第2章 巴西菇菌丝体的培养

1、第2章 巴西菇菌丝体的培养2.1 实验材料2.1.1 实验菌株2.1.2 实验试剂与仪器2.2 实验方法2.2.1 巴西菇菌种的制备与培养2.2.2 巴西菇麦粒菌的制备和培养2.2.3 老化对巴西菇菌种、麦粒菌的影响2.2.4 巴西菇菌种最佳保藏温度探究2.2.5 巴西菇麦粒菌最佳保藏温度探究 2.2.6 巴西菇菌丝体实验室保藏方法的探究2.3 实验结果与分析2.3.1 老化对巴西菇菌种、麦粒菌的影响2.3.2 巴西菇菌丝体最佳保藏温度2.3.3 巴西菇麦粒菌最佳保藏温度2.3.4 巴西菇菌丝体实验室保藏方法2.4 本章小结第2章 巴西菇菌丝体的培养巴西菇在实际推广的过程中，麦粒菌的接种和制作

2、发酵料时间要相互配合，但是由于麦粒菌的生长情况和发酵料的发酵程度是不固定的，因此容易出现麦粒菌已生长完毕，而发酵料却并未发酵完成的情况，这样的后果之一便是接种时，菌种已发生老化。为避免这种情况的发生，需要将已长好的巴西菇麦粒菌进行保藏，但是由于巴西菇特殊的生物学性质，适用于多数真菌的低温保藏方式并不适合巴西菇菌，4的贮藏环境会使巴西菇菌种失去生物活性，所以需要对巴西菇菌种的最佳保藏温度进行探究，来适应发酵料不固定的发酵时间。而在进行温度探究实验之前，首先需要了解老化的巴西菇菌种对后期栽培的影响。另外，根据文献报道，探究液体石蜡室温长期保藏菌种在实验室是否可行。在菌种的选择方面，经过实验室前期实

3、验基础，在从中科院购进的三株菌株中筛选出了生长状态良好、不易染菌的巴西菇菌株，进行接下来的实验。2.1 实验材料2.1.1 实验菌株巴西菇菌种购置于中国科学院微生物研究所，菌株编号 5.0730 。2.1.2 实验试剂与仪器巴西菇菌种、20ml试管、马铃薯、胡萝卜、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、维生素B1、硫酸镁、电磁炉、不锈钢锅、纱布、玻璃棒、电子天平、恒温培养箱、小麦、石灰、石膏、1000ml烧杯、500ml细口瓶、电子称、聚丙烯袋、标签纸、棉塞等2.2 实验方法2.2.1 巴西菇斜面菌种的制备与培养2.2.1.1综合PDA 琼脂培养基的制作 综合PDA 琼脂培养基的配方如下:马铃薯浸提液 2

4、0 %葡萄糖 20 %琼脂 20 %KH2PO 4 2 %MgSO4·7H2O 1 %维生素 B 1 微量pH 6.0 具体制作步骤为：将马铃薯清洗、去皮后，用电子天平称取 100g 切成规则的小方块（0.5cm 左右，便于营养物质溶出），放入盛有 500ml 蒸馏水的不锈钢锅内煮沸 30min，边煮边用玻璃棒搅拌以防锅底局部温度过高造成糊底。待溶液冷却至室温时，用八层纱布过滤，得到马铃薯浸提液。将浸提液用蒸馏水定容至500ml后转移至刷好的不锈钢锅，继续放置电磁炉上持续加热，同时加入20g琼脂，待琼脂完全融化后加入葡萄糖20g、 KH2PO4 2g、MgSO4·7H2O

5、1g、维生素 B1 微量并用玻璃棒搅拌均匀，趁热进行试管分装。2.2.1.2 斜面培养基制备将20ml试管反复刷洗干净后放入60电热干燥箱中烘干，将配制好的综合 PDA 培养基趁热分装于试管中，装样量约为试管体积的 1/4，塞上胶塞，用橡皮筋将7 个试管绑一起，用报纸包住试管口，最后试管口朝上放于铁框中进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为0.1MPa，121，20min。灭菌后，将试管倾斜放置于平面上，使试管中液体形成斜面。放置24h后，置于4冰箱内，待用。2.2.1.3 接种在巴西菇菌种转接的全过程均在无菌操作台中进行，一管巴西菇菌种可接10-15 只试管。将无菌操作台经紫外灯照射灭菌 30min，

