细胞培养实验指导

1、第五章 细胞培养实验实验一 普通光学显微镜的结构和使用【实验目的】1.熟悉显微镜的结构和各部件性能。2.掌握低倍镜、高倍镜的正确使用方法，熟悉油镜的使用方法。【实验内容】1.显微镜成像原理（图11）图1-1显微镜成像原理标本（F1）置于聚光器与物镜之间，目镜、物镜、聚光器各自相当于一个凸透镜。平行的光线自反射镜折射入聚光器，经聚光器集聚增强，照射在标本上。标本的像经物镜放大成像于F2处，像是倒像。目镜将此例像进一步放大，并成像于人眼的视网膜上(F3)（正像）。2.显微镜的结构图1-2 光学显微镜结构示意图1.目镜 2.镜筒 3.物镜转换器 4.物镜 5.透光孔 6.聚光器 7.光圈 8.反光镜

2、 9.粗调节器10.细调节器 11.镜臂 12.移片器 13.载物台 14.倾斜关节 15.镜柱 16.镜座 17.照明 1）机械部分（1）镜座：显微镜的基座。起稳定和支持整个镜身的作用。有的显微镜在镜座内装有照明光源等构造（图12）。（2）镜臂：支持镜筒和镜台。镜筒直立式光镜在镜臂和镜柱之间有一可活动的关节叫倾斜关节，可使镜臂作适当倾斜，便于观察。镜筒倾斜式显微镜由于镜臂和镜柱连为一体，故无此关节。（3）镜筒：位于镜臂前方的圆筒，上端安装目镜，下端装有旋转盘。根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式两类。（4）载物台：在镜筒下方，方形或圆形放玻片标本用。载物台中央有一圆形通光孔，两旁备有一压

3、片夹。有的载物台上装有标本移动器，移动器上装有弹簧夹，用于固定标本片。移动器的一侧有两个旋钮，转动旋钮可使玻片前后左右移动。（5）物镜转换器：圆盘状，在镜筒下方，其上装有34个放大倍数不同的物镜。旋转物镜转换器可更换物镜。（6）聚焦调节器；为调节焦距之用。大旋钮为粗调节器，转动粗调节钮可使镜筒(或载物台)升降，调节焦距。旋转一周可使镜筒(或戴物台)升降10mm。一般用于低倍镜调焦。小旋钮为细调节器，转动细调节钮可使镜筒(或超物台)缓慢升降，每旋转一周约使镜筒(或载物台)升降0.1mm。适用于高倍镜、油镜或分辨物象清晰度调焦。2）照明部分（1）反光镜；载物台下方，一面为平面一面为凹面。平面镜聚光

4、力弱适于强光源和平行光源。凹面镜聚光力强适用于弱光源或散射光源。反射镜的方位可以随意调节。（2）聚光器：在载物台下方，由一组透镜组成，可使反射光线聚集于标本上。一般在镜柱一侧有一旋钮，可使聚光器升降，和物镜配合使用。（3）光圈：在集光器下方，由一组活动金属片组成，构成一个可开可缩的孔。在其外侧有一小柄，可以调节控制光线通过。在光圈的下方常装有滤光片架，可以放置不同颜色的滤光片。3）光学部分（1）目镜：短圆筒状，装在镜筒上端，其上刻有放大倍数，每台显微镜常备有34只放大倍数不同的目镜，如5×、10×、15×等。眼睛通过目镜观察物像。（2）物镜：装在物镜转换器上的一组

5、镜头，一般有低倍镜、高倍镜、油镜三种。每个物镜上刻有相应的标记。低倍镜筒上刻有10×或15×等标志，高倍镜筒上刻有40×或45×标志。油镜上一般为100×。N.A.表示镜口率，镜口率反映镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨力越高。各种物镜的比较见表1-1注：分辨力用分辨率表示，指能把两个物点分开的最小距离。距离越近，其分辨率越高。显微镜的分辨力可用下列公式来计算：R0.61N.A. （N.A.nsin/2）上式中R为分辨力，NA为镜口率，n为介质的折射率，sin/2为透镜视锥半顶角的正弦，为光波波长。放大倍数的计算：实物放大倍效=物镜放大倍数

6、×目镜放大倍数3.显微镜的使用方法1）低倍镜的使用检查：右手握镜臂，从镜箱内取出显微镜，左手托境座，轻轻放在实验桌上。先检查一下显微镜部件有无损坏，如发现有损坏或性能不良者，立即报告教师请求处理。(1) 准备；转动粗调节钮，将镜筒略升高(或将载物台下降)使物镜与载物台距离略拉开。再旋转物镜转换器，将低倍镜对准裁物台中央的通光孔。(2) 对光：打开光圈，上升聚光器，双眼同时睁开，向目镜内观察，同时调节反光镜的方向，直到视野内光线明亮均匀为止。反光镜的平面镜易把其他景物映入视野，一般用凹面镜对光。(3) 放标本片：标本片的盖片朝上。将标本片放到裁物台前方，然后推到物境下面，用压片夹压住，

7、如有标本移动器，可用上面的弹簧夹夹住标本片，然后把要观察的部分移到通光孔的正中央。(4) 调节焦距：从显微镜侧面注视物镜镜头，同时旋转粗调节钮，使镜筒缓慢下降(或镜台上升)，大约低倍镜头与盖片间的距离约5mm时，再从目镜里观察视野，左手缓缓转动粗调节钮，使镜筒缓缓上升，直至视野中出现物像为止。如物像不太清晰，可转动细调节钮，使物像更加清晰。如果按上述操作步骤仍看不到物像时，可能由以下原因造成： 转动调节钮太快，超过焦点。应按上述步骤重新调节焦距。 物镜没有对正，应对正后再观察。 标本没有放到视野内，应移动标本片寻找观察对象。 光线太强，尤其观察比较透明的标本片或没有染色的标本时，应将光线调暗一

