蛋白质多肽类药物传递的研究进展

1、 Recent Advances in R/D Protein and Peptide Drug Delivery 蛋白质蛋白质 / 多肽类药物传递的研究进展多肽类药物传递的研究进展 1 背背 景景2 蛋蛋 白白 质质 / 肽肽 类类 药药 物物 传传 递递 存存 在在 的的 问问 题题3 新新 型型 蛋蛋 白白 质质 / 肽肽 类类 药药 物物 与与 制制 剂剂 的的 研研 发发 4 蛋蛋 白白 质质 / 肽肽 类类 药药 物物 进进 入入 人人 体体 的的 新新 给给 药药 途途 径径 人类基因组计划人类基因组计划 ( Human Genome Project ) 1990.10 - 20

2、03.3 1990.10 - 2003.3 美国美国, , 英国英国, , 法国法国, , 德国德国, , 中国中国, , 日本日本 完成人类基因组完成人类基因组 DNA DNA 的的 30 30 亿个碱基对亿个碱基对 ( ( bases) bases) 的测序的测序 中国承担中国承担 1% 1% 人类基因测序任务人类基因测序任务 (“ (“中国卷中国卷”)”) 人类第一次在分子水平上全面地认识自我人类第一次在分子水平上全面地认识自我 人类生命科学研究进入一个崭新的时代人类生命科学研究进入一个崭新的时代 - 后基因组时代后基因组时代 ( post - genome era )二十一世纪的生物医

3、药领域将发生革命性的变化二十一世纪的生物医药领域将发生革命性的变化以蛋白质以蛋白质 / 肽为基础的创新药物肽为基础的创新药物 - 基因治疗药物基因治疗药物 基因工程药物基因工程药物 基因工程疫苗基因工程疫苗 (gene vaccine , DNA vaccine) ) 反义寡核酸药物反义寡核酸药物 将被迅速地研究开发将被迅速地研究开发FDA 已已 批批 准准 417 个个 protein / peptide 药药 物物 / 疫疫 苗苗 干扰素干扰素 Interferon 白细胞介素白细胞介素 Interleukin-2 生长因子生长因子 KGF 集落刺激因子集落刺激因子 GM-CSF 凝血因子

4、凝血因子 BeneFIX 重组胰岛素重组胰岛素 Humulin 重组人生长激素重组人生长激素 rhFSH 单克隆抗体单克隆抗体 Zenapax 多克隆抗体多克隆抗体 Thymoglobulin 基基 因因 工工 程程 药药 物物 的的 化化 学本学本 质质 是是 蛋蛋 白白 质质 或或 肽肽蛋蛋 白白 质质 和和 肽肽Protein and PeptideProteins and Peptide 蛋蛋 白白 质质 和和 肽肽 Polypeptides composed of covalently linked amino acids 肽肽 由由 氨氨 基基 酸酸 以以 共共 价价 键键 结结

5、合合 而而 成成 Polypeptides with 40 amino acids are called peptides 40 amino acids are called proteins 40 个个 氨氨 基基 酸酸 ： 蛋蛋 白白 质质 Function of a protein determined by its non-covalent 3D structure 蛋蛋 白白 质质 的的 功功 能能 ： 三三 维维 结结 构构Amino AcidsH3N+OORH 氨基氨基 羧基羧基 侧链侧链PolypeptidesOR3HNHOR4HH3N+OR1HNHOR2HNHO 40 ami

6、no acid肽 键 肽 键Protein StructureFold Mixed / Helix / 混合型混合型 折叠型折叠型免疫球蛋白免疫球蛋白螺旋型螺旋型血红蛋白血红蛋白Classes of Protein / Polypeptide Pharmacueticals Vaccines 疫苗疫苗 (peptides, parts of proteins, killed bacteria, etc.) Polypeptides 多肽多肽 (oxytocin 脑垂体激素脑垂体激素, pitocin 催产素催产素) Blood products (Factor X, Factor VIII 凝

7、血因子凝血因子, 基因疗治血基因疗治血 友病友病, gamma globulin, serum albumin) Recombinant therapeutic proteins 重组治疗蛋白质重组治疗蛋白质 (herceptin 单克隆抗体单克隆抗体, humulin 重组胰岛素重组胰岛素, alferon 干扰素干扰素, etc.) 蛋蛋 白白 质质 / 多多 肽肽 类类 药药 物物 分分 类类Vaccines 疫苗疫苗 Diptheria 白喉杆菌白喉杆菌 (Corynebacterium diphtheriae) - diptheria toxin Tetanus破伤风破伤风(Clos