6、与此同时将放于4冰箱的培养基取出，使其达到室温，用75%的酒精棉擦拭菌种试管后放入无菌操作台中，点燃酒精灯，纵横交替灼烧接种环3次后，完成菌种的转管，转管结束后灼烧试管口及胶塞并用记号笔标明接种日期。2.2.1.4菌丝体的培养 根据巴西菇的生物学特性可知，巴西菇菌种在 22-26时最适宜生长，此外根据文献报道，巴西菇菌丝体在避光条件下的长势强于光照培养，因此本实验将转接的菌种置于 25恒温培养箱中进行避光培养。2.2.2 巴西菇麦粒菌的制备和培养2.2.2.1 麦粒培养基的配方小麦粒 98%石膏 1%生石灰 1%pH 自然2.2.2.2麦粒培养基的制备选择品质优良无霉变的陈年小麦粒，使用1%

7、白石灰水浸泡 15-20h，捞出后将麦粒平铺在牛皮纸上自然晾干，5-10h后再次用1% 白石灰水浸泡 15-20h，捞出后使用电磁炉加热煮沸，煮30min左右至无白心，捞出后沥干至不粘手，按重量加 1% 石灰和 1% 石膏（pH=6-7）搅拌均匀后得到小麦粒培养基。2.2.2.3 消毒灭菌将500ml细口瓶反复刷洗干净后放入60电热干燥箱中烘干，按照瓶口大小使用无纺纱布和脱脂棉制作瓶塞，将搅拌均匀的小麦粒培养基分装于细口瓶中，装样量达到细口瓶瓶颈即可，塞上瓶塞，用报纸包住瓶口，放入铁框中进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为0.1MPa，121，120min。灭菌后，待培养基冷却至室温后，持续放置48h

8、，若仍无霉变即可使用。2.2.2.4接种麦粒培养基接种的全过程均需在无菌操作台中进行，一管巴西菇菌种可接3-4瓶麦粒培养基。首先将无霉变的麦粒培养基放于无菌操作台中经紫外灯照射灭菌30min，灭菌后将菌种拿入操作台中并用75%的酒精棉擦拭。点燃酒精灯后，纵横交替灼烧接种勺3次，待接菌勺冷却至适宜温度后刮取适量菌种试管近口处的培养基，放于小麦粒培养基中使菌丝面与小麦粒相接触。接种结束后，将瓶口和瓶塞靠近酒精灯附近，反复灼烧后将瓶塞塞好，并用记号笔标明接种日期。2.2.2.5 菌丝体的培养将接菌后的麦粒培养基置于25恒温培养箱中，避光培养。2.2.3老化对巴西菇菌丝体、麦粒菌的影响2.2.3.1不

9、同老化程度巴西菇菌种转管后对菌种的影响分别对保藏120d、90d、60d、30d的四批次的巴西菇菌种进行转管，每组做5个平行样，从萌发时间、满管时间、生长速度、长势、菌落边缘整齐度、菌丝体密度、气生菌丝量等指标判断老化对巴西菇菌种的影响。2.2.3.2不同老化程度巴西菇菌种接入麦粒培养基后的生长情况分别对保藏120d、90d、60d、30d 四批次的巴西菇菌种接入麦粒培养基中，每组做三个平行样，从萌发时间、满瓶时间、生长速度、长势、菌落边缘整齐度、菌丝体密度、气生菌丝量、染菌率等指标判断老化对巴西菇麦粒菌的影响。2.2.3.3不同老化程度巴西菇麦粒菌接入发酵料的生长情况分别将保藏60d、30d