8、些后，再现察。2）高倍镜的使用(1) 依照上述操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。(2) 将需要观察的部分移到视野的中央。(3) 眼睛从例面注视物镜，用手移动转换器换高倍镜。(4) 眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动纫调节钮，直至视野内看到清晰的物像为止。如按上述操作仍看不到物像时，可能由下列原因造成： 观察的部分不在视野内，应在低倍镜下寻找到后再换高倍镜观察。 标本片放反了，应将标本片放正后，再按上述步骤操作。 焦距没调好，应仔细调节焦距。有的显微镜高倍镜与低倍镜不配套从低倍镜转换高倍镜时，往往转不过来或损坏标本，如遇到这种情况，可把镜筒略升高(或载物台下降)，直接用高倍镜调焦。方法是：从侧面

9、注视物镜，调节粗调节钮，使高倍镜头下降至与标本片最短距离，再观察目镜视野，缓慢调节细调节钮，使镜头缓缓上升，直至物像清晰为止。如需要更换标本片时，应该先把镜筒升高(或载物台下降)，然后把标本片移到载物台前方，再取下。3）油镜的使用(1) 先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到物像，把要放大观察的部分移到视野中央。(2) 把高倍镜移开，在标本片上滴一滴香柏油，眼睛从侧面注视镜头，轻轻转换油镜，使镜面浸在油滴中。在一般情况下，转过油镜即可看到物像，如不清楚，可来回调动细调节钮，即可看清物像。如仍看不清，应按上述步骤重新操作。(3) 找到物像后，再调节聚光器和光圈选择最适光线。(4) 油镜使用完毕后，上升

10、镜头约10mm，把镜头转到一边，用擦镜纸把镜头擦净。如仍擦不干净，可用擦镜纸蘸少许二甲苯轻擦，然后再用干净的擦镜纸擦一遍。(5) 有盖片的标本片，可用擦镜纸蘸少许二甲苯，把油擦净。4）使用练习低倍镜使用练习：取一张A字片，用低倍镜观察。练习对光、调焦，并注意观察物像与玻片移动方向是否一致，镜下观察的字母是正像还是反像？高倍镜使用练习；取一张羊毛交叉片(染成红色)先用低倍镜观察，找到羊毛交叉点，移到视野中央，换高倍镜观察。调节焦距，注意观察上下羊毛的清晰度。油镜使用练习：取一张人血涂片，先用低倍镜、高倍镜观察，再练习用油镜观察。注意比较三种物镜的放大倍数和分辨率有何不同。练习分辨红细胞、白细胞和

11、淋巴细胞。练习擦洗油镜头和标本片。4.使用显微镜的注意事项(1) 取显微镜时必须右手握住镜臂，左手托镜座，切勿一手斜提，前后晃动，以防镜头或其他零件跌落。(2) 观察标本时，显微镜离实验台边缘应保持一定距离，以免显微镜翻倒落地。(3) 使用时要严格按步骤操作，熟悉显微镜各部件性能，掌握粗、细调节钮的转动方向与镜筒升降关系。转动粗调节钮向下时，眼睛必须注视物镜头。(4) 粗、细调节钮要配合使用，细调节钮不能单方向过度旋转，调节焦距时，要从侧面注视镜筒下降，以免压坏标本和镜头。(5) 用单筒显微镜观察标本，应双眼同时降开，左眼观察物像，右限用以绘图，左手调节焦距，右手移动标本或绘图。(6) 禁止随

12、意拧开或调换目镜、物镜和聚光器等零件。(7) 显微镜的光学部件不可用手指、纱布、手帕或其他租糙东西擦拭，以免磨损镜面。需要时只能用擦镜纸擦拭。(8) 凡有腐蚀性和挥发性的化学试剂和药品，如碘、乙醇溶液、酸类、碱类等都不可与显微镜接触如不慎污染时，应立即擦干净。【思考题】1 为什么使用高倍镜或油镜时，必须从低倍镜开始？2 显微镜下看到的物像是正像还是反像?物像与玻片的移动方向有何关系？【作业】1 填图注明光学显微镜各部件的结构名称。2 怎样区分低倍镜、高倍镜和油镜?3 简述使用低倍镜、高倍镜和油镜的主要步骤。实验二 倒置、荧光显微镜的原理和应用多年来，光学显微镜在细胞生物学研究领域中发挥了重要作

13、用。随着现代生物学技术与光学显微镜技术的结合，进一步研制出了多种有特殊功能的光学显微镜，使光学显微镜的应用技术从单纯形态学研究扩展到动态研究细胞结构与功能关系的领域。常用的特殊显微镜有倒置相差显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜和微分干涉显微镜等。【实验目的】1.掌握倒置相差显微镜的原理、用途和使用方法。2.熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方法。3.理解暗视野显微镜的原理、用途和使用方法。【实验用品】1.器材：倒置相差显微镜、荧光显微镜、吸水纸、载物片、盖玻片、擦镜纸等。2.试剂：培养细胞用液、吖啶橙荧光染料。3.材料：培养细胞。【实验内容】1.倒置相差显微镜1）成像原理图2-1 相差显微镜位相环

14、合轴调整波长、频率、振幅、相位是所有波的四种基本属性。在人的视觉中波长(及频率)的变化，表现为颜色的不同，振幅变化表现为明暗的不同，而相位变化人眼是感觉不到的。当光通过透明的活细胞时，虽然细胞内部结构厚度不同，但波长和振幅几乎没有改变，只是相位有了差别，所以用普通的光学显微镜无法看清未经染色的活细胞的内部细节。相差显微镜利用光的衍射相干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件，在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用于观察无色透明活细胞中的细节。倒置显微镜的光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，它们之间主要差别是倒置显微镜

