板），37°c湿盒温育23

26、h或4°c过夜。（2）洗涤。弃去包被液，反应板川0.1mph7.4pbstween-20液冲洗3次，每次3 min,甩干。（3）封闭。每孔加入loopl封闭液进行封闭，37°clh,甩去孔底液体，pbst洗涤3次，每次3 min。（4）加被检动物血清。用血清稀释液稀释血清（起始浓度100"）,每孔100200pl, 37°c孵育 lho弃去孔底液体，如上冲洗，甩干后加稀释的酶结合物，每孔100 （或200） pl, 37°c孵育12h。（5）加底物显色。如上冲洗甩干反应板，即刻加入新配制的底物溶液，每孔100 （或200） pl, 置暗盒37&

27、#176;c显色20mino（6）终止反应。hrp-opd系统每孔加入2mol/lh2s0.50|il（7）结果判定。目测或用酶标检测仪在490nm波长段测定消光值（od值）。每块板均设阳性对照、阴性对照各两孔和空白对照一孔，以空白孔调零，490nm波长测定od值。 如样品od值/阴性对照值$2.1,样品od值一阴性对照值20.3,则判为阳性;如样品od值/阴性对照 值2.1或样品od值一阴性对照值0.3,均判为阴性。（八）abc elisaabc elisa原理：借助亲和素（avidin）与生物素（biotin）z间极强的亲和力，至少要比抗原和抗 体z间的结合高1万倍，且两者结合迅速而稳定，

28、故用于免疫标记技术中，可提高检测的灵敏度，并可 缩短反应时间。在包埋弓形虫抗原的反应板凹孔中，加被检血清后，即形成抗原-抗体复合物，再加生 物素标记的羊抗人igg（biotin-igg）,即与复合物相给合，再加abc复合物（亲和素-牛物素-酶结合物）， 即lj biotin-igg相结合，最后用相应底物进行显色反应后，用分光光度计测定消光值，即对判读反应 结果。1. 弓形虫抗原的制备。参照胶乳凝集试验弓形虫抗原的制备。2. 生物索标记羊抗人tgg。羊抗人tgg血清经50%和33%饱和硫酸钱各盐析一次，收集y球蛋白部分， 透析后测定蛋h质含量。临用前，以0. lmol/lnallcosfid成l

29、mg/ml浓度。将生物素用n-疑基丁二酰亚胺进 行酯化反应，使成为酯化牛物素，然后用二甲基甲酰胺配成浓度以每mg抗球蛋口加0. 20. 4mg 酯化生物素的比例，将酯化生物索二甲慕甲酰胺溶液加于羊抗人3g中，震荡混匀10min,置于室温中3 4h,然后用pbs透析24h,多次换液后,即为生物素标记物,保存备用。3. 牛物素标记辣根过氧化物酶。按上述牛物素标记羊抗人igg方法，制备牛物素标记酶（hrp-bio）。4. abc溶液配制。在pbst中，分别加入avidin和hrp-bio,使各口的故终浓度为812ag/inl和3仲g /ml,置室温中混匀2030min,即可应用。通常在临用前30mi

30、n配制。5. 操作方法。在已包被抗原的40孔反应板凹孔中，加待检血清，如间接elisa法孵育、洗涤后，加 biotin-tgg,如上法孵育、洗涤，再加abc洗涤,于37°c经15min,洗涤后加底物（邻苯二胺0pd）,置379 经1015min,故后用21110i/lh2so,终止反应，用酶标检测仪测定待检血淸01）值。检测时每一待检血淸作2 份，求得均值。6. 反应标准。以健康人测得的0d均值，力口2个标准差作为标准值（n）。求每一待检血清的0d值（p） 与n值的比值。以p/n21.52.0,作为阳性，否则为阴性。（九）皮内试验1. 弓形虫变应原的制备。用人工感染弓形虫的小白鼠，收

