临床医学硕士研究生答辩ppt

1、Genistein后处理介导大鼠海马后处理介导大鼠海马CA1区区eNOS/Nrf2/HO-1信号通路及其神经保护作用信号通路及其神经保护作用研研 究究 生：生：* * * * *导导 师：师：* * * * *教授教授一、研究的背景及意义一、研究的背景及意义1.1.对缺血性脑中风发病机制及防治的研究已成为医学界关对缺血性脑中风发病机制及防治的研究已成为医学界关注的重点。注的重点。2.2.缺血大脑迅速获得血液供应是阻止缺血性神经元损伤的首缺血大脑迅速获得血液供应是阻止缺血性神经元损伤的首要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又进一步加重缺血组要措施，然而，大量的血液迅速再灌注又进一步加重缺血组织的损

2、伤织的损伤-即即缺血再灌注损伤缺血再灌注损伤。3. 3. 氧化应激和炎症氧化应激和炎症是缺血再灌注损伤病理生理机制的重要是缺血再灌注损伤病理生理机制的重要组成部分。脑缺血再灌注早期即有大量活性氧产生，并迅速组成部分。脑缺血再灌注早期即有大量活性氧产生，并迅速启动损伤级联，加剧了初始损害最终导致神经元不可逆的损启动损伤级联，加剧了初始损害最终导致神经元不可逆的损伤。因此，再灌注早期阻断氧化应激损伤是有效降低迟发性伤。因此，再灌注早期阻断氧化应激损伤是有效降低迟发性神经元死亡的关键。神经元死亡的关键。4.Genistein具有具有酪氨酸激酶抑制剂活性酪氨酸激酶抑制剂活性和和抗氧化作用抗氧化作用。5

3、、Genistein作为酪氨酸激酶抑制剂可有效减弱短暂全作为酪氨酸激酶抑制剂可有效减弱短暂全脑缺血造成的神经元的延迟性死亡；一个单纯的氧诱脑缺血造成的神经元的延迟性死亡；一个单纯的氧诱导的脑缺血小鼠模型显示导的脑缺血小鼠模型显示Genistein具有抗氧化活性。具有抗氧化活性。6.eNOS活性的升高对脑中风具有有益作用。另研究发活性的升高对脑中风具有有益作用。另研究发现，现，Genistein能够诱导能够诱导eNOS活性并激活核因子活性并激活核因子NF-E2相关因子相关因子(Nrf2)，进而诱导抗氧化酶表达、减少心血管，进而诱导抗氧化酶表达、减少心血管疾病的发生。疾病的发生。 那么，那么，Ge

4、nistein postconditioning(GPC，即缺，即缺血后给予血后给予Genistein)是否能通过是否能通过eNOS/Nrf2/ARE信信号通路号通路降低氧化应激，从降低氧化应激，从而发挥抗缺血性神经元损而发挥抗缺血性神经元损伤的作用？目前尚未见报道。伤的作用？目前尚未见报道。 本研究采用四动脉结扎本研究采用四动脉结扎(4-VO)全脑缺血模型，全脑缺血模型，观察观察GPC对缺血性神经元的保护作用，并探讨其可对缺血性神经元的保护作用，并探讨其可能的分子机制，为临床防治缺血性脑中风提供理论能的分子机制，为临床防治缺血性脑中风提供理论依据。依据。二、材料与方法二、材料与方法1.1.主

5、要实验仪器和试剂主要实验仪器和试剂 大鼠脑立体定位仪 大鼠脑微量注射泵 冰冻切片机 激光扫描共聚焦显微镜 酶标仪 电泳设备 摇床 Morris水迷宫 超低温冰箱等 组织裂解液 BCA蛋白浓度测定试剂盒 eNOS、p-eNOS、 Nrf2、HO-1一抗及其相应的二抗 NBT/BCIP显色液 NeuN、4-HNE、8-OHdG一抗及对应的荧光二抗 TUNEL试剂盒2.2.实验分组实验分组SPF级成年雄性级成年雄性SD大鼠大鼠随机分组及随机分组及4-VO模型模型ShamI/RVeh1(IR+DMSO)GPCVeh2(GPC+NaCl)L-NAME30m24hI10mI10mI10mI10mI10m3

6、0m6h1d5d椎动脉电凝并分离颈总动脉椎动脉电凝并分离颈总动脉缺血缺血尾静脉注射尾静脉注射Genistein1mg/kg侧脑室注射侧脑室注射L-NAME1mg/5l0.9%NaCl0.1%DMSO3d7d9d3.3.技术路线图技术路线图再灌注再灌注5d检测检测海马海马CA1区神经元区神经元的凋亡及存活的凋亡及存活实验方法及检测指标实验方法及检测指标再灌注再灌注30min,6h,1d,3d 观察观察p-eNOS, Nrf2,HO-1蛋白表达蛋白表达免疫荧光免疫荧光染色法染色法蛋白免疫蛋白免疫印迹技术印迹技术TUNEL染色染色及及NeuN染色染色再灌注再灌注3d观察观察海马海马CA1区神区神经元