15、的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的下方，因此，可以用来观察生长在培养瓶皿底部的细胞状态。它与相差装置配合，用来观察培养的话细胞。2）使用方法：(1) 首先将显微镜合轴。(2) 把视野光圈开大至与聚光器光阑边缘一致。(3) 将与物镜放大倍数一致的相板插入光路。(4) 把调中目镜换入目镜筒中，旋动调中目镜上的调焦环至相板相环的图像清晰。(5) 调节聚光器上的相环调中螺钮(注意不要旋动聚光器的调中钮)，使两个圆环图像重叠成同心圆状态。此时的相差装置就调节好了。换回目镜即可用于观察。注意：当换不同倍数的物镜时都要选用相一致的相板和相环，并重新调中。否则，相差成像效果不佳。3）注意事项(1) 载物片

16、或培养瓶必须乎整、均匀不好。标本不能太厚否则相差显微成像效果不佳。(2) 标本要在有水的环境中(如培养瓶中有培养液)，要用水封片等，成像效果才明显。(3) 裁物片、培养瓶的表面要干净，否则观察的视野中显示许多小的圆斑影响观察效果。(4) 光路上最好加单色滤光片，如黄/绿色滤光片，在此单色光下，相差显微镜的分辨力最高。4）用途例置相差显微镜主要用于观察正在培养的活细胞的生活特性，如细胞的生长、运动、发育、分裂、分化、衰老、死亡过程中细胞形态及其内部结构的连续变化。与缩时连续摄影或摄像结合使用，可真实记录下这些渐变过程。比用定时染色、切片观察记录再拼接起来的方法要完整、准确、真实。5）示教内容 观

17、察倒置相差显微镜下的培养细胞，注意与普通显微镜下(可把培养瓶翻转过来将细胞面朝上观察)的相同标本进行比较。2.荧光显微镜荧光显微镜是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。1）成像原理某些物质受紫外线照射时可发出荧光，这种物质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质，如维生素、脂褐素、核黄素等经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分虽然受照射后不发荧光，但可以与某些荧光物质，如酸性品红、甲基绿、吖啶橙等结合，经紫外线照射后可诱发出荧光。荧光显微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置，可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位

18、置。荧光显微镜与普通光学显微镜结构基本相同，主要区别在于光源和滤光片不同。光源：通常用高压汞灯作为光源，可发出紫外线和短波长的可见光。滤光片：有二组，第一组称激发滤片，位于光源和标本之间，仅允许能激发标本产生荧光的光通过(如紫外线)：第二组是阻断滤片，位于标本与目镜之间，可把剩余的紫外线吸收掉，只让激发出的荧光通过，这样既有利于增强反差，又可保护眼睛免受紫外线的损伤（图15）。荧光显微镜不仅可以观察固定的切片标本，而且还可以进行活体染色观察。2）荧光装置的调节（1）荧光灯开启 打开电源开关，当电压表的指针稳定在220v时再进行下一步操作。 启动高压汞灯：按启动健，汞灯即可燃亮。汞灯达稳定状态后

19、，再进行操作。 移开光帘，光线进入光路。（2）调中光轴 将灯镜摆入光路。 选用滤片。 放一张标本片在载物台上，选20×物镜，调焦到成像。关小视场光圈，调节到光圈在标本平面上成像。调节聚光器调中钮至光圈图像居中。然后，恢复光圈到与视野等大。（3）调中光源 将灯前镜摆入光路。 拨动灯前镜调焦杆，使灯影光斑清晰。 先调节灯泡调中钮，到灯影光斑居中，再调节反射镜调中钮调中。 最后将灯前镜摆出光路，即可正常使用。3）注意事项(1) 观察对象必须是可自发荧光或已被荧光染料染色的标本。(2) 载物片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质。(3) 选用效果最好的滤片组。(4) 荧光标本一般不能长久保存，若

20、持续长时间照射(尤其是紫外线)易很快褪色。因此，如有条件则应先照相存档，再仔细观察标本。(5) 启动高压汞灯后，不得在15min内将其关闭，一经关闭，必须待汞灯冷却后方可再开启。严禁频繁开闭，否则，会大大降低汞灯的使用寿命。(6) 若暂不观察标本时，可拉过阻光光帘阻挡光线。这样，即可避免对标本不必要的长时间照射，又减少了开闭汞灯的频率和次数。(7) 较长时间观察荧光标本时，最好戴能阻挡紫外光的护目镜，加强对眼睛的保护。4）荧光显微镜的用途荧光显微镜技术通常用于检测与荧光染料共价结合的特殊蛋白质或其他分子。由于它灵敏度高，用极低浓废荧光染料就可清楚地显示细胞内特定成分，故可进行活体观察。因此，可

21、以用来观察活细胞内物质的吸收与运输，化学物质的分布与定位等。近年来发展起来免疫荧光显微技术，可将荧光素标记抗体，利用抗体与细胞表面或内部大分子(抗原)的特异性结合，在荧光显微镜下对细胞内的特异成分进行精确定位研究。与分光光度计结合构成的显微分光光度计，可对细胞内物质进行定量分析，精确度高，可测得10-15g的DNA含量。由于荧光显微横技术具有染色简便、标本色彩鲜艳，敏感度高、特异性强的特点，在细胞生物学研究领域已被广泛应用。5）示教内容人口腔粘膜上皮细胞DNA与RNA显示(吖啶橙染色)3.暗视野显微镜暗视野显微镜是根据光学中丁达尔原理设计的显微镜，可用来研究活细胞的形态和运动。1）原理它与普通