8、tridium tetani) - tetanus toxin Whooping cough 百日咳百日咳(Bordetella pertussis,) - acullelar extractTetanus Toxin 破伤风破伤风毒素片段毒素片段 折叠型折叠型 Therapeutic Protein / Peptide Insulin (diabetes) 胰岛素胰岛素 ( 糖尿病糖尿病 51 amino acid ) Interferon b 干扰素干扰素 b (relapsing MS, 多发性硬化症多发性硬化症) Interferon g 干扰素干扰素 g (granulomatous

9、, 肉芽瘤肉芽瘤) TPA 组织多肽抗原组织多肽抗原 Activase (heart attack, 心脏病发作心脏病发作)Therapeutic Protein / Peptide Actimmune (If g 干扰素干扰素) Activase (TPA, 组织多肽抗原组织多肽抗原) BeneFix (F IX, 凝血因子凝血因子IX,血友病血友病B型型 治疗治疗) Betaseron (If b, 干扰素干扰素, 多发性硬化症多发性硬化症缓和期缓和期, 复发期复发期) Humulin 重组胰岛素重组胰岛素 Novolin 重组胰岛素重组胰岛素 Regranex (PDGF, 血小板衍生生

10、长因子血小板衍生生长因子) Novoseven (F VIIa 重组凝血因子重组凝血因子) Epogen 红细胞生成素红细胞生成素 Intron-A( 干扰素干扰素, 毛细胞白血病毛细胞白血病, 生殖器疣生殖器疣 , 乙肝乙肝, 丙肝丙肝, AIDS) Neupogen 白细胞介素白细胞介素 Pulmozyme 重组脱氧核糖核酸酶重组脱氧核糖核酸酶 Infergen 干扰素干扰素, 慢性丙肝慢性丙肝 What is Gene Delivery ? 什什 么是么是 基基 因因 传传 递递 ?To deliver DNA plasmid 传传 递递 质质 粒粒 into cells to aris

11、e therapeutic effectssuch as induction 诱诱 导导 enhancement 促促 进进 （抗（抗 体体 的的 生生 成）成）or blocking of protein expression 阻阻 碍碍 蛋蛋 白白 质质 基基 因因 表表 达达 （ 阻阻 断断 复复 制）制）Why is a Gene Carrier Essential for Gene Delivery ? 为什么基因载体对基因传递是重要的为什么基因载体对基因传递是重要的 ?DNA itself cannot diffuse 扩扩 散散 through cell membrane bec

12、ause of its negative charge 负负 电电 荷荷 cell membrane also has negative chargeNaked 无无 保保 护护 的的 DNA is rapidly degraded by DNase in blood or cellular lysosome 血血 或或 细细 胞胞 中中 的的 溶溶 酶酶 体体The Problem with Protein / peptide 蛋蛋 白白 质质 / 肽肽 存存 在在 的的 问问 题题The Problem with Protein / peptide ( 1 ) (in vivo - in

13、the body) Very large and unstable molecules 分分 子子 大大 , 不不 稳稳 定定 Easily destroyed 破破 坏坏 /eliminated 消消 除除 by the body Easily destroyed 破破 坏坏 by relatively mild storage conditions 不不 严严 格格 的的 储储 藏藏 条条 件件 Hard to obtain in large quantities 大大 量量 制制 备备 困困 难难The Problem with Protein / Peptide ( 2 )(in vi

14、vo - in the body) Elimination 消消 除除 by B and T cells Proteolysis 蛋蛋 白白 质质 水水 介介 by endo/exo peptidases 肽肽 酶酶 Small proteins ( 30 kD ) filtered out by the kidneys 肾肾 very quickly Unwanted allergic reactions 过过 敏敏 反反 应应 may develop (even toxicity)The Problem with Protein / Peptide ( 3 ) (in vitro - in

15、 the bottle 瓶子瓶子 ) Denaturation 变变 性性 Aggregation 聚聚 合合 Precipitation 沉沉 淀淀 Adsorption 吸吸 附附 Deamidation 脱脱 酰酰 胺胺 Oxidation 氧氧 化化 Disulfide exchange 二二 硫硫 化化 物物 交交 换换 Proteolysis 蛋蛋 白白 质质 水水 介介 Noncovalent 非共价的非共价的 Covalent 共价的共价的Protein / Peptide New Formulation Protein sequence 序序 列列 modification

