MTT法及细胞凋亡检测学习课程

1、MTT法检测细胞相对存活率（教材95页）第1页/共15页第一页，编辑于星期六：九点 二十三分。【方法与步骤】（1）传代5104个/100ml 人子宫颈癌细胞HeLa于96孔板， 37C培养过夜；（2）每孔加入不同剂量的大蒜素（1、5、10 ml），每种剂量加三孔，以药物溶剂作对照， 37C培养0.5h；（3）于各孔加入10ml 5mg/ml MTT， 37C培养1h；（4）吸弃培养液，各孔加入100ml DMSO，振荡培养板， 37C培养10min；（5）用酶联仪测定光密度值（以空白调零），通过与对照组比较得到实验组的存活率。【结果与观察】 （1）加MTT后，倒置相差显微镜下观察可见黄色的MT

2、T被还原成紫蓝色颗粒，加DMSO后紫蓝色颗粒溶解； （2）各组OD值取平均值后，以下式计算存活细胞百分数： 存活细胞%=（OD实验/OD对照）100% 第2页/共15页第二页，编辑于星期六：九点 二十三分。对照组对照组第3页/共15页第三页，编辑于星期六：九点 二十三分。实验组实验组第4页/共15页第四页，编辑于星期六：九点 二十三分。 1ul10ul1ul5ul10ul1ul5ul 第1组 2 3 4 5 6 7 89105ul10ul10ul大蒜素大蒜素剂量剂量 对照组对照组第5页/共15页第五页，编辑于星期六：九点 二十三分。细胞凋亡诱导分析检测技术第6页/共15页第六页，编辑于星期六：

3、九点 二十三分。Cell Death第7页/共15页第七页，编辑于星期六：九点 二十三分。细胞坏死初期，胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂。随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，故坏死组织或细胞在苏木精/伊红染色切片中，胞质呈均一的深伊红色，原有的微细结构消失。在含水量高的细胞，可因胞质内水泡不断增大，并发生溶解，导致细胞结构完全消失，最后细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应。表15-2 细胞凋亡和细胞坏死的区别区别点细胞凋亡细胞坏死起因生理或病理性病理性变化或剧烈损伤范围

4、单个散在细胞大片组织或成群细胞细胞膜保持完整，一直到形成凋亡小体破损染色质凝聚在核膜下呈半月状呈絮状细胞器无明显变化肿胀、内质网崩解细胞体积固缩变小肿胀变大凋亡小体有，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬无，细胞自溶，残余碎片被巨噬细胞吞噬基因组DNA有控降解，电泳图谱呈梯状随机降解，电泳图谱呈涂抹状蛋白质合成有无调节过程受基因调控被动进行炎症反应无，不释放细胞内容物有，释放内容物。第8页/共15页第八页，编辑于星期六：九点 二十三分。图左，正常胸腺细胞；右，凋亡胸腺细胞（注意凋亡小体） 第9页/共15页第九页，编辑于星期六：九点 二十三分。Ho.33342与PI荧光双染显示凋亡与坏死细胞（教材168页）

5、第10页/共15页第十页，编辑于星期六：九点 二十三分。【方法与步骤】（1）传代5104子宫颈癌细胞HeLa于含有盖玻片的24孔板， 37C培养过夜；（2）每孔加入5ml的大蒜素，以药物溶剂作对照， 37C培养0.51h；（3）加入PBS，洗细胞5min X 3次；（4）取出细胞爬片，加入50ml荧光染料Heochst 33342/PI混合液， 室温避光放置30min；（5）加入PBS，洗细胞5min X 3次；（6）用吸水纸吸取爬片上的液体，滴加5ml碱性甘油于载玻片上，将爬片上的细胞面向下盖于碱性甘油中，避免产生气泡，树胶封固后荧光显微镜观察。 第11页/共15页第十一页，编辑于星期六：九点 二十三分。1 2 3 4 5 6 ABCD 1组组 2组组 3组组 4 5 6 7 8 910第12页/共15页第十二页，编辑于星期六：九点 二十三分。【结果与观察】 在紫外光激发下，HeLa正常细胞发出柔和的蓝色荧光，凋亡细胞细胞核发出明亮的蓝色荧光，坏死细胞发红色荧光； 正常细胞核荧光均匀，而凋亡细胞核凝集的染色质发强蓝色荧光，周围可见带蓝色荧光的凋亡小体。第13页/共1