生物化学-(原创)蛋白质相互作用的研究方法

1、蛋白质相互作用的研究方法 摘要 过去15年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。本文综述了当前研究蛋白质相互作用的主要技术方法，包括酵母双杂交技术，GST pull-down技术，免疫共沉淀技术和串联亲和纯化技术等多种研究方法，总结了各种研究方法的原理及应用。关键词：蛋白质，相互作用，研究方法1 酵母双杂交技术(two hybrid system)1.1基本原理 真核生物细胞转录激活因子一般都含有2个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-bindingdomain, B

2、D)和DNA转录激活结构域(transcription activation domain, AD)。这两个结构域相互独立但功能上又相互依赖,它们之间只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的活性。将拟研究的编码“猎物”蛋白的基因与AD序列结合,编码“诱饵”蛋白的基因与BD序列结合,形成两段融合基因,并在同一菌株核内表达,若“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白在核内存在相互作用,就可以重新形成完整的有活性的转录因子,从而激活报告基因的转录。因此根据报告基因的表达与否,即可判断“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间是否具有相互作用。1.2应用 Hurst等利用酵母双杂交的方法研究与乳腺癌转移抑制因子1（

3、BRMS1）的相互作用蛋白，得到此蛋白为Hsp90伴侣蛋白。Reddi等利用酵母双杂交系统研究肝炎B病毒反式作用因子HBx蛋白的自我偶联作用，结果发现HBx蛋白在分子环境中可以通过其碳末端区域产生自我偶联作用。酵母双杂交技术也应用于大规模蛋白质相互作用网络的研究，Lim等人利用此技术鉴定了770多个可能相互作用的蛋白，有75对蛋白质产生相互作用，其中有83%相互作用的蛋白质在哺乳动物细胞中得到验证。1.3优点 在检测蛋白质之间相互作用方面，酵母双杂交系统具有非常高的灵敏度，尤其对蛋白质间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测到。酵母双杂交技术研究蛋白质相互作用是基于酵母细胞内

4、的试验，不需要经过提纯蛋白来研究蛋白的相互作用，避免了提纯过程引起的蛋白变性，因而研究的是有生物活性的蛋白-蛋白相互作用，反映体内的真实的相互作用情况。1.4缺点 （1）对相互作用蛋白在细胞内的定位要求严格，酵母双杂交不能检测定位于胞浆内、细胞膜和通过分泌泡分泌到细胞外的蛋白而且融合表达可能会影响目的蛋白修饰和折叠，尤其在研究异源蛋白相互作用时，蛋白不一定能正确修饰和折叠，从而影响蛋白的活性。（2）由于某些蛋白质本身具有转录激活功，使"猎物"蛋白AD融合基因与“诱饵”蛋白BD融合基因表达产物无需特异结合就能启动转录系统，从而产生假阳性结果。（3）DBD-X和AD-Y不是通过

5、DBD-X-Y-AD直接激活转录，而是通过第3种蛋白或多蛋白的复合体把X、Y募集到一起，激活转录，从而产生假阳性结果。解决方法：Kim等设计了一种新的酵母遗传筛选方法一加二杂交系统（one plus two hybrid system），这个系统可以高效率地筛选特异干扰已知相互作用蛋白的无义突变，这种系统允许在同一细胞中存在双重报告系统。分裂-泛素膜酵母双杂交系统。主要是用于检测膜蛋白的相互作用。Vidalain等为了解决高通量酵母双杂交技术的假阳性问题，主要是通过阳性酵母细胞的扩大培养消除污染猎物质粒的影响。2 免疫共沉淀技术(coimmunoprecipitation)2.1基本原理 细胞

6、裂解物中加入抗体,与抗原形成特异免疫复合物,经过洗脱,收集免疫复合物,然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析.如果蛋白质X用其抗体免疫沉淀，则在细胞内与X稳定结合的蛋白质Y也能沉淀下来。蛋白质Y的沉淀是基于与X的物理性相互作用，被称为免疫共沉淀。2.2应用 用于确定生理条件下目的蛋白在细胞或组织内是否存在与其相互作用的蛋白质；用于验证两个已知相互作用的蛋白质。Operana等利用免疫共沉淀技术验证UGT1A蛋白质之间的相互作用，证实了每个UGT1A蛋白都可以潜在的形成同型二聚体。免疫共沉淀技术结果还表明UGT1A可以与所有的UGT1A蛋白形成异型二聚体，确证了在活细胞中