10、、0d的巴西菇麦粒菌接入发酵料中，每组做三个平行样，从萌发时间、满袋时间、生长速度、长势、菌落边缘整齐度、菌丝体密度、气生菌丝量、杂菌覆盖量等指标判断老化的麦粒菌在接入发酵料后的影响。2.2.4 巴西菇菌种最佳保藏温度探究2.2.4.1不同温度下巴西菇菌种的保藏情况将长满的巴西菇菌种分别置入10、15、20、25 的恒温培养箱中，保藏30d后，观察其保藏效果，记录菌丝白密程度、培养基含水量、暗黄斑块、菌丝脱壁、萎缩程度等指标。2.2.4.2 不同保藏温度下的巴西菇菌种活力采用培养观察法判断菌种质量。从四种保藏温度的菌种中随机选取3管进行转管实验，每管再做3个平行样，将接菌后的培养基放入25的恒

11、温培养箱中进行避光培养。从萌发时间、满管时间、生长速度、长势、边缘整齐度、菌丝体密度、气生菌丝量等指标判断菌种活力。菌丝生长快、菌落边缘整齐、健壮浓密的菌种具有较强的活力。2.2.5 巴西菇麦粒菌最佳保藏温度探究 2.2.5.1 不同温度下巴西菇麦粒菌的保藏情况将长满的巴西菇麦粒菌分别置入10、15、20、25 的恒温培养箱中，保藏30d后通过对比各组菌丝白密程度、培养基含水量、黄色积液、菌丝脱壁、萎缩程度等情况，判断最佳保藏温度。2.2.4.2 不同保藏温度下的巴西菇麦粒菌活力采用培养观察法判断菌种质量。保藏期结束后，从四种保藏温度的菌种中随机选取3瓶，从菌瓶中挑取一小块接入PDA综合培养基

12、中，每瓶做3个平行样，将接菌后的试管放入25的恒温培养箱中进行避光培养。从萌发时间、满管时间、生长速度、长势、边缘整齐度、菌丝体密度、气生菌丝量等指标判断麦粒菌活力。菌丝生长快、菌落边缘整齐、健壮浓密的菌种具有较强的活力。2.2.6 巴西菇菌丝体实验室保藏方法的探究用液体石蜡分别在4 和常温条件下保藏菌种，将常温下保藏的菌种设为对照组，四个月后转管，观察转管后菌丝体的生长情况，从萌发时间、满管时间、生长速度、长势、边缘整齐度、菌丝体密度、气生菌丝量等指标判断菌种活力。2.3 实验结果2.3.1 老化对巴西菇菌种、麦粒菌的影响2.3.1.1不同老化程度巴西菇菌种转管后对菌种的影响由表 2-1 可

13、知，保藏时间不同的4组菌株在转管后的生长情况各不相同，常温保藏30d的菌株转管后第2天开始萌发，平均17天左右满管，对比其他组，该组长势粗壮，菌落边缘整齐，菌丝浓密，气生菌丝量也较多，生长速度最快为7.64mm/d；保藏60d的菌株转管后除了菌丝密度较差以外，其他指标与30d不相上下；保藏了90d的菌株转管后平均满管时间较长，长势一般，菌丝密度一般，气生菌丝量较多；保藏了120d的菌株转管后平均萌发时间为4d，满管时间最长，长势细弱，菌落边缘较整齐，菌丝稀疏，气生菌丝量较少，生长速度最慢为5.41mm/d。表2-1 不同老化程度巴西菇菌种转管后的生长情况Table 2-1 Growth con

14、ditins of Agaricus blazei Murrill on comprehensive PDA medium菌株萌发时间满管时间生长速度长势菌落边缘整齐度菌丝密度气生菌丝量120d4245.41241290d3225.91353460d2187.22554530d2177.645555注:萌发以见白色气生菌丝为准；满管时间从萌发当天算起，以菌丝体完全覆盖培养基为准；生长速度（mm/d）测量斜面培养基长度，以萌发时间为起始时间，满管时间为终点，计算出菌丝的生长速度；长势 1-5 分别表示细弱、弱、中、壮、粗壮；菌落边缘整齐度以接种点为基准，以向四周扩散是否整齐作判断，1-5分别表示

