实验8微丝染色及形态观察ppt课件

1、 目的要求目的要求 1. 掌握微丝的染色方法。2. 了解光镜下微丝的根本形状构造。 实验原理实验原理 真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架真核细胞质中纵横交错的纤维网称为细胞骨架(cell (cell skeleton)skeleton)，在维持细胞外形和运动方面具有重要作用。，在维持细胞外形和运动方面具有重要作用。根据组成成分和组装构造的不同，可将细胞骨架分为微管根据组成成分和组装构造的不同，可将细胞骨架分为微管(microtubule, MT)(microtubule, MT)、微丝、微丝(microfilament, MF)(microfilament, MF)和中间和中间纤维纤维(

2、intermediate filament, IF)(intermediate filament, IF)。微丝普遍存在于多。微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的外形和运动有一定作用。种细胞，对细胞的外形和运动有一定作用。 当细胞用TritonX-100溶液处置，可以溶解质膜构造中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架中的蛋白质却不被破坏，经固定和考马斯亮蓝非特异性蛋白质染料染色后，胞质背景着色弱，微管等蛋白构造在光镜下无法分辨，在光镜下察看到主要是由微丝组成的应力纤维。 应力纤维由平行陈列的微丝组成，体外培育的贴壁细胞应力纤维尤为兴隆，形状长而直，常与细胞长轴平行并贯穿细胞全长。 微丝在细胞内的分布特征

3、微丝在细胞内的分布特征实验用品实验用品 器具：器具：CO2恒温培育箱、倒置显微镜、超净恒温培育箱、倒置显微镜、超净任务台、低速离心机、普通光学显微镜、移任务台、低速离心机、普通光学显微镜、移液器、恒温箱、镊子、培育皿、载玻片、盖液器、恒温箱、镊子、培育皿、载玻片、盖玻片、吸水纸。玻片、吸水纸。 资料：盖玻片培育的成纤维细胞资料：盖玻片培育的成纤维细胞 试剂：试剂：6 mmol/L PBSpH 6.5、1TritonX-100溶液、溶液、M-缓冲液、缓冲液、3戊二醛固戊二醛固定液、定液、0.2考马斯亮蓝染液、考马斯亮蓝染液、DMEM培育液。培育液。 实验步骤实验步骤1. 培育培育 在成纤维细胞进

4、展传代培育时，将已消毒在成纤维细胞进展传代培育时，将已消毒的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培育皿中，于的盖玻片涂上多聚赖氨酸，放入培育皿中，于37、5%CO2的温箱中生长的温箱中生长24h48h。2. 染色处置染色处置1取材取材 取出铺有细胞的盖玻片，放入小培育取出铺有细胞的盖玻片，放入小培育皿中正面向上皿中正面向上,用用PBS洗洗3次从盖玻片一角次从盖玻片一角悄然滴加悄然滴加3 4滴，洗去外表的培育液。滴，洗去外表的培育液。2抽提抽提 吸弃吸弃PBS，参与，参与1% Triton X-100液液4-5滴刚好覆盖盖玻片外表，室温处置滴刚好覆盖盖玻片外表，室温处置15min3稳定 吸弃Triton

5、X-100，立刻用M-缓冲液悄然地洗涤3次。 4固定 略晾干，在3%戊二醛液中固定10min，再以 PBS液洗3次，洗去固定液。 5染色 滴加3-5滴0.2%考马斯亮兰染液染色 10 min，然后小心的用自来水漂洗。6察看 留取少量水分封片于载玻片，吸水 纸吸去多余的水。光镜下察看暂时装片。实验结果实验结果 光镜察看，微丝聚集成的应力纤维束被光镜察看，微丝聚集成的应力纤维束被染成蓝色，成纤维细胞多数有突起，微染成蓝色，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规那么陈列。丝沿突起规那么陈列。 光学显微镜下微丝分布图光学显微镜下微丝分布图 本卷须知本卷须知 1. 1. 洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片洗片时要轻柔，以免把细胞从载玻片上洗去。上洗去。 2 2操作中应留意区分细胞盖玻片的正反操作中应留意区分细胞盖玻片的正反面。面。 3 3染色后应冲洗盖玻片反面，防止损伤染色后应冲洗盖玻片反面，防止损伤细胞。细胞。 4 4TritonX-100TritonX-100抽提蛋白时，留意防止抽抽提蛋白时，留意防止抽提时间过长而导致细胞构造的破坏。提时间过长而导致细胞构造的破坏。作业与思索题作业与思索题 1. Trito