细胞分子模型1

1、细胞分子模型第1节 概述细胞分子模型与动物模型的区别：动物模型 优点： 传统的筛选方法 直接反映治疗效果、不良反应、毒性作用 预测临床价值、应用前景 不足： 筛选效率低，并非均有疾病模型，动物个体差异，成本高细胞、分子水平药物筛选模型 优点： 耗材少 药物作用机制明确 筛选规模大，高通量筛选 已成为药物筛选的主要方法 快速、微量、大规模为特征的高通量筛选背景：药物的作用机制要从细胞水平去探索潜在的药物作用靶点数目和有待筛选的化合物数目增多特点：筛选规模和筛选速度更大筛选模型的检测技术能够更快速、全面反映被筛样品的生物活性特征p分子水平的药物筛选模型：受体、酶、通道、基因、其他p标准的体外分子水

2、平筛选 优点： 快速 微量 筛选结果准确、稳定，易于评价 不足： 只能对特定靶点的单指标检测 提供化合物对靶点作用的有限信息，无法对化合物的生物活性进行综合评价 单纯的分子水平的高通量药物筛选技术已不能满足新药发现的需要 受体筛选模型 受体与放射性配体结合模型：将受体、配体、被测物及必要的辅助因子一起加入到缓冲溶液中温孵 达到平衡后过滤, 滤纸上残留的即为结合的放射性配体,通过液体闪烁计数来测量 灵敏度高、特异性强 适合大规模筛选 酶筛选模型: 筛选作用于酶的药物 主要观察药物对酶活性的影响 酶的反应底物和产物皆可作为检测指标,由此确定反应速度第节细胞水平药物筛选模型 细胞水平药物筛选模型：以

3、细胞功能为基础的筛选模型(1) 完整细胞，活细胞自然条件下研究药物对生命体功能的影响，接近体内的生化过程，比较准确地了解药物的生物学特性，提供生物相关信息，一次试验可获得多个参数的高内涵信息(2) 着眼于细胞整体的某些功能和信号转导途径中的其他位点 在对每一个分子通路并不完全了解的情况下, 细胞水平筛选是唯一可用的方法(3) 鉴定分子水平发现的化合物(4) 观察被筛选样品对细胞的作用, 不反映药物作用的具体途径和靶标, 只反映药物对细胞生长过程的综合作用(5)细胞模型的材料来源较容易 用于药物筛选的细胞：正常细胞、转基因和病理细胞等 多数生物性物质均可通过转基因的方法由细胞表达(6)分子生物学

4、和细胞生物学手段 特别是基因芯片技术 发现疾病有关基因,克隆 建立稳定细胞株 大规模药物筛选目前：(1) 微量化，超高通量化 1 536孔板，荧光方法可达3 4569 600孔 微量化技术是实行超高通量筛选( uhts)的基础 载体微孔板硬度、自动化加样精度 检测系统 数据分析系统(2) 均质检测：一步加入(3) 多指标、多靶点、多通道检测是现今细胞水平高通量筛选技术的核心和关键 光显微荧光成像技术是进行多指标检测的基础 多指标、多靶点检测有助于发现药物作用的新途径，深入认识药物作用的机制 为筛选具有互补的多靶点作用机制的单一治疗药物提供了手段和工具(4) 实时动态检测和可视化 对活细胞进行荧

5、光标记，荧光成像技术， 分子水平的实时动态检测和可视化研究 自动图像分析和数据量化分析第节 常用技术1 细胞水平重组技术 重组技术是细胞水平高通量常用技术手段 经典方法是通过重组基因在宿主细胞基因组的随机整合而产生稳定细胞株 不足：重组基因的定位不可预测，表达水平受重组位点的影响，基因拷贝数不确定，阳性克隆的产生率低，筛选时间长等 现用游离体载体( episomal vector)：转染效率高，阳性克隆筛选速度快2 报告基因技术 将靶基因连接到细胞上，通过激活或抑制靶基因导致报告基因的表达，通过比色、荧光或发光的方法检测 简便，如荧光素酶( luciferase)和-半乳糖苷酶报告基因系统，不