22、显微镜构造基本相同，所不同的是用的聚光器不同。这种特殊的聚光器，使主照明光线成一定角度斜射在标本上而不能进入物镜，所以视野是暗的。只有经过标本散射的光线才能进入物镜被放大，在黑暗的背景中呈现明亮的像。显示的图像只是物体的轮廓，分辨不清物体内部的微细结构。但这种照明方法能提高人眼对微小物体的识别能力，可显示出4nm以上的微小粒子的存在和运动。通常用来观察活细胞的运动。2）调节方法(1) 按普通明视野显微镜把显微镜调整好。(2) 换上暗视野聚光器和被检标本片。(3) 调节聚光器和物镜的上下工作距离，看到标本的图像(4) 调节聚光器的上下铀和中轴，在视野滑晰的前提下，背景越暗越好。(5) 把灯泡亮度

23、、视野光圈和聚光器的孔径光圈开到最大，此时的暗视野效果最佳，可用以观察标本。3）注意事项(1) 聚光器与物镜的数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径，否则，暗视野效果不好(2) 盖玻片和截物片应清洁无伤痕，否则它们上面的斑点、裂痕均会发射明亮的散射光，影响观察4）暗视野显微镜的用途(1) 用来观察小于1m物体的存在，这是其他光学显微镜观察不出来的。(2) 观察活细胞的运动。尤其是配合显微摄影技术，可记录一个细胞成细胞器的运动轨迹，借此可分析它的运动方向，乃至速度等。5） 示教内容观察示教台上暗视野显微镜上的标本，并与普通光学显微镜中的标本比较。【作业】 1）简述倒置相相差显

24、微镜的原理及用途。2）荧光显微镜有哪些特有装置？有何用途?实验三 显微摄影技术显微图像是细胞学研究中不可缺少的内容。随电子技术和数字化信息业的发展，使显微图像的记录更方便、快捷、真实，其中摄影记录显微图像是最简单、经济、有效的方法，也是结合其他辅助手段深入分析处理图像的前提。【实验目的】(1)了解显微摄影装置的工作原理和操作步骤。(2)了解黑白胶片冲洗和放大技术。【实验器材】(1) 器材：显微摄影显微镜、135全色胶卷、滤色片、黑白放大机、显影罐、定时钟、显、定影盘、竹片夹、3号放大纸、上光机、切纸刀、塑料盆。(2) 试剂：D72、D76显影液、F5酸性定影液。(3) 材料：标本片或培养细胞。

25、【操作方法】1.显微摄影装置显微摄影装置最基本的结构就是：显微镜十照相机。为了提高效率和效果又增加了一些辅助装置，如：摄像目镜、调焦取景目镜、测光装置或自动感光装置等。简单的摄影装置就是将普通照相机架在显微镜的目镜上方，照相机镜头前镜片正好在显微镜的出眼点略上一点，即可拍摄到标本的图像。实用的装置是在显檄镜的目镜座上方分出一个光路，装入专用摄影目镜，再装上一个相机机身(即无镜头的相机)。这样观察标本与拍摄互不干扰，工作效率提高。由于相机直接固定在显檄镜上，又用了专用的显微摄影目镜，所以效果更好。在较好的摄影装置中加还装了测光系统，可提供感光量参考值；有的还有自动控制感光装置，似“傻瓜”相机，以

26、图像亮度自动设定感光时间，并据此开启快门曝光。再高档些配有记忆感光，多张胶片按相同感光量感光，常用于较大面积的分区摄影；重复感光，在一张胶片上多次感光，把不同视野中的图像拍在同一张底片上，便于比较观察。2.胶卷的分类用于显微摄影的理想胶卷应该是：高分辨力、大反差、色饱和度高而颗粒细，感光灵敏度高。1）胶片的分类(1)按色彩分：彩色和黑白的。(2)按尺寸分；135、120、等。(3)按感光灵敏度分，高感光度；低感光度。(4)按成像性质分：负片和反转片。(5)按色彩要求分；日光型和灯光型。3胶片的选择可分为黑白胶卷和彩色胶卷，可根据拍摄材料需要进行选择。1)一般选用黑白胶卷，其优点是清晰度高，效果

27、易控制、操作筒单、保存长久。彩色胶片适用于表现复杂色彩的标本，可鲜明、真实地显示要观察的结构，但效果较难控制。2)尽管负片尺寸越大效果越好，但135胶卷在分辨力、机械强度方面巳相当不错，能胜任大比例的放大。所以，一般选用135胶卷。3)对于显微摄影来说，选用高感光度的胶卷是要经常考虑的。显微图像反差弱，色泽暗淡、贫乏，清晰度低，亮度低等是其先天的不足。看前三个因素，应选低感光度胶卷。它反差系数大，色饱和度高，清晰度好。而看第四个因素，却应选高感光度胶卷，但它的反差系数小，色饱和度低，清晰度差。综合考虑，在感光度能达到要求的范围内，越低越好。当然，有些情况必须用高感光度胶卷，如亮度太低的荧光标本

28、、运动速度较快的细胞运动等。4)负片与反转片都常用于显微摄影。对彩色片来说，负片的品种较多、经济、感光宽容度大，易操作等，但由于条件所限，无法自己亲自扩印，只好由彩扩部门代为制作。而他们不了解显微图像的特殊性、往往得不到满意的照片。尽管反转片较贵，操作较严格，但它的感光量，色彩还原，能被显微摄影者直接控制，能按自己的意图，呈现画面，色饱和废高，层次丰富，若经济及技术条件许可，应作为首选。4.光源显微镜的光源多是钨丝灯此时应选用灯光型彩色片。但灯光型的不易买到。也可用日光型的代替，但应在光路中加滤色片以调整色温。5.显微摄影装置的使用常用的显微摄影可分两种，一种是在摄影光路分出一个侧目镜。调节此

