实验六蛋白质的定量分析-双缩脲法测定血清总蛋白_百(精)

1、实验 双缩腺法测定蛋白质浓度实验目的1.学习分光光度法测定的原理和方法2.学习蛋白质含量测定的常见方法及原理3.掌握双缩腺法测定蛋白质含量的方法一、分光光度法测定的原理和方法一、分光光度法的基本原理根据物质对光的选择性吸收（吸收光谱） 质进行定性定量分析。对物二、吸收光谱主要分为：红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.5-1000(im,主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范 I 韦 I200-400nm,可用于结构鉴定和定暈分析。可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400-750nm,主要用于有色物质的分析。三、分光光度法的主要研究方式1. 比较吸

2、收光谱曲线2. 比较最大吸收波长蛋 Il 质的最人吸收波长 7j280nm,核酸的最大吸收波长为 260nm3A纯 DNA 今沁=183.比较吸光度的比值四、分光光度仪的工作原理Intensity ofIntensity ofincidenttransmitUdlightrXZXH2N-CO-NH-CO-NH2+NH3在碱性溶液屮，双缩啄能与 C/+形成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比。双缩咏法测定双缩腺法测定蛋白质*双缩腺显色反丿0 乂和蛋|质屮肽键数成止比关系， 与蛋白质的种类、分子匾及氨韓酸的组成无明显关 系，各种蛋I 质的显色程度舉本相同：巫复性好， 干扰少，常见干扰人多可以

3、避免：便用单一的稳定 试剂，操作简便、快速，适于乎工和口动化分析。缺点是灵墩度较低。但检出限为 0.217mg 蛋白质 /ml,这相当于 70g/L 的血淸 324RL,已能满足临 床生化检验的需要。因此,是临床测定血清总蛋白 质首选的仗方便、实用的常规方法。Folin-酚试剂法（Lowry法）测定蛋白质浓度 Folin 酚反应足在双缩啄反应的基础上， 引述 Folin 试 剂 （磷锢酸一磷鹄酸试剂），蛋门质一铜络合物能还 原磷钥酸一磷铸酸试剂，牛成蓝色物质。在一定条 件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法 灵敏1020 倍，较双缩啄法灵敏 100 倍

4、。其不足之处是此反应受多种囚索干扰（Tris 缓冲剂、 蔗糖、硫酸钗、疏基化合物、酚、柠檬酸）。 Folin-酚试剂包插甲、乙试剂。英中乙试剂仅在酸 性 PH下稳定，但上述还原反应只在 pH10 的情况下 发牛，故乙试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必 须 M即混匀，以便磷钳酸磷鸽酸试剂被破坏之前， 还原反应能发生。考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度考马斯亮蓝在一怎蛋白质浓度范围内，蛋 白质和染料结合符合比尔泄律，因此可以 通过测定染料在595nm处光吸收的增加量 得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅 速、干扰物质少、灵敏度髙（比Lowry法灵 敏4倍）o强碱性缓冲剂和去污剂会有颜色干扰，町 校正。

5、但大量去污剂的影响不易消除。Coomassie Dye-Based蛋 白质定 量Amax =595nm总蛋白定量分析一BCA （Bicinchoninic acid,二辛可宁酸、二竣基二哇R#）:准确灵敏： BCA试剂的蛋白质测定范围是20 2000pg/ml:Micro BCA 试剂测定范围是 0.520|ig/ml 快速：45 分钟内完成测迫，比经典的 Lowry 法快 4 倍 而且更加方便经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大 大节约样品和试剂用量不受样品中离子型和非离子型去污剂影响检测不同蛋口质分子的变异系数小于考马斯亮蓝基本原 z碱性条件卜，蛋白将 Cu2+还原为 Cu+, C

6、u+与 BCA 试剂形成紫颜色的络合物，测立其/l:562nm 处的 吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋门 的浓度。STEP1.Protein + Cu_。比二Cu三、双缩服法测定蛋白质含量一、操作步骤1.収 15 支试管，按下表编号、加试剂管号0123456样品牛血清白 蛋白(mg)02mg/mL牛血清白蛋口体枳(mL)0待测液体 枳(mL)3.0*蒸饰水(mL)3.01.20.600OD5402各管混匀后，加入双缩腋试剂 3.0mL,37C 反应 30min。三、双缩服法测定蛋白质含量3以 0

7、号管调零，测定各 ff540nm 光吸收值。二、结果处理1 绘制标准曲线以牛血清白蛋白含量为横坐标，OD540 为纵坐标， 绘制标准曲线。2 样品的计算根据样品的 OD540 从标准曲线上査得样品的蛋门质 含量（mg）,再根据样品的体积计算出样晶的浓度。三、注意事项1 须于显色后 30min 内测定，且备管由显色到比色时间 应尽可能一致。2样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。3 比色杯的使用。四、分光光度计的使用SPtCTttOPHOTOMHfaliniC3 2000仪器操作键介绍“方式设定”键（MODE）：用于设置测 试方式透射比（T）、吸光度（A）、 已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜 率（F）“100%”键：用于门动调整 100.0%T（100.0 透射比）或 0ABS（零吸光度）“0%”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分析波长I3样品测试操作1打开电源开关，使仪器预热20分钟2用波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波 长位置上3按“方式键”（MODE）将测试方式设置为透射比（T）4将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中5打开样品室盖，将盛勺溶液的比色皿和黑休分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖6盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，