桑叶的生物活性成分药理成份产业化工艺路线20140201doc

1、6桑蚕资源的生物活性成分药理成份产业化工艺路线6.1桑资源的生物活性成分药理成份产业化工艺路线6.1.1桑枝总黄酮提取工艺优化黄酮类化合物的生物活性。黄酮类化合物是药用植物的主要活性成分之一，具有广泛的生物活性。具有抗氧化、降低脂质过氧化反应、预防心血管疾病以及抗衰老等作用。随着研究方法和技术的不断提高，发现黄酮类化合物还具有清除自由基、抗菌消炎、抗过敏、抗病毒、抗癌和提高免疫力等作用。我国桑枝资源丰富，不管直接以桑枝作为药材而进行初级开发，还是以其为原料，用以中药制剂或者保健品的次级开发，或者用以天然药物产品的深度开发，桑枝均具有重大的综合利用价值。利用桑枝黄酮类化合物开发新药或者保健品，更

2、具有广阔的应用前景。(1)桑枝总黄酮提取工艺研究。本实验探讨了提取时间、乙醇浓度、料液质量浓度及温度对桑枝总黄酮提取效果的影响，在此基础上利用正交试验，采用极差和方差分析法确定了黄酮的最佳提取工艺条件：温度为80、料液质量浓度33g/L、乙醇浓度70、浸提时间120min。在该条件下，其提取率可达101。(2)桑枝总黄酮的分离纯化研究。本试验探讨了聚酰胺分离纯化桑枝总黄酮的静态吸附和动态吸附两方面的技术参数，静态吸附上样量1：274gg(净黄酮量：树脂量)、动态吸附上样量l：61gg、上样浓度2149mgmL、吸附流速和解析流速均为lmLmin、吸附时间lh、70乙醇作为洗脱剂。在此条件下黄酮

3、的洗脱量可达9229。(3) 桑枝中桑色素的分离纯化及检测。采用95乙醇浸提，乙酸乙酯萃取，聚酰胺树脂吸附色谱法对桑色素进行分离纯化。结果表明，该方法可提取分离到高纯度的桑色素。薄层层析色谱法显示，以氯仿：甲醇：醋酸(15：5：2)作为展开剂，用1硝酸铝醇溶液显色，可于波长为365nm的紫外灯下观察到桑色素显绿色荧光。用高效液相色谱作定性检测，结果表明，用symmetryC-18(46x150mm)色谱柱，以甲醇：水：磷酸(50：498：O2)为流动相，流速为lmLmin，柱温30，在波长370nm处桑色素具有良好的色谱吸收峰。（4）体外抗氧化活性研究。本试验以VE做对照，从清除自由基能力和还

4、原能力两方面评价了芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝总黄酮抗氧化能力。结果表明，槲皮素对DPPH·的清除能力最强，是VE的14倍，桑色素和桑枝总黄酮的清除能力相近且弱于槲皮素，芦丁清除能力最弱；在002-008mgmL范围内，槲皮素的还原能力最强，桑色素和桑枝总黄酮与VE的还原能力相近，且弱于槲皮素，芦丁的还原能力最弱。（5）不同品种桑枝总黄酮含量比较。本试验对本校桑树种质资源圃中保存的几种生产上广泛种植的栽培品种的桑枝总黄酮含量进行了测定比较，结果显示， 不同品种之间桑枝总黄酮含量差异较大。一、研究内容(1)研究xx桑树种质资源圃中嘉陵20号的桑枝为材料，选择提取时间、乙醇浓度、料液质量浓

5、度及温度对桑枝总黄酮提取效果进行了单因素实验，在此基础上利用正交实验，采用极差和方差分析法确定了桑枝黄酮的最佳提取工艺条件。(2)以聚酰胺为材料，通过静态和动态吸附实验，研究了聚酰胺分离纯化桑枝总黄酮的最佳技术参数。(3)采用95乙醇浸提，有机溶剂萃取，聚酰胺树脂吸附色谱法对桑色素进行分离纯化，用薄层层析色谱与高效液相色谱相结合的方式进行定性分析，确定了分离纯化及鉴定桑色素的技术路线和方法。(4)以VE做对照，从清除自由基能力和还原能力两方面评价了芦丁、槲皮素、桑色素和桑枝总黄酮的抗氧化能力。(5)利用NaN02-Al(N03)3-NaOH分光光度法测定了广泛种植的几种桑树栽培品种桑枝总黄酮含

6、量并比较了其差异性。二、桑枝总黄酮提取工艺优化利用实验室的常用的仪器设备条件对人工三倍体嘉陵20桑枝黄酮进行粗体工艺优化，技术路线如下：桑枝总黄酮提取工艺优化桑枝单因素条件下提取不同时间不同乙醇浓度不同温度不同料液比提取液 提取液 提取液 提取液计算提取率设置正交实验计算提取率正交实验最优组合重现性实验 精密度实验 加样回收实验 稳定性实验结果与分析桑枝95%乙醇浸提滤渣滤液减压浓缩浓缩液萃取氯仿部分水部分乙酸乙酯部分薄层检测弃去弃去浓缩液上样树脂柱床装柱精制树脂新树脂预处理70%乙醇洗脱洗脱液薄层检测无效成分洗脱液有效成分洗脱液减压浓缩弃去浓缩液HPLC检测上样桑枝提取液浓缩浓缩液70%乙醇

