045细胞融合2

1、 第第5章章细胞融合细胞融合一、一、 定义定义n细胞融合（细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过物理、生物或化学方法融合形成单个细胞的过程。n细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交（somatic hybridization），是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞)相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。n可以避开生殖细胞的受精过程，在亲缘更远的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没有的新物种。细胞融合的意义细胞融合的意义白菜白菜甘蓝甘蓝白菜白菜 甘蓝甘蓝细胞融合请同学们讨论

2、如何实现请同学们讨论如何实现? ?对称融合对称融合非对称融合非对称融合n原理：将两个来源不同的原生质体或细胞通过物理或化学方法诱导其细胞融合形成杂种细胞,继而再以适当的技术进行杂种细胞分检和培养,促使细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成杂种植株，从而实现远源物种间的转移随机结合、融合二、基本原理二、基本原理细胞融合过程主要经过包括：两个原生质体或细胞相互靠近、细胞桥形成、细胞质渗透和细胞核融合。(1)(1)(2)(3)(4)(5)显微镜下的细胞融合过程 甜菜原生质体电融合过程1）在高频电流电场下的相互接触。2）脉冲刺激后30s3)50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融

3、合完成。融合过程中两个细胞膜的变化过程 n类脂质分子发生扰动和重排n导致细胞桥的形成n细胞质、核相互融合三、三、 发展历史发展历史n细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。1858年菲尔绍夫发现正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞情况。天花病人血液中也有多核体细胞存在。n1875年lange第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生的合并现象。n1962年日本学者发现一种叫日本血凝性病毒(hvj)能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。n1965年英国海利斯等进一步证实灭活的病毒在适当的条件下可以诱发动物细胞融合，不同的动物细胞可以被诱导融合，并可以存活。n20世纪七十年代初，华裔加籍科

4、学家高国楠发现聚乙二醇(peg) 能促使植物原生质体融合，开拓了植物细胞融合的研究。n19721972年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。细胞杂种。n19781978年梅尔彻斯年梅尔彻斯(melchers)(melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种种“potamato“potamato”。n 目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细

5、胞杂种及其后代，获得了有价值的稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的n新品系或育种上有用的新材料。新品系或育种上有用的新材料。 n细胞融合技术逐步扩展到植物细胞和微生物细胞。伴随者细胞融合技术的成熟，20世纪80年代，真正意义上的细胞工程诞生了。细胞融合现已成为细胞工程的核心技术之一。 四四 细胞融合的关键技术细胞融合的关键技术 n（一）融合材料的获得（一）融合材料的获得n问题一：怎样获得植物细胞与动物的单问题一：怎样获得植物细胞与动物的单个细胞？个细胞？ （二）细胞融合的方法（二）细胞融合的方法 物理法、化学法及生物法物理法、化学法及生物法物理法主要包括显微操作、电场

6、刺激(电融合法)等；化学法主要是用peg诱导，高ca2+和ph诱导，高ca2+和ph结合peg诱导，盐类离子（nano3 、cano3、cacl2）生物法有仙台病毒(hvj)法等。仙台病毒(hvj)法、 peg法、电融合法适用于动物诱导细胞融合。peg法、电融合法适用于植物细胞融合。微生物只适合用peg法。1、物理法-电融合诱导法电融合诱导法(1)(1) 基本原理n在直流电脉冲的诱导下，原生质体膜两侧电荷和氧化还原电位发生改变，产生电势，正负电荷相吸，细胞膜变薄，触发膜的穿孔，使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭合成完整的膜融合体。(2)特点：n融合率高、重复性与可控

7、制性强。n装置精巧、方便简单。n可在显微镜下观察或录像融合过程。n可能会造成不可恢复的细胞损伤。 (3)(3)电融合装置电融合装置(4)(4)电融合诱导法基本过程电融合诱导法基本过程电融合装置的电极有两种：微电极型和平行多电极型： （l）将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室中，微电极型只有一个小室，平行电极型有4个小室，两电极间隔3mm，整个装置放在一个培养皿中。 （2）微电极型的两个电极的端部同时与两个靠近的原生质体膜表面接触，微电极所产生的512ma的脉冲电流间断刺激l5ms，原生质体在累计几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，经点连

8、接到面连接，最后形成融合体，整个过程大约1030min。 （3）平行多电极通过1兆赫（mhz）交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状。在适当时间和强度（如 50ma 12 2kvcm）的直流电脉冲作用下，质膜被击穿，进一步形成融合体。2、生物法n各种病毒都具有凝集细胞的能力，它一边粘接在一个细胞表面，另外一边粘接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。 (1) 特点n研究最早的促融剂。n毒性大而使应用受到限制。n仙台病毒（haj）是两层磷脂组成的外膜包裹着rna与蛋白质的复合体。因haj病毒毒力弱，易被灭活而常采用。(2)

