溶菌酶的作用机制ppt课件

1、Determing the Mechanism of Lysozyme Action溶菌酶的作用机制溶菌酶的作用机制制造制造: 靳晶靳晶溶菌酶是如何被发现的？溶菌酶是如何被发现的？ 亚历山大弗莱明(Alexander Fleming)，1881年8月6日出生于苏格兰艾尔郡洛奇菲尔德。他是苏格兰低地农民的后裔，家境贫寒。 因发现了青霉素以及它对多种传染性疾病的治疗作用，荣获1945年诺贝尔生理学或医学奖。1922年的一天，正在感冒的英国细菌学家Alexander Fleming发现，把一些鼻粘液参与细菌的培育基后会引起细胞的溶解。而这种存在于鼻粘液中的能杀死细菌的重要物质被以为是一种酶， Fle

2、ming命名其为溶菌酶 Lysozyme 。 起初， Fleming对这种有杀死细菌活性的物质的实验不过是出于一种兴趣。但在目击了一战中大量的士兵死于外伤感染之后， Fleming开场试图倾其毕生来寻觅一种可以有效杀死细菌，同时又能对人类坚持相对的无毒性的药剂。不象Fleming在1928年发现的青霉素(penicillin)，溶菌酶不能证明有临床价值。但是在酶机制的研讨学习方面，溶菌酶扮演了一个很重要的角色。 在1965年,David Phillips和他在牛津的同事以0.2nm分辨率的X射线晶体X-ray crystallography构造分析法阐明了溶菌酶的三维构造(tertiary s

3、tructure)。 溶菌酶是从鸡蛋清中提炼的，蛋清里的溶菌酶可以维护胚胎在发育过程中免受细菌的感染。溶菌酶溶解细菌是经过水解细菌细胞壁多糖(the polysaccharide of the bacterial cell wall)的糖苷键(glycosidic bonds)。 而敏感细菌革兰氏阳性细菌(gram-positive bacteria)的细胞壁多糖是N-乙酰氨基葡糖N-acetylglucosamine, NAG-N-乙酰氨基葡糖乳酸N-acetylmuramic acid, NAM的共聚物，其中的NAG及NAM经过-1，4糖苷键而交替陈列。 溶菌酶相对分子质量为14.6X10

4、3，由129个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含有4对二硫键。 溶 菌 酶 分 子 近 椭 圆 形 ， 大 小 为4.5nmX3.0nmX3.0nm。它的构象比较复杂，螺旋仅占25%，在分子的一些区域有伸展着的片层构象。 溶菌酶是一种葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1和NAG的C4之间的糖苷键，但不能水解NAG C1和NAM C4之间的1-4糖苷键。几丁质是甲壳类动物甲壳中所含的多糖，仅由NAG残基经过1-4糖苷键衔接而成，几丁质也是溶菌酶的底物。 溶菌酶的内部几乎全部是非极性的(nonpolar) 。疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起重要作用。在溶菌酶分子的外表，有一个比较深的裂痕，其大小恰好能包

5、容多糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性部位。 底物与酶结合后，酶催化哪一个键水解呢？ 用大小不同的NAG寡聚体作底物测定被溶菌酶水解的相对速率，结果发现，少于4个糖的寡聚体水解速率甚小，当由四聚体添加到五聚体时，水解速率猛增500倍，五聚体添加到六聚体，速率添加近8倍，六聚体添加到八聚体，速率不再变化。这种情况与X射线晶体构造分析结果一致，活性部位所在的裂痕(cleft)正好被6个糖残基所装满。 NAG3是溶菌酶的竞争抑制剂，因此A-B，B-C糖苷键均不能够是被水解的键。C环的空间对NAM来说体积太大，只能是NAG。C-D也不能够成为裂解的部位，而NAM不能适宜到部位C中，进一步排除了另外一个