7、已知黄酮浓度样品液聚酰胺静态吸附实验动态吸附实验吸附时间的确定上样量的确定洗脱剂的选择吸附流速的选择吸附浓度的选择泄露曲线绘制乙醇浓度的选择桑枝提取液浓缩浓缩液70%乙醇桑枝黄酮样品液芦丁槲皮素桑色素酶标仪清除DPPH能力的测定清除ABTS+能力的测定还原能力测定不同品种桑枝提取液计算黄酮含量比较与分析6.1.2 桑叶黄酮提取纯化工艺及对尿酸代谢的影响 一 、桑叶黄酮是其中主要的生物活性成分，药理学研究表明：桑叶黄酮具有调节-葡萄糖苷酶、降血糖、抗肿瘤等药理活性。而且黄酮类化合物对高尿酸血症有效。为深度利用资源，本文对黄酮的提取分离技术进行了工艺研究，并后研究了桑叶黄酮对高尿酸血症模型的降尿酸

8、的作用。研究通过高压液相色谱法对桑叶黄酮类化合物进行成分分析，结果表明，其主要成分为芦丁，杨梅素，槲皮素，山奈素等。采用正交试验法对提取桑叶黄酮的工艺进行优化，结果表明，最佳的浸提条件为：在80下70乙醇回流提取2次，每次15h，料液比为1：2 0(wv)。为得到纯度较高的桑叶总黄酮，采用大孔树脂吸附法进行黄酮纯化，以桑叶总黄酮的得率和纯度为指标，比较了五种大孔树脂的吸附性能，结果显示HPD826大孔树脂对桑叶总黄酮吸附性能最好；进一步采用正交试验法对HPD826大孔树脂纯化桑叶黄酮的工艺进行优化，所获最佳条件组合为：取浓度为4mgml左右的桑叶提取液上样，上样体积为15树脂体积数(BV)，上

9、样速率控制在2 BVh左右，之后用3 BV， 60的乙醇， 以1 BVh的速率洗脱，纯化后的桑叶黄酮得率为195，纯度5541。 所以选择体外实验探讨桑叶黄酮(MLF)对大鼠肝脏匀浆液中黄嘌呤氧化酶(XO)活性的影响，结果显示：MLF剂量依赖性地抑制大鼠肝脏匀浆液XO活性，在10000 mgL抑制率与别嘌醇(AP)无显著差异，提示MLF可能具有降尿酸活性。进一步研究其对正常小鼠血清UA含量和肝脏匀浆液XO活性的影响，以50、100、200 mg/kg*d_1剂量MLF灌胃正常小鼠14d，测定相关指标。结果显示：MLF三种剂量与对照组相比对正常小鼠体内血清UA含量和肝脏匀浆XO活性均无显著性影响

10、，对小鼠体重和脏器系数无显著影响。采用氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症小鼠模型评价了MLF的降尿酸活性，以50、100、200 mg/kg*d_1剂量MLF灌胃正常小鼠14d，检测相关指标，结果显示：200mgkg bW MLF可极显著(P<001)降低模型小鼠血清尿酸含量，下降1667；并能显著(P<O05)抑制肝脏XO活性，抑制率达605。而50 mgkg bw MLF对肝脏XO活性的无明显影响(P>005)，但能极显著降低模型小鼠血清尿酸含量(P<001)。长期高尿酸血症导致肾损害和痛风， 肾损害亦可致尿酸排泄障碍。为进一步探讨桑叶黄酮对病理状态下的尿酸代谢及相关肾损伤的

11、影响，本实验继续研究了MLF对腺嘌呤联合高糖饲料诱导的大鼠高尿酸血症、肾损伤的防治作用。在腺嘌呤联合高糖饲料诱导的高尿酸病理状态下，分别给予200、100、50 mg/kg*d_1的MLF，以别嘌醇为阳性对照药物。结果显示：MLF中、高剂量组在给药1 w后，血清UA水平分别降低1783和2117；2w后降低2109和2715。3w后MLF中剂量组血清尿酸接近于正常大鼠水平，XO活力比HC组显著降低2501。200mg/kg*d_1 MLF可使血清TG，FFA水平降低4195，4205，同时MLF可减小腺嘌呤造模引发的肝脏、心脏系数的异常。降低高尿酸病理状态下肌酐和尿素氮含量，并通过电镜观察，M

12、LF对腺嘌呤所引起肾脏损伤有一定的保护作用。综合以上结果：推断MLF具有明显的降尿酸活性，并对高尿酸病理状态下的肾脏损伤有一定的保护作用；MLF可能通过抑制XO和调节脂质紊乱来调节血清UA水平。2、 桑叶黄酮的提取纯化工艺研究 成分分析研究表明桑叶富含黄酮，为进一步利用桑叶资源，需研究其黄酮类化合物的提取、纯化方法。大孔树脂物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长，现已广泛应用于天然产物的分离和富集。大孔树脂的特性会影响黄酮分离的效果。因此， 本实验进一步分析桑叶总黄酮含量，优化桑叶总黄酮提取工艺，就大孔树脂纯化桑叶黄酮的工艺条件作

13、研究。(一)、桑叶黄酮类物质提取方法研究1、材料、试剂和仪器11材料：桑叶(来源同前)，芦丁标准品(上海试剂二厂)，其它试剂均为国产分析纯。2、实验方法21材料预处理：用粉碎机粉碎，石油醚脱脂，常温挥干，备用。22黄酮含量测定标准曲线的制作准确称取20mg芦丁标准品置50mL容量瓶加60乙醇至刻度，摇匀。量取25mL置50mL容量瓶，加水稀释至刻度，摇匀，即得02mgmL的芦丁标准液，精密量取1OmL，2OmL，3OmL，4OmL，5OmL，60mL此标准液于25mL容量瓶中以30乙醇补足为6mL，摇匀，加5亚硝酸钠1mL，放置6min后，加10硝酸铝lmL，放置6min，再加4氢氧化钠10m