31、集其含有弓形虫的腹水，以离心法将虫 体浓集，将虫体充分洗净，冷冻干燥，研磨成粉，加生理盐水100倍稀释，加入防腐剂（0.01%硫柳汞）。 浸液应不断搅动，在冰箱屮冷浸约需37沢，而后离心沉淀，取其上清夜，用蔡氏滤器除菌或川间歇法 灭菌。滤出液即可作为变应原。2. 皮内反应。用灭菌生理盐水将干燥的弓形山变应原稀释成300500倍后，以结核菌素注射器注 射于猪的耳根部皮内0. 2nd,同时于另一侧耳根部皮内注射生理盐水0. 2nd作对照；在注射后的48小时观 察其丿支肤反应，当红肿而积直径超过15nmi时为阳性，1015mm为疑似，9nmi以下为阴性。木反应只在猪 患木病的晚期才呈现，因此木法仅适

32、用于流行病学调査，以査出慢性及隐性弓形虫病。（十）琼脂扩散原理：琼脂凝胶呈多孔结构，孔内充满水分，1%琼脂凝胶的孔径为0.085刚，允许各种抗原抗体在 其中自山扩散，抗原抗体在琼脂凝胶中扩散时，山近及远形成浓度梯度，当两者比例适当处相遇时，即 发生沉淀反应，反应的沉淀因其颗粒较大，故在凝胶中不再扩散，而形成沉淀带，并成为屏障，继续扩 散而來的相同抗原抗体就使沉淀带加厚而不再向外扩散。通當用于诊断寄生虫病的方法是双向扩散，简 称琼扩。1抗原制备。参照胶乳凝集试验弓形虫抗原的制备。2. 操作方法。収琼脂lg,加生理盐水100ml,在沸水浴中溶解，待稍冷时倒入玻璃培养皿，使成3mm 厚度，冷却后用打

33、孔器在琼脂上打孔，孔排列成梅花状，即中间一个孔，周围6个孔，中央孔与周围孔 间距离均为3mm,周围各孔间相互距离人致相等。然后将培养皿在酒精灯上加热，使其底部琼脂略有溶 解，以便使孔周围琼脂与培养hil底紧密粘合。在屮央孔屮加满抗原，周围孔中加满被检血清，每孔一份 血清，盖上iiil盖，置37°c温箱屮12天，取出在深色背景前和斜射照明下观察屮央孔与周围孔间有无口 色线。3. 结果判定。被检血清孔与中央孔间有白色沉淀线时，判为阳性，无时为阴性。（ ）免疫金银染色法（immunogo id-si i ver staining, igss）其原理是将血清学方法和显微镜方法相结合的一种新的

34、免疫标记技术，它的示踪标记物是胶体金 （colloidalgold）o胶体金是山氯金酸（haucl）在还原剂（如白磷、抗坏血酸、糅酸等）作用下聚合成一定 人小（2040nni）的颗粒，形成带负电荷的疏水胶体溶液（金溶胶）。山于静电作用而成为比较稳定的胶体 状态，故称为胶体金它能和生物人分子（如抗人igg）相结合成为金标记抗体，能与抗原-抗体复合物结 合，经银显影处理后，使金颗粒周围吸附人量银颗粒，在光镜下可见到黑褐色的金银颗粒，即为阳性反 应，否则为阴性反应。1. 固相抗原制备。収弓形虫，充分洗涤后，作成石蜡切片用于试验。2. 金标记抗体制备。（1）金溶液制备。煮沸220ml双蒸水，加入2.8

35、ml新鲜配成的1%柠檬酸钠溶液，然后在剧烈搅拌下 加0. 5ml 4%hauc14溶液，搅拌30min,即可获得大颗粒（2040nm）金溶胶，它的故大吸收峰为528nm0这 种规格的金溶胶适用于光镜和扫描电镜。（2）金溶胶标记兔抗人tgg。 金标记兔抗人tgg。将10ml金溶胶置于容器中，在磁力搅拌卜s加入66 pg兔抗人tgg, lominjn, 加5%牛血淸口蛋白（bsa）溶液2nd,使其最终浓度为1%,然后将标记物进行纯化。 标记物纯化。a凝胶过滤法。将上述标记物移入透析袋，用peg （分子量20000）浓缩至原容积的1/10,置于4°c用 8000r/min离心15min,将上淸液装于0. 8 x 20cm聚丙烯葡聚糖凝胶（sephacryls-4