生物化学（上）：7 蛋白质的分离、纯化和表征

1、第一单元第一单元 蛋白质化学蛋白质化学第三章第三章 氨基酸氨基酸第四章第四章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构第五章第五章 蛋白质的三维结构蛋白质的三维结构第六章第六章 蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系第七章第七章 蛋白质的分离、纯化和表征蛋白质的分离、纯化和表征第第7 7章章 蛋白质的分离蛋白质的分离、纯化和表征纯化和表征一、蛋白质的酸碱性质一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯

2、化方法 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 七、蛋白质性质小结七、蛋白质性质小结第第7 7章章 蛋白质的分离蛋白质的分离、纯化和表征纯化和表征一一、蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保存着游蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保存着游离的离的-氨基和氨基和-羧基及侧链上的各种功能团，所以其物羧基及侧链上的各种功能团，所以其物理化学性质有些与氨基酸相同。理化学性质有些与氨基酸相同。 蛋白质也是一类两性电解质蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。，能和酸或碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，在蛋白质

3、分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，这些基团能解离为带电基团这些基团能解离为带电基团, ,从而使蛋白质带电荷。从而使蛋白质带电荷。l在酸性情况下在酸性情况下蛋白质中的各碱性基团接受质子，使蛋白质带正电荷；蛋白质中的各碱性基团接受质子，使蛋白质带正电荷；l 在碱性情况下在碱性情况下蛋白质中的各酸性基团解离出质子，使蛋白质带负电荷。蛋白质中的各酸性基团解离出质子，使蛋白质带负电荷。l 在某一在某一pHpH值时值时蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的此时溶液的pHpH值就是蛋白质的等电点。值就是蛋白质的等电点。 l 每种

4、蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。质的指标之一。l 等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关，如等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关，如果酸性氨基酸与碱性氨基酸含量差不多，则蛋白质的等果酸性氨基酸与碱性氨基酸含量差不多，则蛋白质的等电点接近中性。如果蛋白质中含的酸性氨基酸多，等电电点接近中性。如果蛋白质中含的酸性氨基酸多，等电点点pHpH就低，反之如碱性氨基酸多，则等电点就低，反之如碱性氨基酸多，则等电点pHpH就高。就高。 蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系关系: :

5、 蛋白质蛋白质酸性氨基酸酸性氨基酸每摩尔残基数每摩尔残基数碱性氨基酸碱性氨基酸每摩尔残基数每摩尔残基数碱性碱性/ /酸性酸性等电点等电点37胃蛋白酶胃蛋白酶60.21.0血清蛋白血清蛋白血红蛋白血红蛋白核糖核酸酶核糖核酸酶82991.24.753881.76.77202.99.5二二、蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状 ( (一一) ) 根据化学组成测定最低相对分子质量根据化学组成测定最低相对分子质量 ( (二二) ) 渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量（三（三) ) 蛋白质的扩散和扩散系数蛋白质的扩散和扩散系数 ( (四四) ) 沉降分析法测定相对分子质量沉降分析法测

6、定相对分子质量 ( (五五) ) 凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤法测定相对分子质量 ( (六六) SDS) SDS酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 ( (七七) ) 蛋白质分子的形状蛋白质分子的形状 ( (一一) ) 根据化学组成根据化学组成 测定最低相对分子质量测定最低相对分子质量 用化学分析方法测定出蛋白质某一微量元素（如铁）用化学分析方法测定出蛋白质某一微量元素（如铁）的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子，则可计算的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子，则可计算出蛋白质的相对分子质量出蛋白质的相对分子质量. .l例例, ,肌红蛋白含铁量为肌红蛋白含铁

7、量为0.335%,0.335%,其最低相对分子质量可按下其最低相对分子质量可按下式计算式计算: : 铁的原子量铁的原子量 最低相对分子质量最低相对分子质量= 100 铁的百分含量铁的百分含量 = (55.8/0.335) 100 =16700 注注: :真实的真实的Mr(Mr(相对分子质量相对分子质量) )为最低相对分子质量的为最低相对分子质量的n n倍倍(n=1,2,3(n=1,2,3 ) )( (二二) )渗透压法测定相对分子质量渗透压法测定相对分子质量l渗透压渗透压: :为了制止溶液与纯溶剂之间的净移动所需施加为了制止溶液与纯溶剂之间的净移动所需施加于溶液的压力，它是单位体积内溶质质点数

8、的函数，与于溶液的压力，它是单位体积内溶质质点数的函数，与溶质的性质和形状无关。溶质的性质和形状无关。l渗透压法测定蛋白质渗透压法测定蛋白质MrMr的优点的优点: : 所用实验装置简单所用实验装置简单 准确度不亚于其他方法准确度不亚于其他方法l缺点缺点: : 蛋白质的渗透压受蛋白质的渗透压受pHpH影响影响, ,只有蛋白质分子处于等只有蛋白质分子处于等电点时电点时, ,测定的渗透压才不受缓冲液中无机离子的影响测定的渗透压才不受缓冲液中无机离子的影响. .三三、蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 与蛋白质的沉淀与蛋白质的沉淀l ( (一一) )蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质l ( (二二) )蛋