14、L，30乙醇定容，摇匀，放置15min。以不加样品作为空白，于505删波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到以芦丁计的总黄酮含量(x)与吸光度(y)之间的回归方程：y：18222x一00016，r=0997723黄酮类化合物浸出率的计算浸出率()=桑叶中提取的黄酮含量桑叶的质量×10024桑叶总黄酮提取工艺单因素试验分别研究乙醇浓度、提取温度、料液比、提取时间等因素对提取桑叶总黄酮含量的影响。精确称取桑叶粉末2Og，加50ml酒精，在相同的条件下提取，过滤提取液，最后定容至50mL，并以浸提液中黄酮的吸光度为考察指标，在单因素水平研究桑叶黄酮的提取方法。2

15、5桑叶总黄酮提取工艺优化在单因素试验的基础上，采用正交试验方法，优化桑叶总黄酮提取工艺。选择乙醇浓度、料液比、时间和温度进行四因素三水平的正交试验，试验因素水平。三、试验结论及桑叶黄酮的提取纯化工艺 通过单因素试验及正交试验，优化了桑叶总黄酮提取工艺。本试验设计的提取温度、提取时间、提取次数、料液比四因素对总黄酮的提取效率都有显著影响。各因素对提取效率的影响程度各异，影响桑叶总黄酮提取效率的各因素的主次顺序为温度>提取次数>料液比>提取时间。综合各种因素，确定桑叶总黄酮的最佳提取工艺为乙醇浓度7096、提取温度80、料液比1：2 O、提取时间15h提取2次。 运用静态吸附与解

16、吸实验对对5种吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，发现树脂的极性、比表面积和平均孔径的大小直接影响树脂吸附容量和解吸率。结果表明，考察的几个大孔树脂中，HPD826型大孔树脂表现出最好的吸附性能与良好的解吸效果。因此选用HPD826型大孔树脂对桑叶总黄酮进行纯化。通过单因素实验、正交实验以及方差分析确定了桑叶总黄酮分离富集的最佳操作条件。研究结果表明，最佳工艺条件为：上样体积为15 BV，上样速率控制在2 Bvh左右。上样结束后， 再用3 Bv， 60的乙醇， 以1 BVh的速率洗脱。 由本实验室制备流程是：桑叶->干燥>粉碎>石油醚脱脂>乙醇提取>过滤>浓液离

17、心>石油醚萃取>下层水溶液上柱纯化>水洗>乙醇洗脱>收集洗脱液>低温干干燥。通过以上流程得到精制的桑叶黄酮，其纯度为5541。 本文主要就桑叶的活性成分、桑叶黄酮的提取纯化工艺研究、桑叶黄酮对正常小鼠尿酸代谢的影响和对高尿酸模型尿酸代谢的影响四个方面进行研究，现将主要成果总结如下： l在成分分析方面，桑叶中含量较多的天然产物为多酚、黄酮和多糖，进一步采用唧LC法测定，桑叶含有较多芦丁，杨梅素，槲皮素，山奈素等黄酮类物质。 2通过桑叶黄酮的提取纯化工艺研究，综合各种因素，确定桑叶总黄酮的最佳提取纯化工艺，得到精制的桑叶黄酮。 3桑叶黄酮对正常小鼠的实验表明，M

18、LF对正常状态下的小鼠无影响。4桑叶黄酮对氧嗪酸钾致高尿酸血症小鼠的实验表明，MLF对于XO活性具有抑制作用，对高尿酸血症有一定的改善效应。桑叶黄酮有效降低腺嘌呤诱导高尿酸血症大鼠的血尿酸水平，缓解高尿酸对肾脏的损伤，其可能的作用机理为：一方面，本研究提示MLF组对肝脏XO有明显抑制作用，提示XO是MLF在体内的药物靶点之一。另一方面MLF能影响磷酸戊糖途径，使uA生成减少，模型动物血清TG，UA水平均显著降低。6.1.3 桑叶1-脱氧野尻霉素提取分离方法研究研究了从桑叶中提取分离1-脱氧野尻霉素(DNJ ) ,探讨了提取剂、提取方法、料液比、提取次数、时间等因素对提取率的影响。实验表明:提取

19、的最佳条件为以65%的乙醇为提取剂,按料液比18和14超声强化细胞破碎20 min (功率1800W) , 732 H阳离子树脂分离, 0. 25 mol /L 的氨水洗脱(洗脱速度1 2 mL /min) ,提取率为95. 8% ,得率为124. 54 mg/100 g,纯度为92. 3%以上。本方法具有工艺流程简单、快速、提取率高的优点,适合于工业生产。1实验部分1. 1试剂与仪器桑叶,购于药材市场(经检测DNJ含量为130 mg/100 g) ; 732 H阳离子交换树脂,钠型;食用乙醇(95%) ;硫酸、盐酸、氨水、正丁醇、碘化钾等均为分析纯。FZ102微型植物试样粉碎机; JY98-