15、不整齐、较不整齐、一般、较整齐、整齐；菌丝密度 1-5 分别表示稀疏、疏、中、密、浓密；气生菌丝量是以菌丝高于培养基表面的厚度以指标，1-5分别表示少（1-2mm）、较少（2-3mm）、中（3-4mm）、多(4-5mm)、较多（5mm）。以上所有指标均为计算5个平行样的平均值。2.3.1.2不同老化程度巴西菇菌种接入麦粒培养基后的生长情况由表 2-2 可知，相比于斜面培养基培养培养的巴西菇菌丝体，麦粒原种培养基培养的菌丝体更加浓密粗实，在从上往下生长时，菌落边缘也更加整齐。常温保藏30d的菌株接入麦粒培养基后第2天开始萌发，平均12天左右满瓶，对比其他组，该组长势粗壮，菌丝浓密，气生菌丝量较多

16、，生长速度最快为8.33mm/d；保藏60d的菌株接入培养基后，长势稍差，生长速度一般；保藏了90d的菌株接入麦粒培养基后，平均满瓶时间较长，长势一般，菌丝体生长速度较慢；保藏了120d的菌株转管后平均萌发时间为4d，满瓶时间最长，长势细弱，生长速度最慢为5.00mm/d，另外染菌率有所提高。表 2-2 不同老化程度巴西菇菌种接入麦粒培养基后的生长情况Table 2-4 Growth conditins of Agaricus blazei Murrill on comprehensive PDA medium菌株萌发时间满瓶时间生长速度长势菌落边缘整齐度菌丝密度气生菌丝量染菌率（%）120d

17、4205.0025443390d3185.554555060d2147.144555030d2128.3355550注:萌发以见白色气生菌丝为准；满瓶时间从萌发当天算起，以菌丝体完全覆盖培养基底部为准；生长速度（mm/d）当菌丝吃料2 cm左右画起始线，记录起始时间，待菌丝接近满瓶时画终止线，测量菌丝生长的长度，计算出菌丝的生长速度；长势 1-5 分别表示细弱、弱、中、壮、粗壮；菌落边缘整齐度以接种点为基准，以向四周扩散是否整齐作判断，1-5分别表示不整齐、较不整齐、一般、较整齐、整齐；菌丝密度 1-5 分别表示稀疏、疏、中、密、浓密；气生菌丝量是以菌丝高于培养基表面的厚度以指标，1-5分别表

18、示少（1-2mm）、较少（2-3mm）、中（3-4mm）、多(4-5mm)、较多（5mm）；染菌率（%）表示3个平行样间，染菌的几率。以上所有指标均为计算3个平行样的平均值。2.3.1.3不同老化程度巴西菇麦粒菌接入发酵料的生长情况由表 2-3 可知，不同老化程度的巴西菇麦粒菌接入发酵料后，均在第二天萌发，菌丝体满瓶后直接接入发酵料的组别满袋时间最短，生长速度最快为2.14cm/d，菌丝体长势粗壮，菌落边缘整齐，菌丝浓密，气生菌丝量较多，有较少杂菌覆盖；保藏30d的麦粒菌接入发酵料后，满袋时间较长，生长速度一般为1.67cm/d，长势一般，有少量杂菌覆盖；保藏60d的麦粒菌接入发酵料之后，生长

19、速度较慢为1.57cm/d，长势较弱，菌丝密度一般，杂菌覆盖量较多。表2-3不同老化程度巴西菇麦粒菌接入发酵料的生长情况Table 2-3 Growth conditins of Agaricus blazei Murrill on comprehensive PDA medium发酵料萌发时间满袋时间生长速度长势菌落边缘整齐度菌丝密度气生菌丝量杂菌覆盖量60d2191.573444430d2181.67455530d2142.1455551注:萌发以见白色气生菌丝为准；满袋时间从萌发当日算起，以菌丝体完全覆盖培养料为准；生长速度（cm/d）以萌发时间为起始时间，待菌丝体长满发酵料底层的时候，