7、利用荧光共振能量转移（FRET）技术得到的结果。Walker等利用免疫共沉淀技术发现死亡蛋白和p53蛋白形成的复合物存在于白血病的血细胞的细胞质中而不存在于正常血细胞中。2.3优点:(1)与蛋白亲和层析一样,检测的产物是粗提物;(2)抗原与相互作用蛋白以细胞中相类似的浓度存在,避免了过量表达测试蛋白所造成的人为效应;(3)蛋白以翻译后被修饰的天然状态存在;(4)复合物以天然状态存在。2.4缺点：免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白,而是通过第三者间接相互作用的蛋白.另外,其灵敏度不及蛋白亲和层析高,因为感兴趣蛋白浓度不如后者高,这样驱动复合物形成的能力小。2.5验证免疫共沉淀试验结果的真实

8、性：（1）抗原的沉淀是由本身抗体的结合引起的，单克隆抗体不存在此问题，故建议使用单克隆抗体。（2）确保抗体的特异性，就是在不表达抗原的细胞溶解物中加入抗体也不会出现共沉淀现象。（3）相互作用是真实的体内过程，而不是细胞裂解的结果。3噬菌体展示技术(phage display approach)3.1基本原理 噬菌体展示技术是将编码目的蛋白的基因与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后,以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面的一种技术。将不同蛋白的cDNA插入噬菌体载体进行表达,得到表达不同蛋白的一定规模的噬菌体展示库。将“诱饵”蛋白固定化,基于“诱饵”蛋白与“猎物”蛋白之间的相互作用,可将展示库中与固定化的

9、“诱饵”蛋白有相互作用的“猎物”蛋白分离纯化出来,再对“猎物”蛋白进行质谱鉴定。3.2应用 噬菌体展示技术常用于构建随机肽库、抗体库和蛋白质库,研究受体或抗体的结合蛋白及相互作用位点,改造和提高蛋白质、酶及抗体的生物学和免疫学属性等。Li等用噬菌体抗体库筛得SARS病毒的单克隆抗体,同时发现SARS病毒S1区域的血管紧张肽转移酶的结合位点可作为药物治疗SARS的一个新靶点。3.3优点 (1)可以直接得到基因;(2)高选择性地筛选复杂混合物(达1091010);(3)在淘筛过程中,通过改变洗脱条件,可以直接评价结合的特异性.3.4缺点 (1)噬菌体文库中插入的DNA片段大小有所限制;(2)用细菌

10、作宿主,有可能使有些蛋白不能象天然状态那样正确折叠或修饰;(3)噬菌体文库中编码蛋白均为融合蛋白,可能改变天然蛋白的结构及功能;(4)在体外检测相互作用,可能与天然状态不符.4 GST pull-down技术4.1基本原理 体内稳定复合物中相互作用蛋白质的鉴定依赖于基于亲和力的操作。该技术是通过以适当标签和目的基因进行融合表达作为诱饵，从细胞提取物中钓出与目的蛋白相互作用的蛋白。多组分蛋白质复合物的分离主要利用固定在琼脂糖树脂的反标签系统完成（表1）。表1多组分蛋白质复合物分离常用的亲和标签和配位体4.2应用 一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：（1）鉴定能与已知融合蛋

11、白质相互作用的未知蛋白质；（2）鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-transferase，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此，GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。GST融合蛋白pull-down方法是将诱饵蛋白质和GST标签融合表达，一步纯化后与含有目的蛋白质的溶液进行孵育，利用谷胱甘肽-Sepharose将GST-融合蛋白-目的蛋白复合物沉淀下来，然后进行聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定与诱饵蛋白质相互作用的蛋白质。该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋

12、白质相互作用研究中有很广泛的应用。此外，还有很多其它常用的蛋白标签，如与葡萄球菌蛋白A融合的诱饵蛋白可以通过固定有IgG的亲和柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的诱饵蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化。Huang等通过构建GST-p16INK4a融合质粒，鉴定了ISOC2是与p16INK4a相互作用的新蛋白质。Xiao等利用His标签研究PICK1中PDZ和BAR两结构域之间的相互作用。4.3特点 融合蛋白亲具有高通量性、高选择性的特点，由于融合蛋白的多样性以及表达系统的多样性（如细菌、果蝇、哺乳动物），该方法能够研究蛋白质在复杂体系中的相互作用。但该方法的成功应用取决于是否能够得到足够多