20、超声波细胞粉碎机; RE-52旋转蒸发器; 752紫外可见光栅分光光度计。1. 2工艺流程图1工艺流程图Fig. 1Diagram of craft1. 3操作方法将桑叶粉碎过40目筛,称取100 g于1000 mL烧杯中,加65%乙醇800 mL浸泡30 min,放入超声波细胞破碎机中处理20 min,过滤,收集滤液,残渣加入400 mL 65%乙醇重复处理一次,过滤,弃去残渣,合并两次滤液,将滤液用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩至小体积,进行离心分离。收集上清液并通过内装阳离子交换树脂的交换柱,用蒸馏水冲洗至流出液无色为止。用0. 25 mol/L的氨水洗脱(洗脱速度12 mL /min) ,收

21、集洗脱液。将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩,用浓缩液一倍体积的正丁醇萃取3次,弃去水层合并正丁醇相,回收正丁醇,真空干燥即得成品。1. 4提取率计算提取率的定义为:a =m1m×100% (1)式中aDNJ提取率, %;m1 提取液中DNJ的含量,mg/100 g;m 样品中DNJ的含量,mg/100 g。2结果与讨论2. 1提取剂的选择称取粉碎过40目筛的样品100 g三份,放入三个1000 mL烧瓶中,分别加入蒸馏水、0. 25%的稀硫酸、65%乙醇800 mL,在相同的条件下回流提取,过滤,定容至1000 mL容量瓶中。采用分光光度法测定DNJ的含量,结果见表1。表1不同提取剂与提取率

22、的关系Table 1Rela tion between extraction ra te and var iety of solven ts提取剂 提取剂方法 提取时间/h 提取次数 温度/ 料液比/ ( g·mL - 1 ) DNJ 提取量/ mg·(100 g) - 1 提取率/%蒸馏水 回流提取 2 1 80 18 78. 26 60. 20. 25%的稀硫酸 回流提取 2 1 80 18 106. 99 82. 365%的乙醇 回流提取 2 1 80 18 103. 22 79. 2由表1可知, 0. 25%的稀硫酸提取率最高, 65%乙醇次之,蒸馏水最差。因为DN

23、J属于生物碱类化合物,易溶解于酸性介质,形成可溶性盐。从实验结果来看65%乙醇与0. 25%的稀硫酸对DNJ的提取率相差不大,而稀硫酸提取液过滤及浓缩相对困难,故本方法采用65%乙醇作为提取剂。2. 2提取方法的选择取样品100 g两份,一份加65%的乙醇800 mL于1000 mL烧杯中,放入超声波细胞破碎机中提取,另一份放入1000 mL烧瓶中,加入相同浓度和相同体积的乙醇,在80下进行回流提取,图2不同提取方法与提取率的关系Fig. 2Relation between extraction rate anddifferent extraction methods由图2可知, 20 min

24、时,超声强化细胞破碎提取法的提取率为92. 7%, 2 h时热回流法的提取率为79. 2%。超声强化细胞破碎法提取与常规热回流相比,DNJ提取率高13. 5% ,时间仅为1 /6。这是因为当桑叶在溶剂中受到超声作用后,超声产生的空化效应,使溶剂随超声产生的空化泡的崩溃,很快渗透到桑叶内部细胞中,并使细胞内的DNJ 快速渗透、溶解并转入溶剂,使细胞内外出现浓度差,促使DNJ从高浓度溶液向低浓度溶液中扩散,大大加速了提取过程。同时伴随着空化泡崩溃瞬间释放出来的能量,使桑叶中的细胞壁破裂,溶剂直接进入细胞内部,使细胞中的DNJ 在超声作用下直接转入溶剂中,通过溶剂将细胞中的DNJ在很短时间内全部提取

25、出来。与传统提取法相比,增加了物质内部化学成分的提取率。而热回流法随着时间的延长,提取率开始增高后有所下降,是部分DNJ遭到破坏所致。2. 3提取时间的选择将样品100 g, 加入65%的乙醇800 mL 于1000 mL烧杯中,放入超声波细胞破碎机中提取,测定不同时间的提取率,超声强化细胞破碎提与提取率的关系见图3。图3超声强化细胞破碎提取时间与提取率的关系Fig. 3Relation between extraction rate and ultrasonic time由图3可知,提取率随超声波提取时间的增加而增大, 20 min时,随着时间的增加,提取率趋于平缓。本实验选取20 min作

26、为提取时间。2. 4乙醇浓度的选择取样品100 g四份,分别加入50% , 60% , 65%和70%四种不同浓度的乙醇800 mL于1000 mL烧杯中,在相同条件下进行超声强化细胞破碎提取一次,测定DNJ含量,结果见表2。表2不同乙醇浓度与提取率的关系Table 2Rela tion between extraction ra te andd ifferen t concen tra tion of ethanol溶 剂 提取方法 超声时间/min 提取次数 DNJ提取量/ mg·(100 g) - 1 提取率/%50%乙醇 超声破碎提取 20 1 80. 86 62. 260%

27、乙醇 超声破碎提取 20 1 90. 22 69. 465%乙醇 超声破碎提取 20 1 120. 51 92. 770%乙醇 超声破碎提取 20 1 116. 64 89. 5由表2可知, 65%乙醇提取效果最好。2. 5料液比及提取次数的选择取样品100 g四份,加入65%乙醇,按料液比(摩尔比) 14, 16, 18, 110进行超声强化细胞破碎提取两次,每次20 min,结果见表3。表3不同料液比与提取率的关系Table 3Rela tion between extraction ra te andd ifferen tma ter ia l liqu id ra tio料液比/ (