6、裂解部位：E-F键。胞壁多糖是一个NAM和NAG交替的高聚物，从而NAM不能占据部位C时也就不能占据部位E。细菌的细胞壁多糖恰好具有NAM-NAG键，所以水解部位只能发生在D-E之间。 用X射线晶体构造分析法研讨了竞争性抑制剂NAG3仅仅占据了大约半个裂痕。从活性部位的几何大小看出酶的最小底物应该是NAG6。实验中用NAG6为底物，确实能被酶迅速水解。酶活性部位刚好能包容一个六糖分子，A、B、C、D、E、F表示6个糖残基的位置，只是第4个糖残基D环因空间的缘由必需由正常的椅式变形为能量较高的半椅式或“沙发构造。因此糖苷键的稳定性减低，键就容易从这里断裂。 进一步的问题是酶的催化作用，终究键是在

7、糖苷键原子的哪一侧被裂解的？ 回答这个问题可以在H218O溶液中酶促水解底物NAG6，发现只需D糖C1上含有18O，而E糖的C4羟基只含普通的O，由此可知这个键断裂在D糖基的C1和E残基的糖苷键的O之间。分析D-E键周围的微环境，最活泼的基团显然是Asp52和Glu35，它们分别位于糖苷键两侧。Asp52位于糖苷键的一侧，而Glu35在另一侧。 这两个酸性侧链具有明显不同的微环境。Asp52是在一个明显的极性环境中，在那里它在一个复杂的氢键网络中起着氢键受体的作用。相反，Glu35位于非极性区。这样，在pH5下，这是溶菌酶水解几丁质的最适pH，即溶菌酶活性最大。Asp52侧链羧基为解离的COO

8、-方式，而Glu35那么为质子化未电离的COOH方式。侧链基团的氧原子与这个糖苷键的间隔大约是0.3nm。 Phillips等人根据上述研讨资料提出溶菌酶的催化作用机制，要点如下：1 Glu35的COOH提供一个H+到D环和E环间的糖苷键O原子上。H+的转移使D环的C1键与糖苷键O原子间的键断开，并构成正C离子过渡态中间产物。2 含有E及F残基的NAG二聚体分开酶分子。3 正碳离子中间产物进一步与来自溶剂的OH-发生反响。Glu35质子化，由A、B、C和D残基组成的NAG四聚体经过分散分开酶分子，然后溶菌酶为新一轮催化过程做好了预备。 上述的催化机制中，关键要素为： 1 广义的酸催化，Glu3

9、5以酸的方式提供质子，他的糖苷键氧原子的间隔为0.3nm，正式适宜的作用间隔。 2 正碳离子中间产物的构成与稳定，一方面由于Asp52带有负电荷的羧酸基经过静电相互作用稳定D环中C1的正电荷；另一方面由于D环的形变，由椅式构象变为半椅式，使D环上C1、C2、C5和O都在一个平面上，氧原子的负电性可以使正碳离子稳定。因此可以说，在结合底物时，酶迫使底物采取了接近于过渡态的构象。 随着DNA技术的新技术的开展，使以前被分解的基因的任何多肽的中间缺失、添加或交换成为了能够。经过定点诱变技术的运用，DNA的核苷酸序列可以特殊地变卦以致多肽的氨基酸可以被任何调查者选择的氨基酸替代。蛋白质中的任何氨基酸可

10、以被替代，并且调查者能确定一切蛋白质分子产生的继续的变卦。 最早把定点诱变运用到溶菌酶研讨的在1989年被发表。在论文中，Asp52和Glu35都被作为对象研讨，研讨是测试那些氨基酸剩余被替代的突变蛋白质的活性。像先前研讨的预期结果一样，这些突变蛋白质只需很少甚至没有催化活性。 Phillips根据晶体学研讨提出的底物结合方式和催化作用机制，曾在各种化学实验中遭到检验。一切实验结果都支持这个晶体学假设。 我们可以下结论的是三十多年前Phillips所提出的反响过程是经得起时间的考验。谢谢！谢谢！-iCW6qJ%dxR1lFZ9tN(gAU4oI$cwQ0kDX7rL*fzT3nH#auO-iC

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