9、 病毒促使细胞融合的主要步骤a 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近。b 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透。c 两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体。d 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。(3) 原理与过程n灭活后的病毒颗粒结合到原生质体表面。两受体细胞开始凝聚。n两细胞的膜紧密结合。病毒被膜与受体细胞的浆膜融合。病毒颗粒周围的膜脱离整个膜，产生破口，在两细胞间形成细胞质通道（37度下1-2分钟），通道继续扩大，病毒颗粒流入细胞质内，细胞质互相融合。n融合细胞变圆，融合结束。灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面灭活的病毒颗粒黏附于细胞表

10、面细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接细胞融合，形成杂种细胞细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性细胞膜具有一定的流动性）3、化学法n包括peg诱导，高ca2+和ph诱导，高ca2+和高ph值结合peg诱导，nano3等。盐离子诱导：聚乙二醇(polyethylene glycol,peg)是一种多聚化合物，分子式为h(ohch2-ch2)noh),商品名叫卡波腊。peg诱导：peg与溶液中自由水结合，高度脱水后引起原生质体凝聚、扭曲变形、细胞膜连接处发生融合，形成很小的细胞桥，之后扩大，最终彻底融合。peg诱导：高ca2+和ph诱导peg结合诱导n高ca2+机

11、制：带负电荷间的原生质体在钙离子的连接下形成静电键钙桥，促使异源的原生质体间粘着和结合。n高ph：增加ca2+在细胞表面的黏附，从而促进两原生质体的接触。( (三三) ) 影响细胞融合的主要因素影响细胞融合的主要因素n1、植物细胞融合(p170)(1)peg诱导融合的关键是作用时间。(2)peg规格和纯度与融合效率（4000-6000）。(3)在电融合时，融合率与原生质体密度有关。(4)在融合液中加入少量cacl2，即可以维持一定量的电导率，对细胞也有保护作用，交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲大小均会影响融合效率。(5)用混合盐溶液对原生质体进行酶处理，以及在促融剂中添加伴刀豆球蛋白、二甲基

12、亚砜、胰蛋白酶、精胺或亚精胺等也可提高融合效率。n2、动物细胞融合在动物细胞融合过程中，除融合剂外，其它如细胞性质、温度、ph、离子强度及离子种类等均会影响细胞融合效率。(1)表面性质(2)细胞种类(3)细胞融合时适宜的温度和运动状态。(4)细胞融合时，通常耗氧量较大，缺氧时经常不融合。(5)ca2+(6)适宜的ph值(7.2-7.4)1、制备单克隆抗体、制备单克隆抗体2、诊断、治疗、预防疾病。、诊断、治疗、预防疾病。例如：单抗诊断盒、例如：单抗诊断盒、“生物生物导弹导弹”治疗癌症治疗癌症获得杂种植株获得杂种植株1、克服远缘杂交不亲障碍、克服远缘杂交不亲障碍2、克服有性杂交的母系遗、克服有性杂

13、交的母系遗传、获得细胞质基因的杂合传、获得细胞质基因的杂合子、研究细胞质遗传子、研究细胞质遗传用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左）（同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振动、物理（离心、振动、电刺激）电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较植物、动物细胞

14、融合的比较(p166)(p166)五、 融合细胞筛选因融合的随机性而成为细胞融合的关键而必需的技术1 筛选的原因n细胞融合是一个随机的物理过程，经融合后细胞将以多种形式出现，需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。n问题：a与b融合过程中，你能预见有哪些形式的细胞吗？na-b，a-a，b-b。na-a-a，b-b-b等多聚体。n未融合的a，b。2细胞融合后产生的类型n(1)同核型同源原生质体的融合体n(2)异核型非同源原生质体的融合体n(3)多核体含有双亲不同比例核物质的融合体3杂种细胞筛选方法 (p171)1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一

15、个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。n 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长n2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。n如：n亲本1：对放线菌素d抗性，但在ms培养基上不能超过50个世代n亲本2：对放线菌素d很敏感，但能在ms上生长n杂种细胞能在含有放线菌素的ms培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。 亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体

16、 亲本2：叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分n4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。n例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。n1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。n亲本a：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感n亲本b：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感n杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长n2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可

17、以筛选杂种细胞。n亲本a：色氨酸缺陷型n亲本b：苏氨酸缺陷型n杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。n3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。n亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。n亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。n杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。六、 细胞融合技术应用1、动物细胞融合-单克隆抗体生产多克隆抗体与单克隆抗体n动物脾脏有上百万个b淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体是单克隆抗体。n一