16、(site directed mutagenisis 诱诱 变变) 解解 决决 稳稳 定定 性性 问问 题题 PEGylation PEG 化化 延延 长长 T 1/2 Proteinylation 蛋蛋 白白 质质 化化 延长延长 T 1/2 靶靶 向向 Microsphere 微微 球球 / Nanosphere encapsulation 微微 囊囊 Micelles 胶胶 束束 控控 制制 释释 放放 靶靶 向向 Formulating with permeabilizers 渗渗 透透 剂剂 提提 高高 生生 物物 利利 用度用度新新 型型 蛋蛋 白白 质质 / 肽肽 类类 药药 物

17、物 与与 制制 剂剂 的的 研研 发发Site Directed Mutagenesis 诱诱 变变 Allows amino acid substitutions 氨氨 基基 酸酸 取取 代代 at specific sites in a protein Protein engineering 蛋蛋 白白 质质 工工 程程 (size, shape, etc.)Site Directed Mutagenesis 诱诱 变变E343H亚铁螯合酶亚铁螯合酶 在特殊部位用在特殊部位用 半胱氨酸取代半胱氨酸取代 (置换置换) 形成二硫化物形成二硫化物 提高稳定性提高稳定性PEGylation PEG

18、 化化 PEG is a non-toxic, hydrophilic 亲水性亲水性 FDA approved, uncharged polymer 没有负荷的聚合物没有负荷的聚合物 Increases in vivo half life (4 - 400 X) 肺递释肺递释 PEG GCSF ( 粒细胞集落刺激因子：化疗，血液病粒细胞集落刺激因子：化疗，血液病) 生物利用度生物利用度 3.0 % 11.5 % Decreases immunogenicity 降低免疫性降低免疫性 Increases protease resistance 增加对蛋白酶的抵抗增加对蛋白酶的抵抗 Increas

19、es solubility & stability 提高溶解度和稳定性提高溶解度和稳定性聚乙二醇聚乙二醇( PEG ) 分子中一个或多个分子与蛋白质或肽发生化学结合分子中一个或多个分子与蛋白质或肽发生化学结合Peptide-PEG monomers 单体单体PeptidePEG Hydrophobic block 亲脂性区亲脂性区Hydrophilic block 亲水性区亲水性区OR3HNHOR4HH3N+OR1HNHOR2HNHOCH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH | | | | | | | | | |OH OH OH OH OH OH OH OH OH O

20、H聚乙二醇聚乙二醇 ( PEG ) 分子中一个或多个分子与分子中一个或多个分子与 蛋白质或肽发生化学结合蛋白质或肽发生化学结合 长循环长循环PEGylation ( PEG 化化)+CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH | | | | | | | | | |OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH聚乙二醇聚乙二醇 ( PEG ) 分子中一个或多个分子与蛋白质或肽发生化学结合分子中一个或多个分子与蛋白质或肽发生化学结合 长循环长循环Mixed / Pulmonary Delivery PEG-GCSF Compound BioavailabilityGCS

21、F ( 18.8 kDa ) 3.0 %PEG-G-CSF ( 81.5 kDa ) 11.5 %PEG-G-CSF ( 146.8 kDa ) 3.4 % PEG-GCSF 粒粒 细细 胞胞 集集 落落 刺刺 激激 因因 子子 肺肺 部部 传传 递递PEG BiopharmaceuticalsADAGEN ONCASPAR PEG-INTRON干 扰 素PEGASYS干 扰 素 NEULAST PEGVISOMANT MACUGEN CDP 870 CDP 860 CERAProteinylation 蛋白质化蛋白质化 Attachment 配配 置置 of additional or se

22、condary (nonimmunogenic 不不 会会 产产 生生 免免 疫疫 性性 的的) protein for in vivo protection 体体 内内 保保 护护 increases in vivo half life (10X) 延延 长长 T 1/2 Cross-linking with Serum Albumin 血血 清清 白白 蛋蛋 白白 Cross-linking or connecting by protein engineering 蛋蛋 白白 质质 工工 程程 with antibody fragments 抗抗 体体 片片 段段Proteinylatio

23、n 蛋蛋 白白 质质 化化+Protein Drug ScFv (antibody)主主 动动 靶靶 向向Peptide Synthesis激激 活活 未未 保保 护护 的的 肽肽肽肽 键键Microsphere Encapsulation 微微 囊囊 提提 高高 稳稳 定定 性性控控 制制 释放释放 速速 度度Encapsulation Process involves encapsulating protein 蛋蛋 白白 质质 or peptide 肽肽 drugs in small porous particles 多多 孔孔 性性 粒粒 子子 for protection from