6、需裂解分离可直接均质检测 用于活体细胞的报告基因多是绿色荧光蛋白(gfp)，适于活体细胞检测，被称为生物传感蛋白优点： gfp自发荧光，且荧光稳定；不需其他的底物和辅因子；gfp与其他蛋白嵌合后不影响其自身荧光特性 gfp及其变体：用于实时动态研究体内或细胞水平的蛋白定位和转位，蛋白的降解，蛋白-蛋白的相互作用，细胞骨架动力学，细胞周期，检测目的基因表达变化 -内酰胺酶，水解荧光能量共振转移( fret)底物ccf4 /am行定量检测，或作为核因子调节的指示蛋白，用于受体功能筛选3 荧光检测分析技术 定量读取荧光密度；单次实验中同时获得其他荧光特性，如荧光寿命、极化、淬灭，提高筛选的有效性，可

7、快速、多参数地评价样品和靶之间的相互作用(1)极化荧光( fluorescence polarization, fp) 分析生物体系中分子间相互作用，根据荧光标记的小分子在游离和与大分子结合靶标2种状态时的极化荧光值不同而区分优点： 不用分离荧光标记物，反应在均相溶液中进行 检测时间不会影响结果 高灵敏性、高稳定性、可重复性 操作简便，假阴性或假阳性率低 用于细胞水平的膜受体如gpcr、核受体调节剂的hts筛选，如促肾上腺皮质激素2亚型受体(crf2r)的功能分析中camp的直接检测(2)荧光共振能量转移( fluorescence resonance energy transfer, fre

8、t) 指非放射性能量在适当能量给予体和接受体之间转移 当供体激发态能量满足光学和空间上的要求时，其能量能有效转移给受体，导致受体发射荧光 供体和受体空间距离的变化能显著影响能量的有效转移效率 荧光底物设计和人工合成： 细胞筛选用的-内酰胺酶(-lactamase)报告基因检测系统采用的荧光底物就是基于fret的原理，合成底物ccf4，为分子头孢菌素联上分子7-羟基香豆素和分子荧光素( fluorescein)。当体系无配基激活时，底物完整，激发香豆素发射530 nm绿光；如加入所研究受体的特异性配基，报告基因系统激活，表达-lactamase，裂解底物，破坏了fret，激发香豆素发射460 n

9、m 蓝光。用于gpcr受体-催产素受体( ho-tr)的筛选 采用fret原理设计淬灭型底物进行激酶的筛选(3)时间分辨荧光能量传递分析法( time resolved-fluorescence resonance energy transfer, tref or tr-fret) 双标记方法 原理是在长寿荧光镧系复合物和共振能量受体之间的长范围能量传递 液态条件下进行，不需固定相支持和分离步骤，不需对试剂进行特殊处理 优点：减少背景，使长期存在的供体和受体信号随时间显示很高的敏感性 用于蛋白与蛋白结合分析、受体配体结合分析等 用长寿荧光金属铕作供体成分，用另一个荧光分子xl665 (一个改型

10、别藻蓝蛋白的片断)作为受体进行了-分泌酶抑制剂的细胞水平筛选4 荧光影像( fluorescence imaging)技术(1)高内涵筛选( high content screening, hcs) 指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测被筛样品对活细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节的影响，单一实验中获取大量相关信息，确定样品生物活性和潜在毒性 应用高分辨率的荧光数码影像系统，在细胞水平上检测多个指标的多元化、功能性筛选技术 获得被筛样品对固定化或动态细胞产生的多维立体和实时快速的生物效应信息 检测范围：靶点激活、细胞分裂及凋亡、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、