18、种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个b淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。n血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。n如果我们能分离得到只分泌某一种特异性抗体的b淋巴细胞，不就可以大量生产相关单抗了吗？n问题：可以实现吗？有什么技术限制吗？（1）历史发现n1975年，德国和英国剑桥大学分子生物学研究室的科莱尔和米尔斯坦，将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（b淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特

19、征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。培养成细胞系，获得高度纯合的抗体单克隆抗体。 n1984年获得诺贝尔医学和生理学奖。（2）杂交瘤技术n杂交瘤技术：将瘤细胞（骨髓瘤）与免疫动物的脾或淋巴细胞融合而制成杂种细胞。n骨髓瘤-b淋巴细胞杂交瘤：既具有骨髓瘤细胞无限的繁殖能力，又具备b淋巴细胞产生特异性抗体的功能。（3）具体步骤单克隆抗体制备过程示意图单克隆抗体制备过程示意图仙台病毒或聚乙二醇的诱导下融合 a、动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备 n一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）三个过程。如果需要免疫脾细

20、胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液。 b、骨髓瘤细胞的获得与培养 n骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高。n一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期。c c、细胞融合、细胞融合 n（1）取对数生长的骨髓瘤细胞，离心，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。 （2）将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。 （3）30秒内加入预热的一定浓度、一定分

21、子量的peg，边加边搅拌，在室温下融合。加预热的不完全培养液，终止peg作用。（4）离心，弃上清，用20小牛血清等轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100l孔，37、5co2孵箱培养。 融合后的细胞类型n融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。n正常的脾细胞在培养基中存活仅57天，无需特别筛选，细胞的多聚体形式也容易死去。n剩余：脾细胞与瘤细胞的融合细胞、未融合的瘤细胞、融合的瘤细胞，其中后两种需进行特别的筛选去除。d、 融合细胞的筛选hat培养基筛选法n培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤（hypoxanthine

22、，h）、氨基蝶呤（aminopterin，a）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，t），所以取三者的字头称为hat培养基。筛选原理ndna的合成： 叶酸辅酶n正常途径：糖、氨基酸核苷酸dna ，可以被氨基蝶呤(叶酸的拮抗剂)阻断n 胸腺嘧啶核苷激酶（tk）n补救途径：核苷酸前体 核苷酸dnan 次黄嘌呤、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hprt）n氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成dna，因此hat培养基上的细胞不能采用该途径合成dna。n融合所用的瘤细胞一般是hprt与tk缺陷型，因此也不能采用补救途径合成dna。n两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？n瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成dna而

23、死亡。n融合细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的hprt与tk ，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成dna，因此可在hat培养基中存活与繁殖。e、分泌抗体的融合细胞的检测 elisa方法检测抗体n将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间，培养一段时间后取上清以elisa法选出抗体高分泌性的细胞。n找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后冻存、体外培养或动物腹腔接种培养生产抗体。f f、单克隆抗体的大量生产、单克隆抗体的大量生产n(1)体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。n(2)(2)体内接种杂交瘤细胞，制

24、备腹水与血清。体内接种杂交瘤细胞，制备腹水与血清。n1）实体瘤法 n对数生长期的杂交瘤细胞按13107cellsml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml。待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml(采血量有限)。 n2）腹水制备法 n腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。n腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml， 这是目前最常用的方法。(3(3）生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗）生物反应器培养杂交瘤细胞

25、大规模生产单抗n杂交瘤细胞：wut3杂交瘤细胞 n生物反应器 ：采用3.5升、14升、75升搅拌式生物反应器，具有自动消毒、控制温度、转速、do和ph等功能。n培养液 ：rpmi1640中添加庆大霉素至100单位、胎牛血清（ncs）或健康人血清（hus）、添加剂hen（蛋白胨和糖类）。培养方式 n控制温度在37、ph7.1、转速40-60r/min、do在30%-50%，分批和半连续培养。n离心机除去细胞，收集上清液用于单抗浓度、免疫活性、热原等分析测定。 结果n3.5升搅拌式生物反应器分批培养，wut3杂交瘤细胞经48小时适应期后进入对数生长期，维持24小时后进入平衡期，这一阶段持续约48小时，分泌单抗。 n继续放大至75升生物反应器，半连续生产，细胞浓度达到1.5106/ml，单抗产量为50-70g/ml。这样每间隔2天收获1批，获得上清液40升，平均日产单抗达1克。 2 2、利用原生质体融合培养技术培育新植株、利用原生质体融合培养技术培育新植株n(1) 植物原生质体培养意义na 融合产生体细胞杂种nb 分离或