29、侧目镜的调焦环至其中的双“十”字的线条呈分开的双线(四对)，此时看到的标本图像就是将在胶卷上被记录下来的状态。另一种是不带侧目镜的，而是在观察目镜中有一片带格标尺，调节观察目镜上的调焦环至有格标尺清晰，在此看到的标本图像就是将在胶卷上被记录下来的状态。另外，可根据需要来设置感光度、快门时间或自动曝光、重拍、连拍、数值记录等。这些装置在摄影系统上都较直观，易操作。6.滤光片的选择显微摄影对滤光片的使用比一般观察时要重要的多，配合得不好，会使拍摄效果大失水准。（尤其是彩色摄影时滤光拍摄黑白胶卷时），为了达到最高分辨力和反差，应选用与标本颜色互补的单色浊光片。如红色的标本选用蓝色滤光片，紫红色的标本

30、选用绿色滤光片等。较简单的方法是：换用各种颜色的浊光片观察一下，镜下的视觉与将在胶片上形成的效果相似。拍摄彩色胶卷时，使用滤光片要考虑的因索较多。如，用灯光做光源的显微镜，选用日光型胶卷时，在光路上要加蓝色滤光片(如雷登80A型滤光片)把光线色温从3200K左右提高到5500K左右，适合于日光型胶卷对光色温的要求。否则，拍出的照片会偏色。滤光片的选择要根据需要的效果、所用的标本状况，光源性质和胶片持性等灵活掌握。例如，显微荧光摄影时，虽然用的是灯泡光源，但却不是发3200K色温的普通钨丝灯泡，而是高压汞灯，发出的是短波长光线，靠它激发产生荧光，故不能再加任何摄影用滤光片；再如用相差显微镜拍摄时

31、，标本往往是无色透明，但在相差显微镜下呈现黄绿色，较适合人的视觉心理正色温。否则，反而感到不真实。7.显微摄影需重视的几个问题1)选择质量好的标本图像，这是拍摄到满意照片的前提，应引起拍摄者的高度重视。2)要选择合适的感光材科。3)严格地调整显微镜，调整不当所导致的不良现象，在普通观察时不易察觉到。但在照片上的差异却持别引人注目，如视野内亮度不均匀。4)选用合适的滤色片。5)调焦要准。包括两个方面，一是对目镜(侧目镜)的调焦，二是对物镜的调焦。6)光线强度要适当，使标本图像的反差，色彩饱和度达到满意。7)感光过程中应绝对避免振动，否则会导致记录图像的模糊。8)感光更正确。测光表提供的感光时间仅

32、是参考。尽管多数情况下此值与正确感光值是一致的。如暗背景的感光量应比测得值减少12倍；明视野背景下的很小面积的图像时(如拍摄染色体散开)应增加12倍。8.暗室技术一般地说，彩色片(包括负片和反转片)必须送到专业店去冲扩。而黑白感光材料处理容易，效果易控制，出样快等，适合于就地冲扩，被大多数实验室所采用。1）感光纸根据反差系数大小分为：1号反差系数小，适合制作低反差照片，层次丰富；2号反差系数适中；3号反差系数大，一般的细胞结构照片可采用它，4号反差系数最大，层次少，适合于制作黑白分明的结构照片，如染色体，电泳等。黑白感光纸，对红光迟钝，可在较暗的红灯下操作(如15w)但绝非不感红光。所以，不能

33、距红订太近(最好大于0.5米)。注意，除感光纸之外，感光材料大都感受所有光线。所以，黑白全色胶卷，各种彩色负片，彩色反转片均不能在红光下打开暗盒，否则就报废了。2）显影液及定影液显影液和定影液的种类很多。黑白照片冲印常用显影液有两种，定影液一种。胶片显影常用D76，相纸显影常用D72。定影则常用F5。除非是很待殊的情况，不必再选择其他种类的配方，用不熟悉的配方，反而不易控制。上述显影和定影液配方如表3-1和表3-2所示。 表3-1 常用显影液配方（用途：胶卷、相纸）药品D72D76米吐尔2.0g3.1g无水亚硫酸钠100g45g几奴尼(对苯二酚)5g12g硼砂(四硼酸钠)2g碳酸氢钠76.5g

34、溴化钾1.9g水1000 ml1000ml 表3-2 常用的酸性定影液（用途：胶卷、相纸）硫代硫酸钠240g无水亚硫酸钠7.5g36乙酸21m1水1000ml 3）冲洗胶卷建议用显影罐冲洗，此法效果稳定，稍加训练后，就可把握。在全黑暗的环境中(如暗室或暗袋中)，将胶卷装入显影罐。注入显影液后要拍打一下罐体，以驱赶掉附着在胶卷上的气泡；而后转动胶片轴，每分钟正反转动2次，使液体有可能循环；到时间后倒出显影液，注入定影液，常搅动。而后倒出定影液，开盖，自来水流水冲洗10min，挂起晾干。4）印放照片一般在暗室中红灯光下操作(以放大为例)。(1)调焦：把底片放入放大机后，打开光源，将镜头光圈打到最大

35、(此时亮度大，易准确调焦)，升降放大机和镜头，直到图像大小合适、细节清楚。收小光圈23档(此时图像效果最好)。(2)试小样：用一张较小的放大纸，用多级感光方法，如：先感光5s，遮住13面积，再感光5s，再进一步遮住23面积感光5s。这样一张放大纸上有三级感光量，显、定影，选出合适的感光时间，就可正式故大照片。(3)放大照片的基本技术：裁剪画面：选合适的区域，放置同样大小的相纸，就可以得到仅有画面某一区域的照片。边挡面画：在放大感光的过程中，用遮挡光线的方法，使不需要的区域无感光或过度感光，此区域就是呈现白的或黑的，达到不显示此处画面的目的。叠放画面；将需要比较的两个(或多个)画面的底片放在一起