24、“insults” 避避 免免 损损 害害 and for sustained release 缓缓 释释 Two types of microspheres Nonbiodegradable 非非 生生 物物 可可 降降 介介 Biodegradable 生生 物物 可可 降降 介介 PLGA (polylactic-co-glycolic acid)Microsphere Release 微微 球球 的的 释释 放放 Hydrophilic 亲亲 水水 (i.e. gelatin) best for burst release 爆爆 破破 释释 放放 Hydrophobic 疏疏 水水 (

25、i.e. PLGA) good sustained release (esp. vaccines) 缓缓 慢慢 释释 放放 tends to denature proteins 变变 性性 蛋蛋 白白 质质 Hybrid 混混 杂杂 (amphipathic 两两 性性 分分 子子) good sustained release 缓缓 慢慢 释释 放放 keeps proteins native/active 保保 持持 天天 然然 活活 性性 Peptide Micelles ( 胶胶 束束 ) 离离 子子 型型 聚合聚合 物物 胶胶 体体 给给 药药 体体 系系15 50 nm载体材料载体

26、材料: :水溶性水溶性A A 端端 : : PEGPEG链链B B 端端 : : 离子型链离子型链 ( (聚甲基丙烯酸等聚甲基丙烯酸等) )静电吸附静电吸附, , 氢键氢键与药物结合成疏水与药物结合成疏水 内核内核, , 水中形成水中形成纳米胶束纳米胶束能最大程度地保持能最大程度地保持蛋白质蛋白质/ /肽的生物肽的生物活性活性Peptide Micelles10 50 nmNanoparticles for Vaccine 纳纳 米米 疫疫 苗苗 Delivery within Dendritic Cells 树树 突突 状状 细细 胞胞 Dendritic Cells (s 树树 突突 状状

27、 细细 胞胞 ) sentries of the body 机体的机体的“岗哨岗哨 ”，体内功能最强的，体内功能最强的“抗原提呈细胞抗原提呈细胞” Eat pathogens 捕捉病原体捕捉病原体 and present their antigens to T cells 激发有抗原受体的激发有抗原受体的T细胞细胞 Secrete cytokines 分泌细胞因子分泌细胞因子 to direct immune responses 产生免疫应答产生免疫应答Nanoparticles for Vaccine 纳纳 米米 疫疫 苗苗 Mimic pathogens surface character

28、istics 纳纳 米米 粒粒 模模 仿仿 病病 原原 体体 表表 面面 性性 质质 Antigen for controlled delivery within Dendritic Cells 被被 吞吞 噬噬 进进 入入 树树 突突 状状 细细 胞胞 中，在中，在 树树 突突 状状 细细 胞胞 中控中控 制制 释释 放放 “ 抗抗 原原 ” Selective activation of cytokine genes in Dendritic Cells 选选 择择 性性 激激 活活 细细 胞胞 因因 子子 基基 因因 ，产，产 生生 免免 疫疫 应应 答答 Applications in

29、 Therapeutic Vaccines ( Cancer, AIDS, HBV, HCV 治治 疗疗 疫疫 苗苗: 肿肿 瘤瘤 ,艾艾 滋滋, 乙乙 肝肝, 丙丙 肝肝 )Polymeric Nanoparticle Uptake by Human DCs: Confocal Image 共共 焦焦 图图 像像Protein / Peptide Drug Delivery Parenteral (injection) 非非 胃胃 肠肠 道道 Pulmonary 肺肺 部部 Oral or nasal delivery 口口 或或 鼻鼻 腔腔 Patch or transdermal rou

30、te 皮皮 肤肤 Other routes Rectal/Vaginal 直直 肠肠 / 阴阴 道道 Ocular 眼眼 睛睛蛋蛋 白白 质质 / 肽肽 类类 药药 物物 传传 递递 的的 新新 途途 径径 ( 1 )Parenteral Delivery Intravenous Intramuscular SubcutaneousRoute of delivery for 95% of protein / peptide由两个二硫键连接的A链(21)和B链(30)共 51个氨基酸组成Protein / Peptide Drug Delivery蛋蛋 白白 质质 / 肽肽 类类 药药 物物 传