11、受体内化、细胞毒性、细胞周期和信号转导；监测细胞器、活性物质释放(一氧化氮、活性氧、胞内钙离子)等 用于药靶的证实和药物初筛, 尤宜于诸如gpcr功能性研究，药物多靶点研究，癌症的综合研究，多指标形态学观察，激酶级联反应，信号转导途径的研究等 如用hcs对细胞水平的17种蛋白同时进行了检测cellcardtm系统：新的多通道(multip lexed)hcs筛选技术，由vitra bioscience公司开发 可在96孔板单孔中实现对多个细胞系或多靶点的同时检测，是一种基于多通道的全自动影像系统 可在单一检测中应用多参数检测，可定量单一细胞类型中多个细胞内事件或对多个细胞类型实行同一检测，在获

12、得样品活性的同时得到样品对不同细胞株上设计的不同靶点的选择性信息 关键点为cellcard carrier微载体技术，允许多种细胞株在96孔板的同一孔中进行生长并检测 优点：增大检测容量，提高检测数据质量，节省时间，降低成本 对细胞培养的要求很高，培养环境必须适合所有被检细胞株生长(2)共聚焦显微成像技术( fluorescence confocal microscope imaging) 采用共聚焦激光微扫描，并结合数字化影像和光稳荧光染料，特别适合于微量、快速的细胞水平生物分子的多荧光标记检测，活细胞和亚细胞影像分析和多维成像 共聚焦显微光学系统如evoscreen系统,均质检测, 检测体

13、积小而不损失信号质量 利用共聚焦的荧光技术有荧光共振能量转移( fret) ,荧光寿命显微成像( fluorescence lifetime imaging microscopy , flim)，光漂白后荧光复现frap ( fluorescent recovery after photobleaching) ,光漂白荧光损失flip ( fluorescence loss in photobleaching), fcs ( fluorescence correlation spectroscopy)等(3)荧光相关光谱( fluorescence correlation spectrosco

14、py，fcs) 超高通量筛选检测技术，通过共焦镜提供高聚激发光，消除背景可实现单分子检测 共聚焦光学系统可实现输出信号的微量化分析 可评价单个分子的荧光信号，提供荧光粒子的扩散特征信息 可进行多参数、多维荧光检测 监测分子结合时的相互作用如进行受体结合分析和其他分子事件 采用fcs用于活细胞筛选gpcr调节剂，在3 456孔板，最小测活体积小于2l(4) flipr ( fluorescent imaging plate reader) flipr96和flipr384是由moleculardevices公司开发的针对活细胞荧光检测钙流的技术 检测荧光信号快速、准确，可达到亚秒级水平，允许短暂

15、信号的检测，尤其适用于钙指示剂检测胞内钙 均质、动态、细胞水平的荧光检测方法 用于胞内钙离子、钠离子、膜电位和ph的检测 但因由水冷的氩激光提供激发能量，用冷的ccd成像系统检测，受到光源限制，染料多为fluo-3/am和calcium green(5) fmattm ( fluometric microvolume assay technology) 由pe bio system开发 基于荧光发光团cy5，以红色的633nm氦/氖激光为光源的多孔板扫描技术 可有效扣除背景，灵敏度较高、均质的活细胞检测 用于细胞因子调控表达、gpcr、核受体、蛋白-蛋白相互作用、蛋白-核酸相互作用的功能性测定

16、 如用fmat技术改良的elisa 一步法的flisa技术transflour 技术 transflour 技术，适用于各种gpcr (gi, gs, gq, g12/13 )受体功能研究，原理为不同的gpcr受体与配体相互作用时激活特定的g蛋白g亚单元，导致相关的下游信号的级联激活 胞浆衔接子( adaptor)蛋白arrestin，在几乎所有的gpcr受体脱敏过程中发挥作，从胞浆转位至胞膜与受体结合形成复合体，随后gpcr受体和其特定g蛋白解偶联导致受体脱敏；arrestins蛋白还介导受体的胞浆内化并与之结合，内化受体或形成颗粒状蛋白散布于胞浆中,重新循环发挥功能或在溶酶体中降解 利用a