9、白质的沉淀蛋白质的沉淀 ( (一一) )蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 蛋白质是高分子化合物，由于相对分子质量大，它蛋白质是高分子化合物，由于相对分子质量大，它在水溶液中所形成的颗粒具有胶体溶液的特征，如在水溶液中所形成的颗粒具有胶体溶液的特征，如布朗运布朗运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜以及具有吸动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜以及具有吸附能力附能力等。等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用玻璃利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用玻璃纸、羊皮纸、火棉胶等来分离纯化蛋白质，这个方法称为纸、羊皮纸、火棉胶等来分离纯化蛋白质，这个方法称为透析法透析法。 ( (二二) )蛋白质

10、的沉淀反应蛋白质的沉淀反应 如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。定而出现沉淀现象。 蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀。蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀。 1 1、加高浓度盐类、加高浓度盐类 2 2、加有机溶剂、加有机溶剂 3 3、加重金属盐、加重金属盐 4 4、加某些酸类或生物碱试剂、加某些酸类或生物碱试剂 5 5、加热变性沉淀、加热变性沉淀 加高浓度盐类 硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等

11、可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象，称为这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象，称为盐析。盐析。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法。 （50%50%硫酸铵：球蛋白硫酸铵：球蛋白； 100%100%硫酸铵：清蛋白硫酸铵：清蛋白）返回加有机溶剂 酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反

12、应。质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应。返回加重金属盐 氯化高汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等，因氯化高汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等，因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。返回加某些酸类或生物碱试剂 加苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化加苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。 生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣酸、苦味酸、碘化钾等如鞣酸、苦味酸、碘化钾等。

13、返回加热变性沉淀 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量的盐类几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量的盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全最迅速。最完全最迅速。 加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化层，性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点而破坏了带电状态。同时由于蛋白质处于等电点而破坏了带电状态。返回四、蛋白质分离纯化的一般原则 (1)(1)前处理（前处理（pretreatmen

14、tpretreatment） (2)(2)粗分级分离（粗分级分离（rough fractionationrough fractionation） (3)(3)细分级分离（细分级分离（fine fractionation fine fractionation ）五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法（三）根据电荷（三）根据电荷不同的纯化方法不同的纯化方法（四）利用选择性吸附的纯化方法（四）利用选择性吸附的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法1 1、透析和超过滤、透析和超过滤2 2、密

15、度梯度离心、密度梯度离心3 3、凝胶过滤、凝胶过滤（二）利用溶解度差别的纯化方法1 1、等电点沉淀和、等电点沉淀和pHpH过滤过滤2 2、蛋白质的盐溶和盐析、蛋白质的盐溶和盐析3 3、有机溶剂分级分离法、有机溶剂分级分离法4 4、温度对蛋白质溶解度的影响、温度对蛋白质溶解度的影响（三）根据电荷不同的纯化方法1 1、电泳、电泳2 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳3 3、毛细管电泳、毛细管电泳4 4、等电聚焦、等电聚焦5 5、层析聚焦、层析聚焦6 6、离子交换层析、离子交换层析（四）利用选择性吸附的纯化方法1 1、羟磷灰石层析、羟磷灰石层析2 2、疏水作用层析、疏水作用层析测定含量方法：

16、测定含量方法： 1. 1. 凯氏定氮法凯氏定氮法 2. 2. 双缩脲法双缩脲法 3. Folin-3. Folin-酚法（酚法（LowryLowry法）法） 4. 4. 紫外吸收法紫外吸收法测定纯度方法：测定纯度方法： 电泳法电泳法六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定七、蛋白质性质小结1 1、蛋白质的分子量、蛋白质的分子量2 2、蛋白质的两性电离及等电点、蛋白质的两性电离及等电点3 3、蛋白质的胶体性质、蛋白质的胶体性质4 4、蛋白质的沉淀反应、蛋白质的沉淀反应5 5、蛋白质的变性、蛋白质的变性6 6、蛋白质的颜色反应、蛋白质的颜色反应( (补充）补充）7 7、蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收1 1

17、、双缩脲反应、双缩脲反应2 2、米伦氏反应、米伦氏反应3. 3. 乙醛酸反应乙醛酸反应4 4、坂口反应、坂口反应5 5、酚试剂（福林试剂）反应、酚试剂（福林试剂）反应蛋白质的颜色反应双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到。将尿素加热到180180，则两分子尿素缩合成一分，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨。子双缩脲，并放出一分子氨。 双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络和物，此反应称双缩脲反应红紫色络和物，此反应称双缩脲反应。结构式和反应式返回双缩脲的结构式和反应式双缩脲的结构式

18、和反应式返回CONH2NH2CONH2NH2CONHNH2CONH2+ NH3加热加热米伦试剂反应 米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后合液，蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应。 （硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸 ) )Tyr + 米伦试剂米伦试剂 红色红色返回乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入在蛋白质溶液中加入