28、g·mL - 1 ) 提取次数 DNJ提取量/ mg·(100 g) - 1 提取率/% 14 1 110.76 85. 2 2 119. 73 92. 1 16 1 117. 39 90.3 2 121. 94 93.8 18 1 120.51 92.7 2 126.49 97.3 110 1 122.98 94.6 2 127.53 98.1 由表3可知,随着料液比的增加,溶解出来的产物也增多。当料液比为1 8 一次提取时, 已有92. 7%的DNJ被提取出来,两次为97. 3% ,但过多的乙醇会给后工序的乙醇回收造成负担。故选用料液比为18 和1 4 各一次提取,这时

29、的提取率为95. 8%。2. 6成品分离及纯度检测取样品100 g于1000 mL 烧杯中,按照上述实验得到的最佳提取条件进行超声强化细胞破碎提取,DNJ得率为124. 54 mg/100 g。将得到的DNJ 提取液上内装阳离子交换树脂的交换柱, 用蒸馏水洗至流出液无色为止。用0. 25 mol/L的氨水洗脱(洗脱速度1 2 mL /min) ,收集洗脱液。将洗脱液用旋转蒸发仪浓缩,正丁醇萃取,回收正丁醇,真空干燥得到成品。经检测纯度为93. 2%。3结论(1)上述实验证明, DNJ 提取的最佳生产条件为: 65%乙醇作为提取剂,按料液比18和14各一次进行超声波提取20 min。提取液通过阳

30、离子交换树脂,以0. 25 mol/L 的氨水洗脱,流速控制在1 2 mL /min,洗脱液经正丁醇萃取,浓缩、干燥后得到成品。(2)DNJ提取率为95. 8% ,得率为124. 54 mg/100 g,纯度可以达到93. 2%。(3)超声强化细胞破碎提取法具有快速、简便、提取温度低、提取率高的优点,不会使桑叶的有效成分破坏。( 4)本方法工艺流程简单、快速、提取率高,适合于工业生产,为桑叶的综合利用及糖尿病的预防和治疗药物的开发奠定了一定的基础。6.1.4 桑叶中1-脱氧野尻霉素的检测、提取及其生理活性研究 DNJ之所以被人们越来越重视，主要由于它具有治疗糖尿病、抑制肿瘤转移、抑制病毒、抗滤

31、过性病原体、高纯度麦芽糖的酶合成、在大鼠体内的代谢、减肥和增加胰岛素敏感性等作用。目前国际市场主要需要的桑叶提取物产品DNJ含量基本都在10以上甚至有些要20以上，而国内生产的桑叶提取物中DNJ的含量大都在5以下，由此可以看出我国在这方面的发展空间还是比较大的。其实在高纯度DNJ产品上同样有较大的发展空间，5mg纯度为95DNJ标准品其市场售价可达1500元人民币,而纯度为99，99同样重量的DNJ产品更能卖到3000元以上，故进行较高纯度桑叶中DNJ分离纯化研究具有相当的经济价值。在干桑叶中的DNJ含量一般为01左右，在桑根部位会略高一些为014。其实，DNJ不仅在桑树不同部位含量有差异，即

32、使是相同部位比如桑叶，不同品种其中的含量差异也是很大的。DNJ的提取：1乙醇浸泡提取法，先用65乙醇浸泡样品粉末20min，然后过虑取滤液，剩下的残渣再用的65乙醇再重复处理一次所得滤液和前一次合并。用旋转蒸发仪蒸发滤液，回收乙醇并将滤液浓缩到小体积。离心后取上清液，并使其通过阳离子交换树脂。先用蒸馏水冲洗直到流出液为无色，然后再用025 molL的氨水洗脱（洗脱速度l2 mlmin)，收集洗脱液。用旋转蒸发仪浓缩洗脱液，再用洗脱液相同体积的正丁醇萃取3次。取正丁醇相弃去水相，真空干燥就可得成品提取率为958，得率为12454 rag100 g，纯度为923以上。2蒸馏水提取法，把桑叶粉碎后放

33、进蒸馏水中进行回流加热，225小时间后过虑取水溶液然后再重复一次合并两次提取液，再利用阳离子交换柱(00lx7型)层析对DNJ进行了初步纯化，收集pH为94105的洗脱液。3微波辅助提取法，把一定量桑叶粉末加入无菌过滤水中其固液比例为1：40(gm1)。在微波炉中加热15min，提取两次。其中微波炉的功率为406W。然后乘热洗涤残渣，浓缩，置于50mL容量瓶中，作为供试品溶液待用，最后得DNJ提取率为0024。4超临界流体萃取法，超临界流体是物质在临界温度和临界压力以上的一种特殊状态，它既不是气体也不是液体而是具有二者双重优点的流体状态。在超临界状态下，超临界流体与待分离的物质接触后，其能有选

34、择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取出来。可作超临界萃取溶剂的物质有很多如：乙烯、乙烷、甲醇、N20和C02等。超临界萃取一般都以C02为溶剂，这主要是由于C02超临界压力约为737MPa，临界温度在3 11左右可以在常温的环境下进行萃取且它无毒无味、化学惰性能够使产品无溶剂残留。而生物碱的超临界萃取一般不用C02，这是由于C02是非极性物质而生物碱尤其是DNJ的极性却很强这就决定着DNJ在C02中的溶解度会很低，所以超临界萃取生物碱一般选用极性较强的N20作为溶剂。为了让超临界萃取法对生物碱的萃取效果更加有效，有时会用上碱化剂和夹带剂等辅助手段。在对生物碱的超临界苯取过程