36、放大，照片上的两个结构精细且极有说明力的图像可同时表现出来。(4)定影完毕的照片，要用流水冲洗15min(比胶卷稍长，因纸质吸的药品较多，不易洗净)以上，然后用上光机烘干上光。(5)注意事项：底片在放大机中不要拉动，以免划伤药膜面，造成白或黑斑。感光过程严防振动，以免照片图像发虚。显影液的温度和时间不要偏离参考值太远，要试小样。有时往往图省事不按要求做，结果反而更麻烦。需要长久保存的底片，照片一定要定影透彻水洗彻底，否则，过一段时间，照片会发黄。 【作业】1拍摄体外培养的细胞，并冲洗放大黑白照片一张。2感光胶卷有几大类？显微摄影时应如何选择？3取得好的照片的关键因素是什么？实验四 细胞培养的准

37、备工作细胞培养是一种程序复杂、要求严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，供给细胞存活所必须的条件，如水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖、生长因子等，还要受到温度、渗透压、pH等多种因素的影响。细胞培养用品的清洗、培养用液的配制、除菌等均有严格的要求，特别是无菌操作，是细胞培养成败的关键。为此，本次实验分两部分进行，理论部分重点介绍体外培养细胞的生存条件、培养用品的清洗与消毒、无菌操作基本要领和要求及细胞培养用液；实践部分分别在细胞培养室、细胞培养准备室进行。【实验基理】1.培养细胞的生存条件体外培养细胞所需要的生存条件和物质代谢过程与体内细胞基本相同，但随生存环境的改变也会

38、出现一定的差异。1）无菌环境防止污染是保证细胞在体外存的基本条件之一。在培养环境中不得有细菌、病毒、支原体、真菌或其他微生物的存在，因此，在细胞培养过程中要努力做到最大限度的无菌。要保持无菌环境，必须严格做到：细胞培养用品要经高压灭菌处理后才能使用，培养用液要经过除菌处理，实验过程要严格按照无菌操作规程进行。2）水水对维持培养细胞的生命活动是十分重要的。体外培养的细胞对水的质量非常敏感，在培养用液中任何对细胞有害的物质都会影响培养细胞的生存。因此，要求培养细胞用液必须使用新鲜三蒸水或去离于水配制。3）温度适宜的温度是保证细胞在体外生存的重要条件，人和哺乳动物的细胞最适宜的培养温度为36.5土0

39、.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。4）渗透压人血浆渗透压约290 mmol/L(290 mOsmkg)，可视为培养细胞的理想渗透压。对大多数细胞来说，渗透压在260320mmol/L(260320mOsm/kg)范围都适宜。5）PH值 多数培养细胞的适宜PH为7.07.4，偏离此范围会对细胞产生有害影响。但各种细胞对pH的要求也不完全相同，一般情况下原代培养的细胞对pH的变动耐受差，连续性细胞系耐受性强。6）氧气和二氧化碳细胞培养中O2和CO2是细胞生存所得要的重要条件。O2参与三羧酸循环，可为细胞提供能量。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，并与维持培养液的p

40、H有直接关系。7）营养条件体外培养的细胞所得营养必须从培养液中获取。当前在细胞培养中，广泛使用合成培养基，其主要成分由氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其他一些辅助物质组成。根据培养对象和目的不同，已设计出多种培养基，常用的有：M199、RPMI1640、MEM、DMEM、F10、F12等。对于动物细胞来说，合成培养基只能维持细胞的生存，要想使细胞更好地生长和繁殖，还需补充部分天然培养基，如人和动物的血清、血浆和胎汁等。通常是添加1020的小牛血清。无血清培养基是由基础培养基和替代血清的补充因子组成，如生长因子、激素，促贴附物、转铁蛋白等活性物质，这类培养基正在发展中。8）培养基质培养基质也

41、就是细胞附着底物。绝大多数细胞都适于贴附在玻璃和一次性塑料培养瓶(皿)上生长。一些不易贴壁的细胞，可以事先在培养瓶、皿底内面涂上一层鼠尾胶、小牛皮胶或多聚赖氨酸等，以促进细胞贴壁生长。2.培养用品的清洗在培养环境中无毒、无菌是保证培养细胞生存的必须条件，因此对培养器皿的清洗和灭菌是极为重要的环节。1)玻璃用品的清洗在细胞培养中，工作量最大的是玻璃器皿的清洗。清洗后的玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。某些化学物质仅百万分之一毫克，也会对细胞产生毒性作用。因此，玻璃器皿的清洗必须严格按照程序进行。一般玻璃器皿的清洗包括：浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤(图4-1)。图4-1 培

42、养用品清洗和消毒程序黑箭头：橡胶制品；白箭头：玻璃制品。（1）浸泡：初次使用和培养用后的玻璃器皿都需要先用蒸馏水浸泡，以使附着物软化或被去掉。培养后的玻璃器皿多有大量蛋白质，干涸后不易刷洗掉，故用完后应立即初步刷洗，然后浸泡在蒸馏水中。注意要让水完全进入瓶皿中，不要留有气泡。使用新的器皿时应先用自来水简单刷洗，然后用稀硫酸(5)漫泡过夜或煮沸30min，中和其中的碱性物质后再清洗。（2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿要用软毛刷和优质洗涤剂(加热)刷洗，以去除器皿内外表面的杂质。刷洗时注意不要留死角。（3）浸酸：刷洗不掉的极微量杂质经过清洗液浸泡的强氧化作用可被除掉。清洗液对玻璃器皿无腐蚀作用，去污十分