13、，并且保持蛋白质活性的重组融合蛋白，以及如何避免内源性诱饵蛋白的干扰。5串联亲和纯化技术(tandem affinity purification, TAP)5.1基本原理 1999年Rigaut等人共同提出了一套分离复合蛋白的新方法串联亲和纯化(Tandem affinity puri-fication,TAP),兼具标准亲和纯化和免疫共沉淀两种生化方法的优点,为蛋白质复合体的分离鉴定提供了一条新路径。串联亲和纯化技术首先需通过基因工程给被分离纯化蛋白的一端加一个TAP标签,该标签由IgG结合结构域(ProtA)及一个钙调蛋白结合多肽(CBP)组成,结构域与多肽之间由一个TEV蛋白酶切位点隔

14、开。通过基因重组将细胞内源性的目标蛋白基因置换为带有TAP标签的基因,温和裂解细胞,获取细胞抽提物,将抽提物加入IgG亲和柱,TAP标签的ProtA端会与IgG形成强结合,在用洗脱液洗脱掉大部分非特异性结合物和杂蛋白后,再用含有TEV蛋白酶的洗脱夜将蛋白质复合体切割下来。在钙离子参与下,被切割下来带有CBP的蛋白质复合体与钙调蛋白紧密结合,充分洗脱,就可以进一步去除非特异作用的蛋白质杂质,最后纯化出高纯度的目的蛋白复合体。5.2应用 目前TAP技术已经成为快速纯化蛋白质复合物及其相关蛋白质的有效方法。如Gavin等运用TAP技术标记了1739个酵母细胞并纯化得到589个蛋白质复合物,并对其中的

15、232个蛋白质复合物进行了鉴定。结果发现,用这种技术鉴定得到的蛋白质相互作用在灵敏度、特异性和可靠性等方面都远远超过了酵母双杂交等研究蛋白质相互作用的传统技术,且这种技术还能展示出细胞中的蛋白质复合物组分的动态变化。TAP技术特别适用于研究自然条件下的蛋白质相互作用,已能够对大肠杆菌、酵母细胞中蛋白质的相互作用进行大规模地研究。5.3优点 利用酶切的方法进行洗脱,条件温和,不破坏复合物的结构,去除了杂蛋白的干扰,使蛋白质相互作用的研究结果准确性更高。5.4缺点 由于在高等真核细胞中难以进行原位蛋白标记,以及存在内源表达的蛋白质干扰,和蛋白质翻译后调控机制的不同等因素,使得该技术在高等真核细胞中

16、的应用受到限制。解决方法 Foler等将TAP技术与RNAi(RNA interference,干扰RNA)技术联用( iTAP技术),发现可以很大程度上降低上述问题的影响,并已使TAP技术在果蝇的S2细胞中得到了成功应用。6其他技术除以上介绍的方法外，还有其它研究蛋白质相互作用的方法，比如基于生物信息学的分析方法，化学交联技术，蛋白质微阵列等方法。6.1荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer, FRET)荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态前,通过偶

17、极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移,即发生能量共振转移。如要研究两种蛋白质A和B间的相互作用,可以构建CFP-蛋白质A-YFP-蛋白质B这种融合蛋白,用CFP吸收波长433 nm作为激发波长,当蛋白质A与B没有发生相互作用时,CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移,因而检测到的是发射波长为475 nm的CFP荧光;但当蛋白质A与B发生相互作用时,CFP与YFP可充分靠近(小于10 nm),可发生荧光共振能量转移,此时检测到的就是发射波长为527 nm的YFP荧光。若将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达,则可以在体无损研究蛋白质间的相互作用。荧光共振能量转移技

18、术常用于检测蛋白质间的相互作用以及作用时蛋白质复合物的构像变化,从而确定作用模式,通过在体无损成像描述细胞内蛋白质间相互作用。6.2表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)它是一种物理光学现象,当一束平面单色偏振光以一定角度入射到镀在玻璃表面的薄层金属膜上发生全反射时,若入射光的波向量与金属膜内表面电子的振荡频率相一致,光线即被耦合入金属膜引发电子共振,即表面等离子共振。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可

19、实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。6.3原子作用力显微技术(atom ic forcem icroscopy, AFM ) AFM通过力扫描方式,以单分子水平的高分辨率测量蛋白质间的相互作用力。如在配体-受体间相互作用力的研究中,配体被固定于AFM的弹性悬臂表面,受体被固定于适当的基底表面,在悬臂接近和离开基底的过程中,通过悬臂的偏折便可测得配体-受体间的作用力。该技术常用于直接检测蛋白复合物解体期间的动力强度及自由能变化。Yuan等用该技术测得链霉抗生物素蛋白与生物素之间的结合力在115170 pN之间。原子作用力显微技术能直接有效地检测在外力作