7、经元8-OHdG,4-HNE, Nrf2,HO-1蛋白的蛋白的表达及定位表达及定位 Morris水迷宫水迷宫再灌注再灌注7-9d，检测大鼠的空间检测大鼠的空间学习和记忆能力学习和记忆能力4.4.统计学分析统计学分析 数据整理后，应用数据整理后，应用SigmaStat3.5统计软件进行统统计软件进行统计学分析。所有计量资料数值以均数计学分析。所有计量资料数值以均数标准差表示，标准差表示，采用单因素方差分析采用单因素方差分析(ANOVA)，多个实验组与一个，多个实验组与一个对照组比较用最小显著差法对照组比较用最小显著差法(LSD)，各实验组之间比，各实验组之间比较采用较采用q检验检验(Newman

8、-keuls test)，P 0.05为差异有为差异有统计学意义。统计学意义。三、实验结果与讨论三、实验结果与讨论Genistein后处理是否具有神经保后处理是否具有神经保护作用呢？护作用呢？图图1 图图A：NeuN (红色红色) 染色染色 ：生存的神经元；：生存的神经元；TUNEL (绿色绿色)染色：凋亡样神经元；图染色：凋亡样神经元；图B：海马：海马CA1区区1mm 长度内长度内NeuN 阳性神经元数量统计图；图阳性神经元数量统计图；图C：海马：海马CA1区区1mm长度内长度内 TUNEL阳性阳性神经元数量统计图神经元数量统计图; *P0.05 vs. I/R 组，组， #P0.05 vs

9、. GPC 组，组，n=5; 40, bar = 50mNeuN positive cell050100150200250300*#ShamI/RGPC L-NAMEABTUNEL positive cell050100150200250*#ShamI/RGPC L-NAMEC小结小结 1 Genistein后处理对缺血性神经元损伤具有保后处理对缺血性神经元损伤具有保护作用，护作用，eNOS激酶抑制剂激酶抑制剂L-NAME减弱了该减弱了该作用，说明作用，说明eNOS可能参与了此保护作用。可能参与了此保护作用。Genistein后处理是否诱导后处理是否诱导eNOS激活（磷酸化）激活（磷酸化）?图

10、图2 GPC对对eNOS、p-eNOS蛋白表达的影响蛋白表达的影响图图A：再灌注不同时间点：再灌注不同时间点p-eNOS、eNOS蛋白的表达；蛋白的表达；Sh：Sham组；组；R：再灌注；：再灌注；： I/R组；组；： GPC组；组；GPC: Genistein后处理；图后处理；图B： p-eNOS蛋白表达统计图：蛋白表达统计图： n=4； *p0.05 vs. I/R组组 AB图图3 L-NAME对再灌注对再灌注3deNOS磷酸化水平的影响磷酸化水平的影响 图图A：各实验组再灌注：各实验组再灌注3 d p-eNOS蛋白表达；图蛋白表达；图B：各实验组再灌注：各实验组再灌注3 d p-eNOS

11、蛋白表达统计图，蛋白表达统计图，n=5，*p0.05 VS. I/R 组；组；#p0.05 VS. Vehicle2 组组AB小结小结 2Genistein后处理可诱导全脑缺血大鼠海马后处理可诱导全脑缺血大鼠海马CA1区区eNOS磷磷酸化水平升高，酸化水平升高，eNOS激酶抑制剂激酶抑制剂L-NAME可有效降低可有效降低GPC诱导的诱导的eNOS磷酸化水平。磷酸化水平。结果揭示：结果揭示：eNOS磷酸化水平升高参与了磷酸化水平升高参与了Genistein的神经的神经保护作用。保护作用。Genistein后处理是否能有效降低后处理是否能有效降低缺血再灌注后神经元的氧化应激损缺血再灌注后神经元的氧

12、化应激损伤呢伤呢? 4-HNE是脂质过氧化的最终产物，被公认为氧化应激最稳定的标记物是脂质过氧化的最终产物，被公认为氧化应激最稳定的标记物 8-OHdG，是，是DNA氧化损伤的特异产物氧化损伤的特异产物 图图4 全脑缺血再灌注全脑缺血再灌注3 d，各实验组大鼠，各实验组大鼠GPCI/RABGPCI/R图图A：绿色：绿色: NeuN； 红色红色: 4-HNE； 图图B：红色：红色: DAPI； 绿色绿色: 8-OHdG；n=4-5；40； bar =50 m小结小结 3 GPC能有效降低氧化应激损伤；能有效降低氧化应激损伤；eNOS激酶激酶抑制剂抑制剂L-NAME废除了此神经保护作用。废除了此神