35、中萃取时间、萃取温度和萃取压力很重要。在短时间的超临界苯取中实际得率值往往高于预计得率值，而在长时间的超临界萃取中实际得率值又往往低于预计得率值，这个原因主要是由于生物碱是结合态和游离态共存的状态。当萃取压力在低水平时，随着萃取压力的升高萃取得率的增速也会相应提高而在萃取压力较高时这种增速就会较为缓和。这是因为在低水平的萃取压力下，压力的小幅度变化对密度影响很大。上述常规方法中数乙醇浸泡提取法比较成熟可行，其他的方法都过于简单对DNJ都只是进行很简单的初步分离而且效率不高很难得到比较纯的DNJ。但乙醇浸泡提取法也有很多不足之处，这种提取方法也只是稍微更叫纯化了些但也很难满足现对DNJ的使用要求

36、。与之相比超临界流体萃取法可能就有些优势了，它不仅操作简单只要加入干粉调好条件即可而且纯度比较高，但是它的缺点是具体条件很难把握比如温度、压力等所以这中方法也不是很成熟，有待进一步研究。目前，DNJ的检测方法很多，但都不能兼顾检测灵敏度和仪器使用的方便性。本实验建立了检测DNJ的柱前衍生化反高效液相紫外检测法，并对检测条件进行研究，结果表明该方法不仅可以精确的检测DNJ的含量而且操作起来也很简单。它既比高效液相-荧光检测器经济又比碘碘化钾方法精确，而且它的准确性、重现性、稳定性都比较好，所以它可以作为一种普遍的定量检测DNJ的方法。研究表明硼酸盐缓冲液pH值对衍生化反应影响最大，影响RP-HP

37、LC检测时的峰型，缓冲液pH值为850时检测效果最好。RPHPLC流动相中乙腈和01醋酸的比为55：45时，分离效果与峰型最好。桑叶和桑根皮中DNJ含量相对较高，但桑树体内中DNJ的含量，因叶位、品种、发育阶段、季节、地理气候等因素的不同而存在很大差异。桑枝皮层中DNJ含量最高，其次为桑叶和桑枝木质部。桑叶品种资源1脱氧野尻霉素含量调查:1材料与方法,11实验原料及其主要试剂桑叶：本次研究共132个桑品种，ll7个品种于2009年8月采自湖北武汉经济作物研究所桑园，15个桑品种于2009年5月和8月采于安徽农科院蚕桑研究所桑园。为了保证每个品种具有可比性，全部桑品种的桑叶采桑枝下部的成熟的3眼

38、叶，每个品种采约500g，烘干后粉碎过60目筛保存。主要试剂：DNJ标准品： 纯度99，Sigma公司;色谱乙腈： 上海凌峰化学试剂有限公司;芴甲氧酰氯(FMOC-C1): 纯度99，扬州宝盛生物化工有限公司,其他化学试剂均为分析纯。12主要仪器设备。高效液相色谱系统： 包括2487双波长检测器、2410折光指数检测器、2996二极管阵列检测器、515反相高效液相色谱泵和Waters授权软件，Waters公司电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂分析天平：精确度000lg，上海奥豪公司HH-2恒温水浴锅：国华电器有限公司JY92-II超声波细胞粉碎机： 宁波新芝生物科技股份有限公司。13桑叶样

39、品处理:新鲜桑叶70。C烘干至恒重，粉碎后过60目筛。称取132种不同品种干燥桑叶粉末各90mg，加入25ml 005molL的盐酸溶液，冰浴中超声波破碎30min(功率400W，工作时间3s，工作间隙7s，工作次数180次)，然后17000×g离心15min(10)，取上清液，把沉淀再重复提取一次，合并两次上清液，加蒸馏水定容至6ml(于10ml刻度离心管中)，该样品提取液4保存备用。然后通过:标准曲线制作、样品衍生化过程、样品的检测和结果与分析:标准曲线的建立,得到不同产地不同品种桑树品种资源的DNJ含量。桑叶中DNJ的提取和纯化方法，1脱氧野尻霉素(DNJ)对葡萄糖苷酶的抑制作

40、用很强，被人们当作糖尿病的克星。随着对它研究越来越深入透彻它也越来越被人们重视，但目前缺乏高纯度的的有效的工业化生产DNJ的方法，以至DNJ现在的市价远远高于毒品的价格。所以，建立一种快速、有效、便宜的分离提取纯化DNJ的方法就非常重要。1脱氧野尻霉素(DNJ)在桑叶中含量很低，目前多篇文章报道对其提取工艺进行优化，但是其在干桑叶中的含量仅仅1多一点，因此，本研究重点考察不同纯化步骤对DNJ纯度和产量的影响，期望为工业化生产高纯度的DNJ建立基础。1材料与方法11试验原料及其主要试剂桑叶：采自XX蚕种场桑园，烘干粉碎后过60目筛制成的干燥桑粉，保存备用。石油醚(分析纯)： 无锡市展望化工试剂有

41、限公司；氨水(分析纯)： 上海中试化工总公司；乙腈(分析纯)： 山东禹王实业有限公司化工分公司；冰醋酸(分分析纯)： 国药集团化学试剂有限公司；芴甲氧酰氯(FMOCC1)： 扬州宝盛生物化工有限公司；甘氨酸： 上海源聚生物科技有限公司；DNJ标准样品： 纯度99，Sigma公司。12主要仪器设备高效液相色谱系统：包括2487双波长检测器、2410折光指数检测器、2996二极管阵列检测器、515反相高效液相色谱泵和Waters授权软件，Waters公司；SHZ-IIID型循环水真空泵： 上海亚荣生化仪器厂；旋转蒸发器RE一52： 上海亚荣生化仪器厂；BTl-200恒流泵： 上海琪特分析仪器有限公