20、用下,蛋白质分子机械性质的改变。由于该技术常受到非特异结合力的干扰,导致结果误差较大。6.4抗体与蛋白质阵列技术作为规模化功能蛋白质组学研究的手段的蛋白质芯片技术,是DNA芯片技术的扩展,即在固体支持物表面高密度地固定化排列探针蛋白点阵,以特异地捕获样品中的靶蛋白,然后通过检测器对靶蛋白进行定性或定量分析。蛋白质芯片能够同时高效地分析上千种蛋白质间的相互作用,也使得在全基因组水平研究蛋白质的功能(如酶活性、抗体特异性配体、受体交互作用)成为可能。6.5双分子荧光互补技术( bimolecularfluorescence complementation, BIFC) 利用GFP荧光蛋白家族的报告

21、基因特性、循环排列的特殊分子结构性质,在环状结构的特异位点将荧光蛋白基因切成N端和C端两段不具有荧光活性的片段后,分别与待测蛋白基因连接,构建重组基因,在转染细胞中融合表达.若表达的2个蛋白质间存在相互作用,荧光蛋白的2个片段就能够相互靠近,形成荧光蛋白生色团重新发出荧光。6.6寡沉淀(oligoprecipitation) 该方法以双链寡核苷酸替代免疫共沉淀的含蛋白标签的特异性抗体.首先,合成1条保守结合序列与激活转录因子的DNA保守结合序列相同的双链寡核苷酸,再利用固定化双链寡核苷酸的色谱柱来结合并激活转录因子,捕获与处于活性状态的转录因子相互作用白质,在去除与寡核苷酸链非特异性结合的蛋白

22、后,即可洗脱获得活性转录因子的蛋白质复合体(Fig.1)直接研究具有活性的蛋白质复合体,避免了非活性时结合蛋白质的干扰,也可应用于能够被小分子、肽等物质激活的蛋白质相互作用的研究。6.7减量式定量免疫沉淀(quantitativeimmunoprecipitation combined withknockdown, QUICK) 利用轻、重稳定同位素标记培养基中氨基酸(如赖氨酸、精氨酸),分别供给2组靶蛋白表达细胞代谢生长,采用RNA干扰技术降低其中1组细胞的靶蛋白表达量,利用免疫共沉淀方法分别从2组细胞中获得与靶蛋白相互作用的蛋白质复合体,混合2组复合体,进行定量质谱分析.由于其中1组细胞靶

23、蛋白量的减少,导致与其真实相互作用形成的复合体量也相应降低,在质谱图上应表现为非等量的相邻峰,而等量的相邻峰则代表了分离纯化时与抗体或基质结合的非特异性相互作用蛋白质(Fig.2).该方法最大的优势在于排除了这些非特异性蛋白对蛋白质复合体鉴定的干扰.7 展望现如今, 随着蛋白质组学时代的到来，出现大量的蛋白质间相互作用的研究方法。各种各样的研究方法都存在着一定的优缺点，如何取长补短，如何将各种技术融合交叉，将会是蛋白质相互作用研究的主要特点，蛋白质相互作用研究将得到进一步的良好发展。参考文献1 贺福初,等.蛋白质-蛋白质相互作用.中国农业出版社,傅玉祥, 2004, 250-251.孙宇,贾凌

24、云,任军.蛋白质相互作用的研究方法J.分析化学,2007,35(5):760-7662 符庆瑛,高钰琪,刘昕.大肠杆菌双杂交系统筛选与AMPK2相互作用的蛋白质J.第三军医大学学报, 2007,29(9):820-8233 罗以勤,王梁华,马筱玲,等.细菌双杂交系统筛选与tumstatin45-132相互作用蛋白质J.中华微生物学和免疫学杂志2007,27(2):101-1064 马慧莲,刘含智,王丽萍,徐淑坤,李惟.分析化学,2005, 33(9): 1335-133826 5 崔小强,沙宇芳,杨帆,于萍,黎拒难,杨秀荣.分析化学,2005, 33(11): 1639-16426 吴宝艳,黄加栋,李静,宋昭,王艳艳,王新胜,)，分析化学,2006, 34(6): 769-7727 何锶洁，董伟，李慧芬.高技术通讯，1999，2：50-52.8 郭岚,王建伟,韩金祥等·SARS病毒刺突蛋白与TAP标签在Vero细胞内的融合表达研究J·山东大学学报(医学版),2005,43(8):661-666·9 俞炽阳,Yang Mao-zhou·TAP系统分离纯化MT1-MMP-hTAP融合基因蛋白复合物及表达效应