17、rrestin蛋白的转位、结合和内化，将报告基因和arrestin蛋白表达成融合蛋白，作为gpcr受体功能研究的指示蛋白，用于细胞水平的高通量筛选 优点： 动态直观、可量化、易操作 避免了以往gpcr受体研究中因不同的受体亚型激活特定的信号通路而需要设计不同的筛选方法 特别适用于无配基的孤儿核受体的功能研究 利用报告基因gfp和arrestins蛋白表达成融合蛋白的稳转u2os细胞系进行加压素受体v2r的高内涵筛选研究 利用报告基因-半乳糖苷酶的两个互补片段分别结合gpcr受体和arrestins蛋白用于细胞水平的2 肾上腺素受体和cxcr2 趋化因子受体筛选重组受体药物筛选系统重组受体 应用

18、基因工程技术改进药物筛选方法和建立新的药物筛选模型 受体技术是近年发展起来的一种体外实验模型，世界上几乎所有的大的制药公司和实验室都已将受体技术作为一种常规的药物筛选手段 重组受体又称克隆受体或高级受体，是把受体或受体亚型的基因从人体组织中克隆出来，再在微生物或哺乳动物细胞内表达，是对受体技术的完善。优点：高敏感性、高专一性、快速经济且受体为人的而不是动物的，结果与人体实验结果直接相关，可大量制备，被越来越多地应用于药物的筛选 synaptic制药公司研究了能调节神经系统功能的肾上腺素受体亚型、含5-ht的受体亚型及人类转移因子受体亚型，并已克隆了许多受体，用于筛选治疗精神失常及神经功能失调疾

19、病。克隆人体多巴胺d4受体亚型用于筛选抗精神失常药，克隆人体5-ht4b亚型用于筛选抗动脉粥样硬化药物；克隆的重组肾上腺素受体a2ci亚型、胆囊收缩素-b/促胃酸激素受体、血管紧张素的受体也已用于药物筛选 功能筛选和异源表达的问题：功能检测最简单方法是在哺乳动物细胞系表达受体基因，这一细胞系需合适的g蛋白，而发现g蛋白要克隆g蛋白基因或转染一系列细胞，还需合适的功能筛选指标高通量筛选技术 high throughput screening,hts，新药发现新技术 依赖于含有大量化合物的样品库, 利用计算机控制的自动化操作系统和微量灵敏的生物反应及检测系统, 采用体外的实验方法(分子和细胞水平药

20、物筛选模型) 评价化合物的生物活性 优势：明确化合物生物活性的分子机制，速度快，规模大(每日可筛选数万至数十万样品)，消耗样品量小(微克级)，一药多筛 高新技术为高通量药物筛选提供了有效的手段和方法 蛋白质组学为高通量筛选提供了大量的新的药物靶点 分子和细胞生物学阐明了药物的作用机制 生物芯片技术为高通量筛选提供了更多的信息 组合化学合成与组合生物合成技术为高通量药物筛选提供了大量化合物, 扩大了药物发现的范围第节 细胞模型举例1 caco 2单层细胞模型 caco 2细胞是一种人类结肠腺癌细胞,由fogh等在 1977 年分离特征: 在培养过程中，一旦细胞达到单层厚度便自发地进行分化，并在

21、20 d 内完成这种分化 分化了的 caco 2单层细胞在其肠腔侧形成一个界定明确的刷状边缘且具有紧密的细胞连接,形态学上类似小肠吸收细胞且表达了典型的小肠微绒毛水解酶和营养物质转运体 caco 2单层细胞具有完整性：显微镜观察、碱性磷酸酶活性和跨膜电阻 (trans epithelial electric resistance , teer)、标志物被动扩散跨膜通量测定等 caco 2细胞模型与原位灌流等较为复杂的模型划分的药物转运程度是一致的 caco 2细胞模型是用来预测药物体内被动转运吸收的良好模型，被动扩散药物在 caco 2细胞上的转运吸收与体内吸收差异较小 对于吸收慢且不完全的药