42、司；数控计滴自动部份收集器： 上海沪西分析仪器厂有限公司；GL-20G-II离心机： 上海安亭科学仪器厂；JY92一II超声波细胞粉碎机： 宁波新芝生物科技股份有限公司；真空冷冻干燥机： 北京松源华丰发展科技有限公司。13提取纯化工艺流程图Fig4-1 The flow chart of extracting DNJ in mulberry通过桑叶中DNJ提取溶液的制备、大孔树脂纯化、阳离子交换树脂纯化、硅胶纯化、样品的检测环节具体处理，再通过标准曲线的制备及纯化前样品粗提液的DNJ含量与大孔树脂纯化后DNJ含量、阳离子交换树脂纯化后DNJ含量、硅胶纯化后DNJ含量不同纯化步骤产物检测图谱比较

43、，说明阳离子交换树脂纯化和硅胶纯化后是纯化DNJ有效的步骤。 实验考虑到桑叶中DNJ的含量约01左右，没有进行提取工艺的优化，而重点考察了纯化步骤对DNJ纯度的影响。样品粗提后，纯度为12842，比桑叶中的纯度提高了1252倍，说明乙醇提取和超声波破碎对提取DNJ是有效的方法。利用大孔树脂纯化后，样品DNJ纯度比上一步骤提高260倍，阳离子交换树脂纯化可以进一步提高370倍，两步合计提高样品纯度964倍。硅胶柱纯化后，样品纯度达到19085，比粗提液提高了1486倍。以上不同的纯化步骤各自作用也各不相同，其中：大孔树脂主要去除黄酮类物质、色素等杂质；732型阳离子交换树脂主要去除一些蛋白类杂质

44、；至于硅胶主要是起到去除多糖和桑叶中其他种类的生物碱等杂质的作用。从本次纯化的结果看，产品中DNJ的纯度得到了19085，能够满足作为食品添加剂使用的要求。若需要进一步提高产品的纯度到90以上，反复重复3个纯化步骤，可能达到目的纯度，但考虑到每一步对DNJ都有损失，因此，建议使用制备型HPLC直接进行制备。 实验并用桑叶提取的的DNJ添加到饲料中，调查提取的DNJ对糖尿病小鼠的抑制作用。 结论与展望。1结论：实验建立了一种既不是很昂贵而灵敏度又高的检测DNJ的方法一一反相高效液相紫外线检测法，并用该方法对132不同品种和5个不同叶位的干桑叶粉中DNJ含量进行了检测；另外还使用了乙醇浸泡、超声波

45、破碎及过大孔树脂、阳离子交换树脂和硅胶柱等方法从桑叶中分离提取纯化DNJ；最后用本实验室提纯的含DNJ的桑叶提取物喂养高血糖模型小鼠和健康小鼠，来考察DNJ对糖尿病的抑制作用。主要的研究结果如下：(1) 建立的检测方法其最佳条件是：硼酸盐缓冲液pH值为850，流动相(乙腈和01醋酸混合液)配比为55：45，此条件下峰的分离效果和峰型最佳。(2)检测132种样品和5个不同时位的中DNJ含量所得标准曲线方程为：Y=10×108x+15328，回归系数为：R2=O994，线性性显著；132种样品中DNJ含量平均值为007511，标准差为0028428，其中竹场2号的DNJ含量最高，为014

46、72；观音桑的DNJ含量最低，为001 34。5个不同叶位桑叶的DNJ含量不同，随着桑叶随着发育成熟，DNJ的含量逐渐降低。(3) 可以得出在乙醇浸泡和超声波处理后所得桑叶提取物中DNJ含量为12842；在用大孔树脂去杂纯化后DNJ含量达到33452，提高了260倍；用732阳离子交换树脂进一步纯化，选取pH值在9。5011。0之间的洗脱液干燥后提取物中DNJ的含量又提高了37倍可达123873，最后用60100目硅胶纯化并用不同比例的石油醚甲醇混合液进行梯度洗脱最终可将干燥提取中DNJ含量提高到l 90857。(4) 食用低剂量DNJ(20mgkg)的糖尿病小鼠(DLD)和食用中剂量DNJ(

47、30mgkg)的糖尿病小鼠(DMD)血糖降低效果不显著；食用高剂量DNJ(40mgkg)的糖尿病小鼠(DHD)和食用中剂量阿卡波糖(30mgkg)的糖尿病小鼠(DA)在第33天和第40天血糖效果的效果已经显著且DHD效果是高于DA的；与空白对照组比较发现DNJ对健康小鼠的血糖没有负面影响。2展望蚕桑起源于我国，目前桑叶主要作为养蚕的饲料，桑叶含有的DNJ等功能成分具有非常重要的生理功能，因此，开发桑叶的食用价值和药用价值非常具有意义。DNJ已经被证明有很多活性比如：可以抑制葡萄糖苷酶、葡萄糖淀粉酶和肿瘤转移，还可以抗病毒、减肥和增加胰岛素敏感性的等，相信它一定还有更多有重大意义的作用。所以还有