13、经保护作用。Nrf2/ARE信号是生物体内抗氧化信号是生物体内抗氧化应激反应最重要的内源性防御系统。应激反应最重要的内源性防御系统。那么，那么，GPC是否通过是否通过eNOS诱导了诱导了此信号通路此信号通路? 图图5 A-C GPC促进促进图图A：再灌注不同时间点核内：再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白表达；图蛋白表达；图B：再灌注不同时间点核内：再灌注不同时间点核内Nrf2蛋白蛋白表达统计图，表达统计图，n=4，*p0.05 vs. I/R组；图组；图C：再灌注：再灌注3d 各实验组各实验组Nrf2 蛋白的表达及蛋白的表达及统计图；统计图；*p0.001 vs. I/R组，组， #p0.001

14、 vs.Vehicle2 组组ACShFold changes0.0.2.4.6.81.01.21.41.61.8I/RGPCR30m R6h R1dR3d*B图图5 D 绿色：绿色：Nrf2 ；红色；红色: NeuN； 黄色：二者的共定位；黄色：二者的共定位；40； bar =30m.L-NAME图图6 ShamA Value(folds vs. sham)0.0.2.4.6.81.01.21.41.6HO-1I/RVehicle2GPCL-NAME*#B图图A-B：HO-1蛋白表达及其统计图；图蛋白表达及其统计图；图C：HO-1与与Nrf2蛋白的共定位，蛋白的共定位，*p0.05 VS.

15、I/R 组；组； #p0.05 VS. vehicle2组；绿色：组；绿色：Nrf2； 红色：红色：HO-1；蓝色：；蓝色：DAPI ；合成；合成图为三者的共定位；图为三者的共定位； 40； n=4-5； bar = 50m；CL-NAMEI/R ShamGPCVehicle2L-NAMEHO-1NeuNA小结小结 4 GPC可显著增加海马可显著增加海马CA1区神经元胞核中区神经元胞核中Nrf2蛋白的表蛋白的表达并引起下游靶基因达并引起下游靶基因HO-1的表达，而的表达，而L-NAME阻断了此阻断了此作用。作用。 此结果进一步揭示此结果进一步揭示GPC通过通过eNOS诱导了诱导了Nrf2/HO

16、-1抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经抗氧化信号通路，从而阻断了缺血再灌注后迟发性神经元损伤。元损伤。海马是学习和记忆的重要部位，而海马是学习和记忆的重要部位，而海马海马CA1区是缺血最敏感的区域。区是缺血最敏感的区域。那么，那么，GPC是否能改善大鼠缺血是否能改善大鼠缺血后空间学习记忆能力后空间学习记忆能力? 图图7 图图A-B：潜伏实验和探索实验统计图；：潜伏实验和探索实验统计图；n=5；*p0.05 vs.I/R组；组；#p0.05 vs.GPC 组组. 图图C-D：潜伏实验和探索实验大鼠游泳路程轨迹图：潜伏实验和探索实验大鼠游泳路程轨迹图DC7d8d9dLatency t

17、ime (sec)020406080ShamI/RGPCL-NAMEDays after ischemia*#AQuadrant Occupancy(sec)010203040506070ShamI/RGPCL-NAME*#Probe trial9dB小结小结 5 GPC能有效的改善大鼠缺血后的空间能有效的改善大鼠缺血后的空间学习和记忆能力。学习和记忆能力。四、总四、总 结结1.GPC对缺血性神经元损伤具有保护作用。对缺血性神经元损伤具有保护作用。2.GPC可通过诱导可通过诱导eNOS磷酸化水平并上调磷酸化水平并上调Nrf2/HO-1信号通路，从而降低脑缺血诱导信号通路，从而降低脑缺血诱导的氧

18、化应激损伤。的氧化应激损伤。3.GPC能有效改善大鼠短暂全脑缺血后的认能有效改善大鼠短暂全脑缺血后的认知功能。知功能。五、不足与展望五、不足与展望1. GPC是否可增加是否可增加Nrf2的的DNA结合活性有待结合活性有待进一步研究。进一步研究。2. GPC是否也触发了其它促生存信号转导通是否也触发了其它促生存信号转导通路（如雌激素受体信号），从而起到抗缺血路（如雌激素受体信号），从而起到抗缺血性神经元损伤的作用。其确切的机制还有待性神经元损伤的作用。其确切的机制还有待多层面、多角度的进一步探究。多层面、多角度的进一步探究。六、致六、致 谢谢 实验和论文的最终完成是我的导师实验和论文的最终完成是我的导师*教授精心指导的结教授精心指导的结果。谨借此机会，向我敬爱的恩师表示最衷心