43、有效，是清洗过程中关键环节。目前常用的清洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成。浸泡时器皿要充满洗液，不留气池。浸泡时间不应少于6h，一般应浸泡过夜。清洗液可根据需要，配制成不同强度，常用的有下面三种；强 液：重铬酸钾63g，浓硫酸1000m1，蒸馏水200m1。次强液；重铬酸钾120g，浓硫酸200m1，蒸馏水1000ml。弱 液：重铬酸钾100g，浓硫酸100m1，蒸馏水1000mI。新配制的清洁液为棕红色，经多次使用，水分增多或遇有机溶剂时成为绿色，这时表示清洁液巳失效，应废弃而重新配置。（4）冲洗：玻璃器皿浸酿后必须用流水充分冲洗，每个器皿用流水充满、倒掉，必须重复10次以上，

44、不留任何残迹。最后用蒸馏水漂洗23次，用双蒸水或三蒸水冲洗1次，烤干备用。玻璃滤器原则上与玻璃器皿清洗方法相同。无论是浸泡还是浸酸、冲洗，都需用抽滤的方法进行。2)橡胶用品的清洗胶塞类橡胶用品，每次用后先用蒸馏水浸泡，然后用2NaOH溶液煮沸1520min，用自来水冲洗干净，再用1稀盐酸溶液浸泡30 min，再用自来水冲洗、蒸馏水洗23次，最后双蒸或三蒸水漂洗1次，烤干后备用。3)金属器械的清洗；新的解剖器械应先用纱布擦去防锈油后，再用洗涤剂煮沸刷洗，然后用自来水、蒸馏水、双蒸馏水冲洗，焙干备用。4)塑科器皿的清洗：细胞培养使用的塑料器皿主要有培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要是进口的一次

45、性商品，已经消毒灭菌，打开就可使用。如想反复使用，清洗方法如下：用后立即用流水清洗或浸泡在水中，用脱脂棉轻轻擦拭掉残留附着物或用超声波清洗机清洗后，用流水冲净，浸泡在清洗液中过夜，再用自来水冲净。蒸馏水冲洗23次，最后三蒸水冲洗2次，晾干备用。3培养用品的消毒灭菌所有培养物品在消毒灭菌前必须进行适当的包装，以保证灭菌后不受外界的污染。消毒灭菌的方法有多种，随物品不同，采用的方法不同。总的来说有物理方法和化学方法两大类。物理法包括；湿热(高压蒸汽)、干热、过滤和紫外线等方法杀灭或去除微生物。化学法是使用化学消毒剂、抗生素等杀灭微生物。1)湿热灭菌：湿热灭菌即高压蒸气灭菌，是最常用和最有效的一种方

46、法。布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌。各种物品有效消毒灭菌压力和时间不同，一般培养用液、橡胶制品要求4.5kg(114)，1020min或3.6kg(112)30min；布类、玻璃制品、金属器械等为6.8kg(121)20min。2)干热灭菌；主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌。用电热鼓风干燥箱加温到160，保持1h，可达到消毒目的。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热消毒法。3)滤过除菌：大多数培养用液，如人工合成培养液，血清、酶溶液等，在高温下会变性，失去功能，因此必须采用滤过法除菌。玻璃滤器适用于各种培养液的滤过除菌。玻璃滤器根据滤板的孔径分为：G1G6几种规格，

47、一般采用G6型(孔径在1.5m以下)，可达到除菌目的。微孔滤膜滤器，有一次性和反复使用的两种，滤膜孔径选用0.22m。一次性滤器打开后就可使用。其他各种滤器必须清洗后经高压蒸汽消毒、烤干后方可使用。4)紫外线消毒：常用来消毒空气，操作表面和一些不能用其他方法消毒的物品(如塑料培养皿等)。一般距紫外灯2.5m范围内直接照射20min即可。5)消毒剂及抗生素：细胞培养室的工作面、墙壁、地面和空气等可用消毒剂进行灭菌处理。如：75%乙醇溶液常用于皮肤和瓶皿开口部位的消毒；0.1苯扎溴铵是目前常用的消毒剂，可以对器械、皮肤、操作面进行擦拭和浸泡消毒：乳酸可用于空气消毒；来苏儿可用于地面消毒；过氧乙酸消

48、毒能力很强，在0.5的浓度下，10min就可将芽抱茁杀死。抗生素主要适用于培养用液消毒灭菌，不同种类抗生素适于杀灭不同微生物，多数是为了预防。最常用的抗生素为青霉素、链霉素和庆大霉素等。常规培养用液抗生素浓度为：青霉索100U/ml、链霉家100U/ml、庆大霉索50100g/ml。4. 无菌操作的基本要领和要求在细胞培养中防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以在一切操作中要努力做到最大限度的无菌，防止污染。为达到这一要求，所有工作要进行得有条不紊和安全可靠。1）培养前的准备要充分做好培养前的实验用品准备工作，根据实验的要求进行物品清点包装，注明标签后灭菌

49、、烤干备用。在工作前放入超净工作台内。2）超净工作台的消毒工作面先用新吉尔灭擦拭一遍后，打开紫外线灯灭菌；用30 w紫外线灯管宣接照射2030 min。然后关闭紫外灯，打开风机。培养用液和培养细胞不能放在紫外线下直接照射。3）洗手和着装原则上与外科手术洗手相同：先用肥皂刷洗手和前臂，再用流水冲洗，然后用0.2苯扎溴铵或75酒精锦球擦洗。穿无菌服，戴无菌帽和口罩。4）火焰消毒在无菌条件下操作时，首先要点燃酒精灯，此后一切操作，如安装吸管橡皮头、打开瓶塞、使用吸管等都要经过火焰烧灼，或在近火焰处进行。注意时间要恰当。5）无菌培养操作烧过的用具要待冷却后才能挟取组织，以免造组织损伤。进行细胞培养操作