48、以下的研究方向值得我们去注意：(1)研究一种不需要昂贵设备比如制备型高效液相设备，而又能将DNJ的纯度提高到90以上的方法。(2) 研究DNJ在抗衰老方面的生理活性，从而为延长人类寿命的事业做贡献。(3) 研究DNJ促进肿瘤细胞凋亡的作用，以此来和人类的大敌癌症相抗争。(4) 研究DNJ对血脂的的降低作用，看是否可以用来治疗心血管疾病。6.1.5 1脱氧野尻霉素合成路线的工艺优化 现在研究表明，1-脱氧野尻霉素（DNJ）属于强效-葡萄糖苷酶抑制剂，DNJ通过对二糖类分解酶活性产生抑制作用，从而抑制小肠对双糖的吸收，降低食后血糖的高峰值。DNJ吸收优于阿卡波糖；抑制人体糖分的转化，降低空腹血糖和

49、餐后血糖水平优于磺脲类药物而发生低血糖和其它副作用的可能性大大低于其它药物，安全性好，可不改变饮食结构。脱氧野尻霉素是目前糖尿病治疗市场上唯一的国际公认的零伤害生物制剂。 德国Bayer公司以1-脱氧野尻霉素为模板开发出第一个亚氨基糖类药物：N-羟乙基-1-脱氧野尻霉素（米格列醇），用于非胰岛素依赖型（II型）糖尿病，减少复合糖消化率，从而控制餐后葡萄糖吸收、防止血糖升高、米格列醇与1998年7月率先在德国获准，而后又在美国和欧盟各国、日本等注册或上市，我国有进口，并已有仿制产品获准上市。英国牛津大学和Oxford Glycoscience 公司在1-脱氧野尻霉素的基础上合成了N-丁基-1-脱

50、氧野尻霉素（米格鲁特）。它是一种糖类转移酶抑制剂，口服有效，2003年3月率先在英国获准，用于治疗糖脂储存疾病（如不宜以酶替代法治疗的轻到中度I型高雪病）。其作用机理在于通过抑制参与鞘磷脂糖基化的一种酶，减少可能引起高雪病的神经组织细胞内糖脂过度储存。它在美国和欧盟多国上市或注册。另外将其用于尼曼-匹克氏症、戴萨克斯症处于III期临床，用于菲比氏病则处于II期临床试验阶段。本研究以甲基-D-吡喃葡糖苷(methyl -D-glucopyrauoside)为起始反应原料，设计了一条合成1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)的工艺路线，然后根据这条工艺路线，以适应工业化大

51、生产为标准，对其进行了优化，并在实验室条件下进行小试实验对优化工艺的可行性进行验证。而后，在实验室小试实验取得成功的基础上，对该优化工艺进行了中试放大试验，探索其工业化生产的可行性，结果如下：1、 通过调研文献，研究反应，设计了一条合成1脱氧野尻霉素的工艺路线。这条工艺路线以甲基-D-吡喃葡糖苷为起始反应原料，经过苄基保护，脱甲基反应，开环形成双醇，通过Pfitzaer-Moffatt氧化反应形成双羰基后再进行醛酮还原胺化反应关环，脱苄基保护等五步反应最后制得目标产物。然后通过实验室小试来对该设计路线的可行性进行实验验证，并取得了成功。小试投料776g，经过五步反应，最后得到679g目标产物D

52、NJ，总收率为294，各步收率分别为75，65，985，72和85。2、 通过实验室小试实验，验证了该反应路线的可行性之后，本研究以能够进行工业化生产为标准对该条路线进行了工艺优化。优化内容有：验证了工艺中第一步反应生成的苄基醚副产对于第二步的反应没有影响，因而可以简化反应的后处理步骤；优化了原工艺中第二，四，五步反应的溶剂体系；将原工艺里的催化剂LiAlH4，改变为NaBH4；将原工艺里第五步反应在工业化生产中操作比较困难的使用液氨和金属锂的反应条件，改变为使用Pd(OH)2和H2进行脱苄基保护。然后对优化后的工艺路线可行性进行了实验室小试验证，并取得了成功。小试投料195g，经过五步反应，

53、最后得到74g目标产物DNJ，总收率为798，各步收率分别为65，52，902，35和748。3、 根据优化后的工艺路线进行了两批中试放大试验，进一步验证该优化路线的工业化生产可行性。两批中试试验均投料20kg，经过反应，分别得到目标产物067kg和163kg，总收率分别为803和795，平均收率为799，与实验室小试收率相似。同时，两批中试试验所得到的产品能够达到100的纯度，验证了优化工艺的可行性与稳定性。通过两批中试放大试验的结果可以看出，这条优化后的工艺，实验设计合理，反应条件适合，具备工业化生产的条件。程凤银【14】报道称桑叶中抗糖尿病活性成分主要是桑叶多糖(TPM)、总生物碱以及总黄酮，这三类活性成分可通过抑制一糖苷酶活性、促进胰岛素释放、促进外周组织对糖的利用、增加糖尿病动物肝糖原含量而起到降血糖作用，且桑叶总黄酮可阻断蛋白非酶糖化，对减缓或阻止糖尿病并发症发展具有重要意义。 自从哌啶烷类多羟基生物碱被发现以后，由于其与吡喃糖极其相似的结构，使人们对多羟基生物碱的生理活性产生了浓厚的兴趣。研究发现大部分的多羟基生物碱都可以有效的抑制糖苷酶和糖基转移酶，与此相关的疾病有癌症、糖尿病、艾滋病(H)等。人们通过研究多羟基生物碱中的相关机理，发现一些新药来治疗这些严重危害人类健康的疾病