22、物,体内吸收速率约为caco 2体外模型吸收速率的3080 倍优点： 同时测定药物摄取和跨膜转运 caco 2细胞内具有药物代谢酶，可在代谢状况下测定药物的跨膜转运 细胞来源于人结肠腺癌细胞，同源性好，生命力强 可区分肠腔内不同吸收途径的差别 操作简单，药物消耗量少， 开发前期的药物筛选缺点：缺少肠壁的粘液层；缺少细胞异质性；缺少部分代谢酶；caco 2细胞层是平面结构，而小肠褶皱及微绒毛结构使得体内吸收面积剧增别用途： 药物的吸收转运机制研究 药物制剂处方组成透膜性和粘膜毒性的评价 药物吸收过程中相互作用的预测 药物的化学结构和体内转运间关系的研究 揭示物肠吸收限速因素 药物代谢稳定性的估计

23、 肠腔 ph值对药物吸收影响的评价2 肝脏体外毒理学模型(1)原代肝细胞模型：最常用，含有分离后的肝实质细胞，用来研究药物或毒素对细胞的作用，是一个比较可靠的研究体外毒理学的模型 优点：材料来源广，任何动物、人类，整个肝脏或活组织；能冰冻保存，减少了实验动物的使用量；可检测多种化合物多个浓度的细胞毒性,为体外高通量筛选模型的建立奠定了基础 缺点：不能测量胆汁的成分，缺少器官特异性的细胞间相互作用，没有完整的解剖学上的结构(2) 离体肝脏模型：灌流后分离的离体肝脏更接近在体情况 优点：保留了肝脏完整的三维结构 ,细胞间可以相互作用,也可以实时收集胆汁，如用血液作为灌流液还可测量血液动力学参数，很

24、多药物或者化合物引起的肝脏毒性研究中都采用了这一模型 缺点：培养时间不长(2-3h)；功能不可能完整保留；费用昂贵 (3)肝脏切片模型： 优点：有细胞间的相互作用,不过于复杂,功能和体内肝脏比较接近 不足：无法收集胆汁,不同切片之间细胞的一致性也不高 根据不同化合物的代谢特点选择最佳厚度的切片(150300m, 200250m) 新的组织切片技术可解决存在的氧分布和营养分布不均匀等(4) 肝细胞系模型: 从人类肝脏制备细胞系可能是一种最好的选择 从肝肿瘤或者转染了病毒或其他细胞 dna 的肝细胞中可以获取肝细胞系 具有相对的无限生长能力和较高的存活率 没有可以表达完整肝脏代谢酶系的肝细胞系；维

25、持肝细胞的正常功能却非常困难(5) 亚细胞模型 即组织匀浆、微粒体、纯化的细胞器如线粒体、细胞核等，上述亚细胞成分都可以应用于药物或化合物引起的肝脏毒性的研究 微粒体内的代谢和二相代谢酶反应不相关，这些亚细胞体外模型也只是在短期内有效(6) 基因工程细胞模型 在酵母、细菌、昆虫细胞和非肝脏细胞中转染编码人类肝脏 cyps的 cdna,使代谢酶具有正常稳定的表达 利用这种模型研究药物代谢过程中 cyps 的作用以及药物对 cyps 的抑制或诱导作用及药物与其结合情况 已成功得到转染了二相酶系 cdna的基因工程细胞，存活率较高 ,可同时表达一个或者多个人类 cyps 仅适用于某些特殊研究，代谢酶表达水平和体内相比也有较大差异 3 药物诱导的胰岛素抵抗模型 以适宜的高浓度胰岛素诱发的 hepg2胰岛素抵抗细胞模型在48h内较稳定 以地塞米松作用 3t32l1脂肪细胞后, 96 h达胰岛素抵抗的最高状态，胰岛素抵抗细胞模型在撤掉地塞米松后24 h内稳定4 表达乙肝病毒 yvdd变异株肝癌细胞模型 hbv基因组为双链闭环状态 , 不同编码基因相互重叠 , 启动