50、时，动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及器皿的无菌部分，如已接触，要更换或用火焰烧灼触及部位。为拿取方便，工作台面上的实验用品布局要合理，原则上为右手使用方便的用品放在右侧，左手用品放在左侧。培养用液不要过早开瓶，不要长时间直立暴露开口，以免增加污染机会。吸取不同培养用液时，应分别使用不同的吸管，以防扩大污染或增加混淆不同细胞的机会。【实验设备及常规用品】1.实验设备无菌室、CO2培养箱、超净工作台、电冰箱、离心机、倒置相差显微镜、数码摄影装置、水纯化装置、抽滤装置、电子天平、液氮罐、洗刷装置、各类培养用品等。2.实验用品常规实验用品如表4-1所示。表4-1

51、常用实验用品的规格及数量 表4-2 共用实验用品的规格及数量(四)细胞培养用液细胞培养用液是维护细胞在体外生存、生长、繁殖以及在细胞培养操作过程中所需的基本溶液。培养用液主要有三大类：平衡盐溶液、常用基本试剂和培养基(液)。所有培养用液采用三蒸水配制。1平衡盐溶液平衡盐溶液(BSS)主要是由无机盐和葡萄糖组成，具有维持渗透压，调节酸碱平衡，为细胞生存提供所需能量和无机离子等成分。还可以用作洗涤组织细胞，配制各种培养用液的基础溶液。BSS内含有少量酚红作为pH变化的指示刑，溶液变酸时呈黄色，变碱时呈紫红色，中性时呈桃红色。目前最常用的BSS是Hanks液、PBS液和DHanks液等。以下是几种常

52、用的BSS配制方法。表4-2 常用平衡盐溶液的配方（g/500ml）成分PBSTyrodeEarleHanksDuldeccoD-hanksNaCl4.004.003.404.004.004.00KCl0.100.100.200.200.100.20MgCl2·6H2O0.050.05MgSO4 ·7H2O0.100.10Na2HPO4·2H2O0.780.030.03NaH2PO4·2H2O0.0250.020.71KH2PO40.100.030.100.03NaHCO30.501.10.1750.175葡萄糖0.500.500.50酚红0.010.0

53、10.010.01无水CaCl20.100.100.070.05配制方法： A液配制：将前9项逐次溶于400ml超纯水中（18.2 M）。 B液配制：将CaCl2单独溶于80ml超纯水中，待其完全溶解后与A液混合。 加入酚红，定溶到500ml。 定溶后用孔径0.22m 的滤膜过滤除菌，4保存。2）常用试剂常用试剂主要有：用来分散细胞，制备细胞悬液的消化液；调整各种培养用液的pH调整液，防止培养过程中发生污染的抗生素和指示液体酸碱度(pH)的酚红溶液。(1)消化液：最常用的是0.25的胰蛋自酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，它们可以单独使用，也可以按一定比例混合使用。 25胰蛋白酶：胰蛋白酶粉0

54、.25g，加DHanks液100m1，完全溶解后，调整pH至7.4，过滤除菌，用青瓶分装，密封后-20冰箱保存。 0.02EDTA液：EDTA 0.02g，加D-Hanks液l00m1可高压蒸汽灭菌，用前调整pH至7.4，4冰箱保存。(2)pH调整液：用来调整各种培养用液pH值，通常单独配制。 7.4NaHCO3溶液：7.4g NaHCO3加超纯水至100ml，完全溶解后，过滤除菌，分装于青瓶，密封后4冰箱保存。 1N的HCl：36HCl 8.4ml，加超纯水至100m1，过滤除菌，分装于青瓶，密封后4冰箱保存。(3)抗生素液：可将青霉素、链霉素溶于无菌超纯水中，配成2万单位/ml贮存液，分装

55、于青霉素小瓶中，-20保存，配液时加入。(4)0.4酚红溶液：称取酚红0.4g，置玻璃研钵中研细，逐渐加入0.1mol/L NaOH，边滴边研至酚红完全溶解，共加至1128ml为止，将研好的酚红液移入烧瓶中，加三蒸水8872m1。4.5Kg(114)高压灭菌15min，4保存。3）培养液现在各实验室普遍使用商品化合成培养基，主要成分是平衡盐溶液加氨基酸和维生素类。对于动物细胞来说，合成培养基只能维持细胞的生存要想使细胞更好地生长和繁殖，还需补充天然培养基，主要是小牛血清。通常在合成培养基中添加1020小牛血清。目前最常用的合成培养基有：RPMIl640、MEM、DMEM、M199等。配制方法相

56、同，基本步骤是：(1)按说明书准确称取干粉培养基，溶于略少于终体积的超纯水中，根据需要加入Hepes（2.38g/L终浓度），在容量瓶中用超纯水定容。(2)用无菌滤器过滤除菌。(3)分装在无菌贮液瓶中，密封，-4保存（短期）。(4)用前添加血清、抗生素，用NaHCO3调整pH，4保存(短期内使用)。 可根据细胞特点选择不同培养基，添加各种成分。【思考题】1简述体外培养细胞的生存条件。2简述培养用品的清洗和消毒灭菌的方法。实验五 乳鼠成纤维细胞体外培养细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从生物体内获取细胞进行首次培养称为原代培养，当培养的细胞增殖达一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个容器中扩大培养，为传代培养。传代培养的累积次数就是细胞的代数。直接从生物体内获取组织细胞进行首次培养称原代细胞培养。原代培养是获取细胞，建立各种细胞系的第一步，是从事细胞培养工作最基本的技术。原代培