31、传 递递 的的 新新 途途 径径 ( 2 ) Parenteral (injection) 非非 胃胃 肠肠 道道 Pulmonary 肺肺 部部 Oral or nasal delivery 口口 或或 鼻鼻 腔腔 Patch or transdermal route 皮皮 肤肤 Other routes Rectal / Vaginal 直直 肠肠 / 阴阴 道道 Ocular 眼眼 睛睛Pulmonary 1 0 0 M 2 肺血流量肺血流量 5 0 0 ml / minExubera Insulin Delivery System 吸吸 入入 Nektar Therapeutics /

32、 Pfizer / Aventis Co.Insulin MW 5700 51 个个 氨氨 基基 酸酸 组组 成成Inhaled short acting insulin Treatment of type 1 and type 2 diabetes 糖糖 尿尿 病病Exubera Insulin Delivery SystemFDA 2006. 1 .26. 批批 准准 上上 市市基因重组人胰岛素干粉基因重组人胰岛素干粉 23 mTmax : 吸入吸入 49 分钟分钟 (3090 分钟分钟) 注射注射 105分钟分钟 (60240 分钟分钟)B A : 10 % - 20 %Exubera

33、Insulin Delivery System液体气雾剂液体气雾剂 液滴液滴 2 3 m 激光孔喷嘴激光孔喷嘴 含赋料微粒含赋料微粒 5 30 m 气流动力学气流动力学 1 5 mPulmonary Insulin Delivery System 电子控制液体雾化电子控制液体雾化 液滴液滴 2 3 m Protein / Peptide Drug Delivery Parenteral (injection) Pulmonary Oral or nasal delivery Patch or transdermal route Other routesRectal / VaginalOcula

34、r蛋蛋 白白 质质 / 肽肽 类类 药药 物物 传传 递递 的的 新新 途途 径径 ( 3 )Oral Insulin (Oralin) 口腔喷雾剂口腔喷雾剂 Bucchal aerosol delivery system developed by Generex Insulin 胰岛素胰岛素 is absorbed through thin tissue layers in mouth and throat Insulin is formulated with a variety of additives 促促 透透 剂剂 and stabilizers 稳稳 定定 剂剂 to preven

35、t denaturation 防防 止变止变 性性 on aerosolization and to stabilize aerosol particlesOral Insulin (Oralin) 口口 腔腔 粘粘 膜膜 吸吸 收收C max 30 C ss 120 C min 240 BA 8 %起效快于皮下注射起效快于皮下注射 关注对口腔颊粘膜的刺激性？关注对口腔颊粘膜的刺激性？ 研发阶段研发阶段 (美美, 加加)国内国内 1996 - 2005 年 喷舌下pH Sensitive Microspheres Gel/Microsphere system with polymethacry

36、lic acid + PEG (聚甲基丙烯酸聚甲基丙烯酸 + PEG) In stomach (pH 2) pores in the polymer shrink 收收 缩，缩， 不不 释释 放放 and prevent protein release 避避 免免 胃胃 酸酸 破破 坏坏 In neutral pH (found in intestine) the pores swell 膨膨 张张 and release protein 结结 肠肠 释释 放放 含含 胰胰 蛋蛋 白白 酶酶 抑抑 制制 剂剂pH 敏敏 感感 型型 微微 球球Oral Delivery by Microsphe

37、repH 2 pH 7Patch DeliveryPatch Delivery B A 1 % Nasal Spray 鼻腔长度鼻腔长度 : 12 15 cm总表面积总表面积 : 150 cm2毛细血管丰富毛细血管丰富吸收迅速吸收迅速 使用方便使用方便 依从性好依从性好 生物利用度高生物利用度高降钙素降钙素 ( ( micacalcinmicacalcin nasal spray nasal spray ）已获美国已获美国 FDA FDA 批准上市。批准上市。 BA 3 %.BA 3 %. Osteogenic Growth Peptid (OGP) Nasal Spray 成成 骨骨 生生 长长 肽肽 鼻鼻 腔腔 给给 药药 系系 统统 14 14 氨氨 基基 酸酸 多多 肽肽 预防和治疗骨质疏松症预防和治疗骨质疏松症, ,促进骨质愈合促进骨质愈合 安全安全 有效有效 高效高效 浙浙 江江 省省 医医 学学 科科 学学 院院 药药 物物 研研 究究 所所 研研 发发Transdermal Patches Patch is coated with small needles that penetrate the dermal layer Proteins imbedded 埋埋 入入 the needles 微微 针针 Proteins diffuse d