20、记录终止时间，测量菌丝生长的长度，计算出菌丝的生长速度；长势 1-5 分别表示细弱、弱、中、壮、粗壮；菌落边缘整齐度以接种面为基准，以上下方向扩散的整齐度，1-5分别表示不整齐、较不整齐、一般、较整齐、整齐；菌丝密度 1-5 分别表示稀疏、疏、中、密、浓密；气生菌丝量是以菌丝高于培养基表面的厚度以指标，1-5分别表示少（1-2mm）、较少（2-3mm）、中（3-4mm）、多(4-5mm)、较多（5mm）；杂菌覆盖量表示杂菌覆盖培养料的数量，1-5分别表示少、较少、一般、多、大量。以上所有指标均为计算3个平行样的平均值。2.3.2 巴西菇菌丝体最佳保藏温度2.3.2.1不同温度下巴西菇菌种的保藏

21、情况由表 2-4 可知，不同温度下巴西菇菌丝密度基本保持不变；培养基含水量在10时保持在最佳状态，20和25时含水量极低；10时几乎不会生成暗黄斑块，20和25保藏条件下出现大量黄色斑块；10时仍有大量气生菌丝体，15也有较多的气生菌丝体，而20和25的气生菌丝量相对较少；10时培养基脱壁、萎缩的面积相对较小，15和20培养基萎缩面积依次递增，在25，培养基脱壁、萎缩面积达到最大，达到5cm2。表2-4不同温度下巴西菇菌种的保藏情况Table 2-4 Growth conditins of Agaricus blazei Murrill on comprehensive PDA medium保

22、藏温度菌丝密度培养基含水量暗黄斑块气生菌丝量菌丝脱壁、萎缩程度1053151155234220514332551435注:菌丝密度 1-5 分别表示稀疏、疏、中、密、浓密；培养基含水量以瓶壁内出现的水滴数量为指标，1-5分别表示基本没有、较少、中、较多、大量；暗黄斑块以培养基上出现斑块的面积为指标，1-5分别表示（1cm2）、较小（1-2cm2）、中（2-3cm2）、大（3-4cm2）、较大（4cm2）；气生菌丝量是以菌丝高于培养基表面的厚度以指标，1-5分别表示少（1-2mm）、较少（2-3mm）、中（3-4mm）、多(4-5mm)、较多（5mm）；菌丝脱壁、萎缩程度以培养基脱离管壁的面积为

23、指标，1-5分别表示小（1cm2）、较小（1-2cm2）、中（2-3cm2）、大（3-4cm2）、较大（4cm2）。2.3.2.2 不同保藏温度下的巴西菇菌种活力保藏温度萌发时间满管时间生长速度长势菌落边缘整齐度菌丝密度气生菌丝量10152025表2-5不同保藏温度下的巴西菇菌种活力2.3.3 巴西菇麦粒菌最佳保藏温度2.3.3.1不同温度下巴西菇麦粒菌的保藏情况由表2-6可知，不同温度下保藏的巴西菇麦粒菌的菌丝密度基本保持不变，只有25保藏的菌丝密度相对较稀疏；培养基的含水量在10条件下保持了最佳状态，20和25时含水量极低；10时几乎不会产生黄色积液，20和25保藏条件下出现大量黄色积液；

24、气生菌丝体在四种保藏温度下呈现依次递减的趋势，10仍有大量气生菌丝体，25的气生菌丝量几乎没有；10时培养基脱壁、萎缩的面积相对较小，15和20培养基萎缩面积相差无几，而在25条件下，其培养基脱壁、萎缩情况严重，达到125cm2。表2-6不同温度下巴西菇麦粒菌的保藏情况Table 2-6 Growth conditins of Agaricus blazei Murrill on comprehensive PDA medium保藏温度菌丝密度培养基含水量黄色积液气生菌丝量菌丝脱壁、萎缩程度1053151155234220514322541514注:菌丝密度 1-5 分别表示稀疏、疏、中、密、浓密；培养基含水量以瓶壁内出现的水滴数量为指标，1-5分别表示基本没有、较少、中、较多、大量；黄色积液以培养基上出现黄色积液的面积为指